肖芳莉，李國(guó)超，馬騰飛，黃姍姍，徐文華，王烈成，王元銀

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大鼠牙髓神經(jīng)胞體在三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)分布特點(diǎn)

肖芳莉1，李國(guó)超1，馬騰飛1，黃姍姍1，徐文華1，王烈成2，王元銀1

目的 了解正常及三叉神經(jīng)痛(TN)模型大鼠的牙髓神經(jīng)胞體在三叉神經(jīng)節(jié)(TG)內(nèi)分布情況及其投射關(guān)系，為臨床通過TG治療TN提供解剖學(xué)依據(jù)。方法 本實(shí)驗(yàn)分為模型組和假手術(shù)組，在兩組大鼠不同牙髓腔內(nèi)注入逆行熒光探針，用熒光顯微鏡觀察TG中熒光標(biāo)記神經(jīng)元的分布情況。結(jié)果 兩組大鼠分別在右下及左上中切牙髓腔內(nèi)注入綠色熒光探針Fast DiO 72 h后，分別在右側(cè)TG后外側(cè)區(qū)、左側(cè)TG中段區(qū)觀察到數(shù)個(gè)、成簇分布帶有綠色熒光標(biāo)記神經(jīng)元；將兩組大鼠右下及左上中切牙髓腔內(nèi)分別注入Fast DiO、Fast DiI兩種熒光探針，72 h后在其同側(cè)TG的后外側(cè)區(qū)和中間區(qū)分別觀察到成簇分布的帶有綠色和紅色熒光的神經(jīng)元；兩組大鼠左側(cè)上中切牙及下頜第一磨牙髓腔內(nèi)分別注入熒光探針Fast DiI和Fast DiO，72 h后在同側(cè)TG的后外側(cè)區(qū)和中段區(qū)分別觀察到成簇分布帶有綠色和紅色熒光的神經(jīng)元。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，兩組之間相應(yīng)牙髓神經(jīng)胞體在TG內(nèi)分布區(qū)域、數(shù)量及熒光強(qiáng)度沒有明顯區(qū)別。結(jié)論 三叉神經(jīng)上、下頜支神經(jīng)胞體投射于同側(cè)TG，并有一定區(qū)域性；TN產(chǎn)生不改變TG內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量及投射聯(lián)系，其可能與三叉神經(jīng)功能活動(dòng)改變有關(guān)。

三叉神經(jīng)節(jié)；三叉神經(jīng)痛；逆行熒光標(biāo)記；神經(jīng)束路追蹤法

三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia,TN)是指三叉神經(jīng)分布區(qū)域陣發(fā)性劇烈疼痛，其發(fā)病機(jī)制及診治國(guó)內(nèi)外學(xué)者仍在探索中，是神經(jīng)系統(tǒng)一大頑疾。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前普遍采用神經(jīng)束路追蹤法來研究其內(nèi)在聯(lián)系及機(jī)制。關(guān)于三叉神經(jīng)各分支胞體在三叉神經(jīng)節(jié)(trigeminal ganglia,TG)內(nèi)投射，早在1978年，Charles et al[1]對(duì)貓采用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)追蹤法，角膜注射于TG內(nèi)側(cè)發(fā)現(xiàn)被標(biāo)記細(xì)胞。1981年，Marfurt[2]也成功用HRP追蹤法發(fā)現(xiàn)貓三叉神經(jīng)各分支在TG內(nèi)對(duì)應(yīng)區(qū)域，國(guó)內(nèi)也有學(xué)者采用此法對(duì)家兔三叉神經(jīng)進(jìn)行了逆向追蹤[3]。然而不同動(dòng)物、相同部位神經(jīng)元分布可能存在種屬差異。該研究通過神經(jīng)元逆行熒光標(biāo)記法對(duì)假手術(shù)組及模型組大鼠不同牙髓注入熒光探針，隨后分析TG中標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量及分布，來了解各分支神經(jīng)胞體在TG內(nèi)投射情況，進(jìn)而探討三叉神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)傳導(dǎo)及相互關(guān)系，為臨床治療提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級(jí)健康成年雄性 SD大鼠60只，150～250 g(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，預(yù)先毛刷刺激訓(xùn)練，形成適應(yīng)性；親脂性染料：Fast DiI(D-3899，激發(fā)波長(zhǎng) 568 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 564 nm)、Fast DiO(D-3898，激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 499 nm)，熒光探針(美國(guó)Sigma公司)；避光 4 ℃保存，實(shí)驗(yàn)前用生理鹽水配置成濃度為 5 mg/ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TN模型制備 通過眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)方法制備動(dòng)物模型40只，造模2周后行TN誘發(fā)實(shí)驗(yàn)，采用Vos et al[4]動(dòng)物行為學(xué)反應(yīng)積分系統(tǒng)評(píng)價(jià)，篩選20只。

1.2.2 假手術(shù)組動(dòng)物制備 手術(shù)方法與模型組相同，暴露眶下神經(jīng)，但對(duì)其不予結(jié)扎，再分層縫合，準(zhǔn)備20只。

1.2.3 熒光探針注射 模型組與假手術(shù)期大鼠均分4組，分別采取4種部位注射。第一組熒光探針(Fast DiO)注射于右側(cè)下中切牙；第二組熒光探針(Fast DiO)注射于左側(cè)上中切牙；第三組熒光探針雙標(biāo)記右側(cè)下中切牙(Fast DiO)及左側(cè)上中切牙(Fast DiI)；第四組熒光探針雙標(biāo)記左側(cè)上中切牙(Fast DiI)及左側(cè)下頜第一磨牙(Fast DiO)；均在麻醉狀態(tài)下采用微量注射器于髓腔內(nèi)緩慢注入熒光探針2 μl。

1.2.4 TG標(biāo)本制備 大鼠熒光探針注入標(biāo)記72 h，心臟灌注處死、固定，斷頭，取TG，4%多聚甲醛固定至少2 h。

1.2.5 熒光檢測(cè) 取TG包埋固定，置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察并拍照，分析并記錄熒光分布、數(shù)量及強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 Leica圖像處理軟件對(duì)熒光強(qiáng)度行半定量測(cè)量分析，取平均值；采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間取單因素方差分析，后行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 模型組鑒定 40只行眶下神經(jīng)慢性縮窄環(huán)手術(shù)大鼠中，32只造模成功，成功率達(dá)80%，隨機(jī)篩選20只。

2.2 假手術(shù)組熒光標(biāo)記神經(jīng)元在TG內(nèi)分布

2.2.1 右側(cè)下中切牙牙髓熒光標(biāo)記神經(jīng)元在TG內(nèi)分布 熒光探針Fast DiO 標(biāo)記72 h后，于其右側(cè)TG局部區(qū)域檢測(cè)到綠色標(biāo)記神經(jīng)元(圖1A)，經(jīng)明視野(可見光)鑒定，該神經(jīng)元位于TG后外側(cè)區(qū)域(圖1B)，成簇聚集，數(shù)量約3～5個(gè)。左側(cè)TG未檢測(cè)到標(biāo)記神經(jīng)元(圖1C)。

圖1 右側(cè)下中切牙牙髓熒光標(biāo)記神經(jīng)元TG內(nèi)分布

A：右側(cè)TG后外側(cè)區(qū)域見標(biāo)記神經(jīng)元(綠色)；B：TG后外側(cè)區(qū)域可見光檢測(cè)；C：左側(cè)TG后外側(cè)區(qū)域熒光檢測(cè)

2.2.2 左側(cè)上中切牙牙髓熒光標(biāo)記神經(jīng)元在TG內(nèi)分布 熒光探針Fast DiO 標(biāo)記72 h后，于其左側(cè)TG檢測(cè)到綠色標(biāo)記神經(jīng)元(圖2A)，經(jīng)明視野鑒定位于TG中段區(qū)域(圖2B)，成簇局限分布。右側(cè)TG未檢測(cè)到標(biāo)記神經(jīng)元(圖2C)。

2.2.3 右側(cè)下中切牙及左側(cè)上中切牙牙髓熒光標(biāo)記神經(jīng)元在TG內(nèi)分布 分別對(duì)右下及左上中切牙髓腔內(nèi)分別注入Fast DiO(綠色)、Fast DiI(紅色)兩種熒光探針，標(biāo)記72 h，于右側(cè)TG后外側(cè)區(qū)域檢測(cè)到綠色熒光標(biāo)記神經(jīng)元(圖3A)，于左側(cè)TG中段區(qū)檢測(cè)到紅色熒光標(biāo)記神經(jīng)元(圖3C)，均呈局限性分布，其它區(qū)域無(wú)。

2.2.4 左側(cè)上中切牙和左側(cè)下第一磨牙牙髓熒光標(biāo)記神經(jīng)元在TG內(nèi)分布 左側(cè)上中切牙及下頜第一磨牙髓腔內(nèi)分別注入熒光探針Fast DiI(紅色)和Fast DiO(綠色)，72 h后于左側(cè)TG后外側(cè)區(qū)域檢測(cè)到綠色標(biāo)記神經(jīng)元(圖4A)，左側(cè)TG中段區(qū)域檢測(cè)紅色標(biāo)記神經(jīng)元(圖4C)，均呈局限性分布，其它區(qū)域無(wú)。

圖2 左側(cè)上中切牙牙髓熒光標(biāo)記神經(jīng)元TG分布

A：左側(cè)TG中段區(qū)域標(biāo)記神經(jīng)元(綠色)；B：TG中段區(qū)域可見光檢測(cè)；C：右側(cè)TG中段區(qū)域熒光檢測(cè)

圖3 右側(cè)下中切牙及左側(cè)上中切牙雙標(biāo)記牙髓神經(jīng)元TG分布

A：右側(cè)TG后外側(cè)區(qū)熒光標(biāo)記神經(jīng)元(綠色)；B：右側(cè)TG后外側(cè)可見光檢測(cè)；C：左側(cè)TG中段區(qū)熒光標(biāo)記神經(jīng)元(紅色)；D：左側(cè)TG中段可見光檢測(cè)

2.3 模型組牙髓熒光標(biāo)記神經(jīng)元在TG內(nèi)分布 與假手術(shù)組對(duì)比，模型組標(biāo)記神經(jīng)元在TG投射區(qū)域基本相似，所觀察到標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量差別不大，組間熒光強(qiáng)度經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

圖4 左側(cè)上中切牙和左側(cè)下頜第一磨牙牙髓熒光標(biāo)記神經(jīng)元TG分布

A：左側(cè)TG后外側(cè)區(qū)熒光標(biāo)記神經(jīng)元(綠色)；B：左側(cè)TG后外區(qū)可見光檢測(cè)；C：左側(cè)TG中段區(qū)熒光標(biāo)記神經(jīng)元(紅色)；D：左側(cè)TG中段區(qū)可見光檢測(cè)

表1 假手術(shù)組與模型組TG 4組熒光標(biāo)記神經(jīng)元平均熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)(n=5)

3 討論

TN疼痛劇烈，嚴(yán)重影響到患者生活，對(duì)于其病因有多種觀點(diǎn)，其中以中樞神經(jīng)病變學(xué)說和周圍神經(jīng)病變學(xué)說被大家廣泛接受。早期Duhner et al[5]認(rèn)為TN系中樞異常導(dǎo)致，如脊束核癲癇樣放電。然而，TN發(fā)作范圍常為單側(cè)甚至局限于某一支，以及很多患者病情與腦干內(nèi)病變并無(wú)相關(guān)性，這些現(xiàn)象無(wú)法用中樞病變學(xué)說解釋。周圍神經(jīng)病變學(xué)說則認(rèn)為TN由三叉神經(jīng)根受壓迫致神經(jīng)脫髓鞘病變導(dǎo)致，目前廣大學(xué)者也認(rèn)同這一點(diǎn)，臨床結(jié)果也證實(shí)80%～90%TN系血管壓迫導(dǎo)致，血管減壓術(shù)的成功也證實(shí)這一點(diǎn)[6]。但臨床病例也存在很多用神經(jīng)壓迫學(xué)說無(wú)法解釋的。故而有研究者開始將研究方向轉(zhuǎn)向病毒感染方面[7]，也有研究者認(rèn)為一些神經(jīng)介質(zhì)、神經(jīng)肽類物質(zhì)參與TN發(fā)作[8-9]。

正因TN病因不明，以及三叉神經(jīng)系統(tǒng)及其病理生理機(jī)制復(fù)雜，所以治療存在很多缺陷。其中針對(duì)TG水平的療法，如射頻溫控?zé)崮g(shù)、放療等，治療有效率達(dá)82.8%～96.3%，但是均會(huì)帶來過度感覺喪失[10]，因此本文采用神經(jīng)元逆行熒光標(biāo)記法來研究TG內(nèi)神經(jīng)元分布與分支(牙髓)對(duì)應(yīng)關(guān)系，以及隨TN病變發(fā)生是否存在改變，來為臨床治療提供更詳細(xì)依據(jù)。

逆行熒光素標(biāo)記法是指將熒光物質(zhì)注入神經(jīng)元末稍區(qū)域，熒光素被末稍神經(jīng)攝取，后經(jīng)軸漿運(yùn)輸至胞體內(nèi)。此法是一種追蹤神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的方法，敏感度高、簡(jiǎn)便，即可作雙標(biāo)記又可做三標(biāo)記，是目前研究神經(jīng)側(cè)支投射、神經(jīng)核團(tuán)定位聯(lián)系及神經(jīng)元化學(xué)通路的理想工具之一。在神經(jīng)束路追蹤法研究中，以HRP法應(yīng)用最為廣泛，其能較靈敏、準(zhǔn)確地反映出追蹤細(xì)胞的定位。Charles et al[1]于1978年開始用HRP追蹤法對(duì)TG投射定位進(jìn)行研究。隨后國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始采用此法來了解三叉神經(jīng)各分支在TG內(nèi)投射，發(fā)現(xiàn)存在一定規(guī)律，其上、下頜支分布區(qū)與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似[2,11-12]。國(guó)內(nèi)學(xué)者柴盈 等[12]甚至采用HRP結(jié)合3D重建技術(shù)更直觀地再現(xiàn)了下頜神經(jīng)在TG后外側(cè)的分布。然而HRP顯色方法復(fù)雜，又參與細(xì)胞代謝不能長(zhǎng)期存留，并易擴(kuò)散到鄰近組織造成神經(jīng)元誤染。與之相比，熒光探針法不需染色，同時(shí)因熒光多樣性，可對(duì)神經(jīng)各分支行多重標(biāo)記。譚波濤 等[13]發(fā)現(xiàn)Fast DiI可針對(duì)一些內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。

本研究選擇的熒光探針是Fast DiO、Fast DiI，均是親脂性羰花青細(xì)胞膜熒光探針，能對(duì)細(xì)胞膜染色，著色穩(wěn)定性高。注射后72 h取材，既保證染料能達(dá)TG區(qū)神經(jīng)元，又保證探針不因代謝而使強(qiáng)度降低影響觀察。本實(shí)驗(yàn)做熒光強(qiáng)度測(cè)量和分析時(shí)，因影響熒光強(qiáng)度因素很多，為形成一定標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)采取目標(biāo)區(qū)域內(nèi)平均熒光強(qiáng)度值與背景熒光值之差，做為目標(biāo)區(qū)域內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度值。

本實(shí)驗(yàn)中用Fast DiO、Fast DiI分別對(duì)右側(cè)下中切牙、左側(cè)上中切牙髓腔行注射。結(jié)果在對(duì)應(yīng)同側(cè)TG后外側(cè)、中段區(qū)觀察到熒光標(biāo)記?？紤]為右下、左上中切牙髓腔分別注入熒光素 Fast DiO、Fast DiI，經(jīng)軸漿逆行運(yùn)輸?shù)酵瑐?cè)TG后外側(cè)、中間區(qū)。由此推測(cè)，三叉神經(jīng)上、下頜支神經(jīng)元分別投射于同側(cè)TG后外側(cè)、中間區(qū)。因此三叉神經(jīng)各分支神經(jīng)元在TG中投射有特定區(qū)域，為TN治療(如TG射頻溫控?zé)崮g(shù)位點(diǎn)和范圍)提供一定參考。本研究結(jié)果與相關(guān)研究[2,14]結(jié)果基本相符，與三叉神經(jīng)各分支受特定神經(jīng)元支配預(yù)測(cè)大致符合。相關(guān)研究者在貓、兔等動(dòng)物研究中提出神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元分布說法，本研究于大鼠實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。但是對(duì)于TN病因研究仍是下一步研究方向。

通過神經(jīng)元逆行熒光標(biāo)記法，發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)上、下頜支神經(jīng)元投射于同側(cè)TG特定區(qū)域，且TN產(chǎn)生后并不影響TG內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量及投射關(guān)系，其產(chǎn)生可能與三叉神經(jīng)元功能活動(dòng)改變有關(guān)，如異常興奮。這些TN治療提供重要指導(dǎo)意義。接下來可通過研究TN病理生理機(jī)制，進(jìn)一步探索病因及更佳治療方法。

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Xiao Fangli, Li Guochao, Ma Tengfei, et al

The neuronal soma trait of trigeminal nerve branch projecting to dental pulp in rat trigeminal ganglia

(College of Stomatology,Anhui Medical University, The Affiliated Stomatological Hospital ofAnhuiMedicalUniversity,KeyLabofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince，Hefei230032)

Objective To observe the position relationship of neuronal somas in trigeminal ganglia(TG), which projects from different dental pulps in the normal and trigeminal neuralgia(TN) model rats, and provides anatomical theoretical guidance for the clinical treatment of TN. Methods Those experiments were divided into model group and control group. The retrograde fluorescent probes were injected into the different dental pulp cavities of rats in the two groups, and fluorescent microscope was used to observe distribution of fluorescence labeled neurons in TG. Results Green fluorescent probes Fast DiO were injected into right lower and left upper central incisor of rats in the two groups respectively, a few fluorescence labeled neuronal somas after 72 h could be detected in the posterolateral and the middle area of the ipsilateral TG, which distributed in clusters. Two different fluorescent probes Fast DiO and Fast DiI were injected respectively into right lower and left upper central incisor of rats in the two groups, green fluorescence labeled neuronal somas and red fluorescence labeled neuronal somas in cluster could be detected after 72 h in the posterolateral and the middle area of the ipsilateral TG of the two groups correspondingly. Fast DiI and Fast DiO were injected respectively into left upper central incisor and first molar in lower mandibular of rats in the two groups at the same time, green fluorescence labeled neuronal somas and red fluorescence labeled neuronal somas in cluster could be detected after 72 h in the middle area and the postermiddle area of left TG correspondingly. There was no statistically significant difference of labeled neuronal somas distribution, quantity and fluorescence intensity in TG between the two groups. Conclusion The neuronal somas of trigeminal nerve branches regional distributions on the ipsilateral side TG. The TN does not affect the number of neurons in TG and the projection. It may be associated with the change of trigeminal nerve function.

trigeminal ganglia; trigeminal neuralgia; retrograde fluorescent tags; nerve bundle road tracking method

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.030.html

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81271162)；安徽省自然科學(xué)基金(編號(hào):11040606M204)；安徽省高等學(xué)校省級(jí)優(yōu)秀青年人才基金(編號(hào)：2012SQRL070)

1安徽醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實(shí)驗(yàn)室,合肥230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，合肥 230032

肖芳莉，女，碩士研究生；

王元銀，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:wyy1970548@sohu.com

R 745.11

A

1000-1492(2016)01-0064-05

2015-10-20接收