石正松,李 強(qiáng),寧寅寬,蔡偉良,李詩鵬

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Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對兔股骨頭壞死修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究

石正松,李 強(qiáng),寧寅寬,蔡偉良,李詩鵬

目的 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、電鏡掃描(SEM)和X射線能譜分析技術(shù)(EDS)評價腺病毒-骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/脫鈣松質(zhì)骨(Ad-BMP-2/BMSCs/DBM)對兔股骨頭壞死的治療效果，為臨床治療股骨頭壞死探索新途徑。方法 ① 采用髓芯減壓聯(lián)合液氮冰凍法制備兔股骨頭壞死模型；② 將造模成功的兔子隨機(jī)均等分為A、B、C、D組(n=12)，A組不植入材料，為造模組，B、C、D分別植入DBM、DBM/BMSCs、BMP-2/BMSCs/DBM；③ 術(shù)后4、8、12 周各組分別處死4只兔子，運(yùn)用RT-PCR、SEM、EDS檢測股骨頭BMP-2表達(dá)量、表面形貌和鈣磷比(Ca/P)，觀察股骨頭的修復(fù)情況。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示各時間點(diǎn)BMP-2表達(dá)量A組

股骨頭壞死；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；RT-PCR；電鏡掃描；能譜分析

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)確切病因不明，目前公認(rèn)的致病因素有13種[1]，是在不同病因下股骨頭血液供應(yīng)障礙,引起軟骨下骨變性、壞死,繼而造成股骨頭塌陷,最終引發(fā)髖關(guān)節(jié)退行性、破壞性改變的一種疾病。有文獻(xiàn)[2]表明ONFH已經(jīng)替代了髖關(guān)節(jié)結(jié)核，躍居髖關(guān)節(jié)疾病首位[3]，并且ONFH有了年輕化趨勢。目前對于ONFH的治療方法有多種，例如中醫(yī)療法、體外微波沖擊治療、髓芯減壓[4]、髖關(guān)節(jié)置換等[5]，但是這些均不是理想而合理的治療方法，探尋更為有效的治療手段勢在必行。骨組織工程的發(fā)展在治療ONFH方面展現(xiàn)了良好的前景，并逐漸成為研究熱點(diǎn)。種子細(xì)胞、支架材料、細(xì)胞調(diào)控因子是骨組織工程學(xué)的3個基本要素。但是究竟采用何種種子細(xì)胞最好，選取哪種支架材料為宜，如何解決細(xì)胞調(diào)控因子持續(xù)表達(dá)的問題，國內(nèi)外尚無定論[6]。該實(shí)驗(yàn)通過腺病毒介導(dǎo)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein，BMP-2)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)復(fù)合脫鈣松質(zhì)骨(demineralized bone matrix，DBM)的方式構(gòu)建組織工程骨,將其植入兔ONFH模型,旨在探討其對ONFH的修復(fù)能力,為將來骨組織工程的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 組織工程骨(hBMP-2/BMSCs/DBM) 本課題組經(jīng)過前期研究，已利用腺病毒介導(dǎo)hBMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合DBM的方式成功構(gòu)建了組織工程骨[7]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大白兔48只，雌雄不拘，約3.2 kg，清潔級，購于桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，對動物的處理符合倫理學(xué)精神。

1.1.3 主要試劑和器材 水合氯醛(天津大茂化學(xué)試劑廠)；凝膠海綿(江西祥恩醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)；注射用青霉素鈉(華北制藥公司)；總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；M-MLV First Strand Kit試劑盒(上海滬峰生物科技有限公司)；DNA Marker(北京天根生化科技有限公司)；2×Taq Mastermix(大連寶生物工程有限公司)；多聚甲醛(北京索萊寶科技有限公司)；場發(fā)射掃描電鏡(荷蘭Philips公司)；X射線能譜分析儀(英國Oxford公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模 實(shí)驗(yàn)動物均右側(cè)參與實(shí)驗(yàn)，參照李海冰 等[8]髓芯減壓術(shù)聯(lián)合液氮冰凍的操作步驟，實(shí)驗(yàn)動物取俯臥位，10%水合氯醛水溶液耳緣靜脈注射(3 ml/kg)麻醉。由臀大肌與闊筋膜張肌的間隙進(jìn)入，暴露臀小肌及髓關(guān)節(jié)外旋肌群，并貼骨面將其切斷，暴露關(guān)節(jié)囊以后小十字口切開，外旋股骨頭，使股骨頭暴露而不使其脫位，在骨與軟骨的交界處用直徑為3.5 mm的無菌鉆頭，向股骨頭方向打孔，深度為4 mm，用小刮匙刮除股骨頭內(nèi)骨質(zhì)，造成約50%的缺損，然后用液氮持續(xù)冷凍股骨頭，約5 min。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組并植入材料 動物術(shù)畢后行影像學(xué)檢測，確認(rèn)造模成功后隨機(jī)分為A、B、C、D 組，每組12只。A組為造模組，不做處理，復(fù)溫后立即逐層關(guān)閉切口；B、C、D組動物在造模復(fù)溫后沿向鉆孔內(nèi)分別填塞體積為3 mm×3 mm×3 mm大小的DBM、DBM/BMSCs、hBMP-2/BMSCs/DBM，醫(yī)用凝膠海綿封閉隧道口，逐層關(guān)閉切口；術(shù)后各組動物臀大肌注射青霉素鈉預(yù)防感染(每只兔40萬U/d，連續(xù)3 d)。

1.2.3 RT-PCR法檢測骨股頭BMP-2基因表達(dá) 4、8、12 周各組分別處死4只兔子，取出股骨，清除表面組織，沿基底部將股骨頭鋸掉后矢狀剖開，取部分股骨頭樣品放入研缽，加入液氮，研磨成粉末后加入1.5 ml EP管,按照總RNA提取試劑盒(離心柱型)操作步驟操作，并通過凝膠電泳行質(zhì)量檢測，使用分光光度計進(jìn)行純度濃度測定，計算出RT-PCR反應(yīng)體系(20 μl體系)中所需1 μg RNA所需的體積量。使用PCR儀與M-MLV First Strand Kit試劑盒合成cDNA。根據(jù)BMP-2的基因序列利用primer 5.0合成引物，F(xiàn)P:5′-ACTACCAGAAACGAGTGGGAA -3′，RP：5′-GCATCTGTTCGGAAAACCT-3′；GAFDH的FP:5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAAC-3′，RP：5′-G TGGTTCACACCCATCACAA-3′,然后使用PCR儀與2×Taq PCR MasterMix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94 ℃ 2 min，(94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)×30個循環(huán)，72 ℃ 2 min。擴(kuò)增完畢后，2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物(U：140 V；I:175 mA；T：30 min)，凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析其表達(dá)量,以目的/內(nèi)參來分析各組的基因表達(dá)情況。

1.2.4 微觀形貌觀察與能譜分析 取4、8、12 周的4組標(biāo)本和一塊正常兔股骨頭標(biāo)本，每個標(biāo)本剖面隨機(jī)挖取3塊1.0 mm×1.0 mm×0.5 mm的樣本，浸入雙蒸水震蕩30 min，共3次；4%多聚甲醛固定15 min；25%、50%、75%、95%、100%乙醇溶液各脫水15 min，自然晾干；真空鍍膜儀噴金處理；置入Quanta 200 FEG場發(fā)射環(huán)境掃描電鏡和X-射線能譜儀，電鏡觀察樣品表面微觀形貌，X線能譜分析儀(energy dispersive spectrometer，EDS)測定微區(qū)主要元素(碳、氮、氧、鈣、硫、磷)的重量百分比和原子百分比百分含量，重復(fù)3次，然后計算鈣磷比(Ca/P)。

2 結(jié)果

2.1 BMP-2表達(dá)情況 凝膠成像分析系統(tǒng)顯示：DNA Marker大小為100～600 bp，GAPDH大小為221 bp，目的條帶(BMP-2)大小為180 bp。各組標(biāo)本在各時間點(diǎn)均有BMP-2基因的表達(dá)，見圖1。凝膠成像系統(tǒng)輝度分析顯示：術(shù)后4 、8 、12周，A、B、C、D組內(nèi)BMP-2表達(dá)量依次遞增；術(shù)后各時間點(diǎn)A、B、C、D組之間的BMP-2表達(dá)量為A組

表1 各時間點(diǎn)各組BMP-2基因表達(dá)量(目的/內(nèi)參，

2.2 SEM與EDS 電鏡下正常骨組織板層結(jié)構(gòu)致密、完整、排列方向一致，鈣化良好，表面光滑，板層之間纖維成交交錯，未見骨板斷裂、扭曲等現(xiàn)象，見圖2a。4周時，A組骨板裂痕仍然清晰，出現(xiàn)纖維增生；8周時見骨小梁變細(xì)，部分?jǐn)嗔眩w維增生較前增加，欠規(guī)則，未見鈣化顆粒；12周時見大量扭曲纖維增生充滿視野，表面未見鈣化物，骨小梁大部分消失，無明顯新生成骨表現(xiàn)，見圖2b。B、C兩組在4 ～8周時可見骨小梁變細(xì)，但未出現(xiàn)大量斷裂現(xiàn)象，骨小梁表面出現(xiàn)“云翳狀覆蓋物”，覆蓋物表面出現(xiàn)鈣化顆粒沉積；12周時可見纖維表面鈣化顆粒進(jìn)一步增多，部分鈣化顆粒堆積成團(tuán)塊，附著于骨小梁上，但是新生骨小梁形態(tài)欠佳，新生骨板結(jié)構(gòu)不整，仍不成熟，如圖2c、2d。D組在4周時出現(xiàn)大量新生膠原纖維，形態(tài)規(guī)則，方向一致，表面可見顆粒性鈣化物，出現(xiàn)低鈣化類骨質(zhì)；8周時鈣化物電子密度進(jìn)一步增大，低密度類骨質(zhì)逐漸融合成粗大骨小梁，骨小梁表面細(xì)胞漸豐富；12周時新生骨繼續(xù)改建，新生骨板致密、規(guī)則，骨小梁結(jié)構(gòu)趨向正常，并出現(xiàn)規(guī)則的骨陷窩及骨細(xì)胞，與正常骨組織形態(tài)大致相同，見圖2e。

正常骨組織的主要成分為鈣、磷酸鹽沉積，Ca、P含量較高，且Ca含量高于P。EDS中Ca波峰高度大于P，Ca元素峰覆蓋面積約為P元素峰覆蓋面積的兩倍，即Ca/P=2.06，見圖3a。A組在4 ～12 周的鈣磷含量均較低，各元素水平未見明顯變化，Ca/P為0.82，見圖3b。B、C兩組在4 周時鈣磷含量較低；8 周時Ca、P元素含量增加，但P元素增加快于Ca元素；12 周時Ca、P元素含量進(jìn)一步上升，P元素增速明顯減慢，各元素含量處于比較穩(wěn)定狀態(tài)，Ca含量超過了P元素，B組Ca/P=1.33,C組Ca/P=1.52，見圖3c、3d。D組在4 周時即見到Ca、P元素含量增加，其中P元素增加較快，呈雙峰；8 周時Ca、P元素仍然迅速增加，但Ca元素增加速度大于P，Ca/P達(dá)到2.85；12 周時Ca、P含量增速變緩，各元素含量逐漸穩(wěn)定，Ca/P=1.99，與正常骨組織含量及Ca/P無較大差異，見圖3e。

圖1 PCR檢測各組的BMP-2基因表達(dá)

圖2 12周SEM觀察 ×10 000

A：正常骨股骨頭組織；b:A組;c:B組;d:C組;e:D組

圖3 12周能譜分析

A：正常骨股骨頭組織；b：A組；c：B組；d：C組；e：D組

3 討論

研究[9]表明，BMSCs有多向分化能力、免疫原性小、增殖能力強(qiáng)、來源充足、取材廣泛等優(yōu)點(diǎn)，目前在組織工程和臨床上已經(jīng)廣泛使用。BMP有誘導(dǎo)成骨作用，其中BMP-2成骨誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，是最有前途的骨誘導(dǎo)物質(zhì)[10]；DBM具備良好的黏附率和孔隙率，利于種子細(xì)胞的黏附和生存，并且其取材于正常骨組織，有良好的生物組織相容性，是比較理想的生物支架材料[11-12]。本研究根據(jù)基因工程和組織工程原理采用腺病毒介導(dǎo)hBMP-2轉(zhuǎn)染兔BMSCs復(fù)合DBM的方法體外構(gòu)建組織工程骨，然后將該組織工程骨植入兔ONFH模型中進(jìn)行觀察研究以評估Ad-BMP-2/BMSCs/DBM對ONFH的效果。

RT-PCR技術(shù)可以在短時間內(nèi)擴(kuò)增出足量的DNA以供研究，有特異性高、敏感性高、易自動化等優(yōu)點(diǎn)，是組織工程中重要的檢測手段[13]。PCR和凝膠成像系統(tǒng)顯示4～8周 A組BMP-2均有微弱表達(dá)，提示其有微弱修復(fù)作用，12周時BMP-2表達(dá)量較前降低，可能為修復(fù)停止，骨小梁壞死、吸收所致。B、C、D組在各時間點(diǎn)BMP-2均有大量表達(dá)，且D組表達(dá)量遠(yuǎn)大于B、C兩組，提示DBM、BMSCs/DBM、hBMP-2/BMSCs/DBM對股骨頭壞死都有修復(fù)作用，但hBMP-2/BMSCs/DBM對股骨頭壞死的修復(fù)作用明顯優(yōu)于DBM、BMSCs/DBM組。

SEM利用電子束在樣品上逐點(diǎn)逐行掃描，直接觀察其表面形貌，是一種理想的超微結(jié)構(gòu)表面特征分析手段[14]。經(jīng)過電鏡掃描成像可見A組結(jié)構(gòu)混亂，已經(jīng)看不到完整骨小梁結(jié)構(gòu)及骨細(xì)胞，B、C兩組鏡下可見骨小梁及低分化類骨質(zhì)，D組可見大量規(guī)則骨小梁、細(xì)胞豐富，與正常骨組織類似，提示D組修復(fù)效果明顯大于前3組。

體內(nèi)骨生成包括成骨細(xì)胞分化增殖,骨基質(zhì)分泌,鈣鹽沉積和骨組織結(jié)構(gòu)改建成熟等過程。EDS 是一種以一定能量的加速粒子轟擊待分析樣品，從樣品中激發(fā)出特征射線，以顯示出活體組織的形態(tài)學(xué)影像及相應(yīng)的元素分布圖，從而確定樣品中各元素的種類和含量的方法，成為顯微分析不可缺少的一部分[15]。EDS顯示4～12周 A組Ca、P元素含量較低，且沒有任何變化，可能為ONFH吸收后沒有得到修復(fù)；B、C兩組4～12周 Ca、P含量有一定變化，且較A組有所增高，但Ca、P含量和Ca/P始終低于D組，提示兩組股骨頭均有不同程度的骨修復(fù)；D組Ca、P含量經(jīng)過降低、快速增加、緩慢增加、趨于穩(wěn)定的過程，Ca/P經(jīng)過降低、激增、回復(fù)正常的過程。Ca、P元素及Ca/P的變化提示D組股骨頭經(jīng)過了成骨分化過程，得到了良好修復(fù)。

本研究結(jié)果提示：在黏附率、孔隙率及相容性合適的支架上，hBMP-2基因等細(xì)胞因子高效持續(xù)表達(dá)，不斷地誘導(dǎo)BMSCs向骨細(xì)胞分化，促使組織工程骨修復(fù)壞死的股骨頭區(qū)域，進(jìn)而達(dá)到臨床治愈ONFH的目的。本研究通過組織工程方法在成骨方面已經(jīng)取得一定成效，但是在成骨的同時亦發(fā)現(xiàn)其成血管能力較弱，如何在成骨的同時增加血管的再生能力仍然是一個值得探索和研究的內(nèi)容。

綜上所述，hBMP-2/BMSCs/DBM對ONFH有明顯的修復(fù)作用，且其修復(fù)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于DBM和BMSCs/DBM。BMSCs在BMP-2的誘導(dǎo)下可以持續(xù)向骨細(xì)胞分化，產(chǎn)生新生骨組織，填充壞死區(qū)域，防止股骨頭塌陷，對早期ONFH的治療有良好的應(yīng)用前景，為臨床治療ONFH提供了新的思路和方法，值得進(jìn)一步探討和研究。

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Experimental study on the repair of Ad-BMP-2/BMSCs/DBM for rabbits’ femoral head necrosis

Shi Zhengsong,Li Qiang,Ning Yinkuan,et al

(Dept of Emergency Traumatic Surgery,The Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541001)

Objective To evaluate the effect of the Ad-BMP-2/BMSCs/DBM for rabbits’ femoral head necrosis by the RT-PCR, SEM and EDSand explore the new treatments for femoral head necrosis.Methods ① Prepare femoral head necrosis models by clinical core decompression combined with liquid nitrogen frozen.② After building models,animals were randomly divided into 4 groups(n=12) as follows:group A was not implanted anything as control group,group B was implanted into DBM,group C was implanted into hBMP-2/DBM,group D was implanted into hBMP-2/BMSCs/DBM.③ Four rabbits of each group were killed at 4,8,12 weeks after surgery to evaluate the reparation of ONFH through the RT-PCR,SEM and EDS. Results The RT-PCR showed: the expression of BMP-2 in group A

osteonecrosis of femoral head;bone marrow mesenchymal stem cells; bone morphogenetic protein -2;RT-PCR;SEM;EDS

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.028.html

國家自然科學(xué)基金(編號：31160199)；廣西自然科學(xué)基金(編號：2014jjAA40064)

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診創(chuàng)傷外科，桂林 541001

石正松，男，碩士研究生；

李 強(qiáng)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：li.q12251970@163.com

R 687.34

A

1000-1492(2016)01-0059-05

2015-09-30接收