金 銳，王 芳，欒 康，羅 欣，張勝權(quán)

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甲羥戊酸激酶基因真核及shRNA表達(dá)載體構(gòu)建及其對(duì)BxPC-3細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

金 銳，王 芳，欒 康，羅 欣，張勝權(quán)

目的 構(gòu)建甲羥戊酸激酶(MVK)基因真核及shRNA表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至BxPC-3細(xì)胞中，觀察其對(duì)細(xì)胞周期蛋白的影響。 方法 從BxPC-3細(xì)胞中提取總RNA, 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法獲得目的基因MVK以及通過(guò)化學(xué)合成MVK(751～779)和MVK(1 089～1 117)位點(diǎn)寡核苷酸片段，構(gòu)建真核表達(dá)及shRNA表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至BxPC-3細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。 Western blot法分析轉(zhuǎn)染后對(duì)BxPC-3細(xì)胞周期蛋白的影響。 結(jié)果 成功獲得MVK基因真核表達(dá)(pcDNA3.1-mvk)及兩個(gè)針對(duì)MVKshRNA表達(dá)載體(piLenti-RNAi-shRNA1/2)。通過(guò)抗生素篩選及Western blot分析獲得了穩(wěn)定的MVK過(guò)表達(dá)及低表達(dá)細(xì)胞株。Western blot分析顯示：過(guò)表達(dá)MVK的細(xì)胞株及MVKknockdown的細(xì)胞株中細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E表達(dá)量與正常及對(duì)照細(xì)胞相比均顯著降低。 結(jié)論MVK過(guò)表達(dá)及低表達(dá)均抑制BxPC-3細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表達(dá)。

甲羥戊酸激酶；基因重組；寡核苷酸；細(xì)胞周期蛋白；BxPC-3；shRNA

甲羥戊酸途徑是體內(nèi)膽固醇生物合成的重要代謝途徑[1]，其主要是由乙酰輔酶A為原料合成甲羥戊酸，然后在甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)的催化作用下最終生成法尼基焦磷酸(FPP)、牛耳基牛兒焦磷酸(GGPP)、膽固醇(CH)等。中間代謝產(chǎn)物FPP、GGPP是細(xì)胞蛋白質(zhì)酯化的戊二烯供體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過(guò)程[2]。研究[3]證實(shí)：幾乎存在一半以上腫瘤細(xì)胞中的p53能夠顯著上調(diào)細(xì)胞中甲羥戊酸途徑代謝及蛋白質(zhì)的酯化過(guò)程，提示甲羥戊酸途徑可能成為腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,患者死亡率高。Harrison et al[4]研究發(fā)現(xiàn)苯乙酸鹽能夠抑制甲羥戊酸途徑中類異戊二烯的生物合成進(jìn)而對(duì)胰腺癌細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用。真核細(xì)胞進(jìn)行增殖主要依靠有絲分裂方式。分裂周期分為：間期和分裂期。細(xì)胞周期的順利進(jìn)行需要細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)及周期蛋白依賴性激酶(CDK)進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)甲羥戊酸代謝途徑紊亂，可能對(duì)胰腺癌細(xì)胞周期蛋白合成產(chǎn)生影響最終產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制。該研究通過(guò)體外構(gòu)建不同基因表達(dá)載體研究其對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞周期蛋白的作用及機(jī)制，旨在為胰腺癌治療提供一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因重組試劑 TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA上樣緩沖液(6×Loading Buffer、DNA Marker(DL2 000等)、PCR反應(yīng)試劑、Hind Ⅲ和XhoⅠ均購(gòu)自日本TaKaRa公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BbsI購(gòu)自美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)AxyGen公司。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染試劑 DMEM、1640、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；G418和嘌呤霉素(Puromycin)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；MegaTran1.0 Transfection Reagent購(gòu)自美國(guó)Origene公司。

1.1.3 細(xì)胞、質(zhì)粒、菌株 胰腺癌細(xì)胞BxPC-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心； pcDNA.3.1/myc-His A, B, and C、piLenti-RNAi-GFP、E.coliJM109均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI GenBank 提供的MVK序列，設(shè)計(jì)MVK真核表達(dá)引物。 上游引物(帶有Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))：5′-CCCAAGCTTATGTTGTCAGAAGTCCTACTGG-3′; 下游引物(帶有Xho Ⅰ酶切位點(diǎn))：5′-CCGCTCGAGTCAGAGGCCATCCAGGGCTTGC-3′。利用shRNA在線軟件設(shè)計(jì)兩條針對(duì)MVK基因 mRNA的shRNA序列。針對(duì)MVK(751-779)的序列：5′-AGAAACAGGCTGCTCAAGTTCCCAGAGAT-3′和MVK(1 089～1 117)的序列：5′-TGGCTTTGACTGCTTGGAAACCAGCATCG-3′。寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。1.2.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)收集及總RNA提取 復(fù)蘇HaCaT細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待其狀態(tài)良好，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞懸液，TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增野生型MVK基因

1.2.3.1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，依次加入總RNA 5 μl,10×RT Buffer 1 μl,Oligo dT 0.5 μl,10 mmol/L dNTP 1 μl,25 mmol/L MgCl22 μl，AMV Reverse Transcriptase 0.25 μl。輕彈管底使其混勻，點(diǎn)動(dòng)離心，42 ℃ 60 min, 95 ℃ 5 min條件下逆轉(zhuǎn)錄，加入40 μl ddH2O即為cDNA備用溶液。

1.2.3.2 PCR反應(yīng) 取上述cDNA 5 μl，依次加入TaqDNA Polymerase 1 μl、上下游引物各0.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、10×Buffer 2.5 μl、25 mmol/L MgCl21.5 μl，補(bǔ)ddH2O 8.5μl。94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，循環(huán)30次。瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.2.4 重組體的構(gòu)建及篩選

1.2.4.1MVK基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選 將質(zhì)粒pcDNA.3.1和MVK在37 ℃的恒溫體系中分別用核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ雙酶切4 h。瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果，用膠回收試劑盒回收所需酶切產(chǎn)物。pcDNA.3.1和目的片段按5︰1摩爾比加入T4 DNA連接酶體系中，16 ℃連接過(guò)夜。-80 ℃取出感受態(tài)JM109細(xì)胞, 將上述重組體轉(zhuǎn)化至JM109中，37 ℃培養(yǎng)12 h，菌落擴(kuò)增后經(jīng)PCR、酶切進(jìn)行重組體鑒定，測(cè)序。-20 ℃保存，備用。重組體命名為pcDNA 3.1-mvk。

1.2.4.2MVK不同位點(diǎn)shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建、篩選 合成的oligoDNA序列在緩沖體系中依次經(jīng)過(guò)變性、退火反應(yīng)。質(zhì)粒piLenti-RNAi-GFP及oligoDNA經(jīng)Bbs I酶切、電泳、回收，以5 ∶1的摩爾比16 ℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109，經(jīng)抗生素及PCR篩選出陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增，測(cè)序，提取質(zhì)粒。-20 ℃保存，備用。重組體命名為piLenti-RNAi-mvk1/2。

1.2.4.3 重組體轉(zhuǎn)染至BxPC-3細(xì)胞 復(fù)蘇凍存的人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞，于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，待其狀態(tài)良好，按2×105/ml密度接種于12孔板中培養(yǎng)，待其達(dá)到90%～95%匯合時(shí)，用MegaTran1.0 Transfection Reagent將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BxPC-3細(xì)胞中，設(shè)置復(fù)孔培養(yǎng)24 h后，分別用G418和Puromycin抗性培養(yǎng)基篩選。同時(shí)設(shè)置空白未處理及轉(zhuǎn)染空載pcDNA3.1、piLenti-RNAi-GFP細(xì)胞組作為對(duì)照。

1.2.4.4 Western blot 檢測(cè)MVK基因表達(dá)產(chǎn)物 6組細(xì)胞(空白未處理細(xì)胞、pcDNA3.1、pcDNA3.1-mvk、piLenti-RNAi-GFP、piLenti-RNAi-mvk1/2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)培養(yǎng)后，提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，按10 μl /孔上樣量加入12%凝膠孔中，依次進(jìn)行：電泳(濃縮膠60 V,分離膠120 V約2 h)、轉(zhuǎn)移(150 mA恒流3 h左右)、封閉(5%脫脂牛奶常溫封閉2 h)、孵育一抗(4 ℃孵育過(guò)夜)、孵育二抗(常溫?fù)u床孵育2 h)、Thermo Scientific SuperSignal West Pico Trial Kit化學(xué)發(fā)光底物顯影，分析MVK基因表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.4.5 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白表達(dá) 通過(guò)1.2.4.4步驟鑒定出MVK基因高表達(dá)及knockdown的細(xì)胞，接種24孔培養(yǎng)板，Western blot步驟同1.2.2.4，化學(xué)發(fā)光分析各組細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白(Cyclin B1及Cyclin E)的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增MVK基因編碼區(qū)(CDS)及化學(xué)合成shRNA 經(jīng)RT-PCR獲得大量MVK基因全長(zhǎng)片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見1 190 bp左右特異性擴(kuò)增條帶，見圖1A。

2.2MVK真核表達(dá)重組體的構(gòu)建與鑒定MVK基因經(jīng)酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化后。PCR及雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，結(jié)果可見1 190 bp的MVKPCR產(chǎn)物，酶切后可見5 500 bp的pcDNA3.1及1 190 bp的MVK片段，見圖1A、1B 。陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后測(cè)序，結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)正確(圖1C，給出MVK的部分序列),保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 shRNA經(jīng)酶切、電泳、回收、轉(zhuǎn)化、連接、轉(zhuǎn)化后，經(jīng)酶切篩選陽(yáng)性克隆(圖1D)。擴(kuò)增后測(cè)序，結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)正確(圖1D，給出shRNA1的序列),保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 轉(zhuǎn)染BxPC-3觀測(cè)GFP熒光和篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 piLenti-RNAi-GFP-mvk(751-779,shRNA1)及piLenti-RNAi-GFP-mvk(1 089～1 117, shRNA2)轉(zhuǎn)染BxPC-3經(jīng)Puromycin(0.5 μg/ml) 篩選，熒光鏡下結(jié)果見圖2, Western blot分析顯示shRNA1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中MVK蛋白表達(dá)顯著降低，見圖3。

圖1 MVK真核表達(dá)載體及shRNA表達(dá)載體構(gòu)建

M: Marker；A:MVK全長(zhǎng)片段獲取及重組體篩選；1、2：MVKPCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3、4:MVK重組體酶切結(jié)果；B: PCR篩選MVK重組體克??； 1、3、4、6：陰性克?。?、5、7、8：陽(yáng)性克??；C:MVK測(cè)序結(jié)果(部分序列)；D: shRNA1 測(cè)序結(jié)果(部分序列)

圖2 熒光篩選MVKshRNA轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系

A: 轉(zhuǎn)染piLenti-RNAi-GFP組； B: 轉(zhuǎn)染mvkshRNA1組； C: 轉(zhuǎn)染mvkshRNA2組

圖3 Western blot分析MVK及Cyclins結(jié)果

A：空白未處理組；b：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組；c：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-mvk組；d：轉(zhuǎn)染piLenti-RNAi-GFP組； e：轉(zhuǎn)染 piLenti-RNAi-GFP-mvk(751-779, shRNA1) 組；f：piLenti-RNAi-GFP-mvk(1 089～1 117,shRNA2) 組；與空白未處理組比較：*P<0.05；與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組比較：#P<0.05；與轉(zhuǎn)梁piLenti-RNAi-GFP組比較：△P<0.05

pcDNA3.1-mvk轉(zhuǎn)染BxPC-3后，用抗生素G418(500 μg/ml)篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，Western blot結(jié)果顯示pcDNA3.1-mvk穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中MVK蛋白表達(dá)顯著升高,見圖3。

2.5 Western blot分析轉(zhuǎn)染后MVK基因在BxPC-3中表達(dá)情況以及對(duì)BxPC-3細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響 a到f組細(xì)胞各指標(biāo)分別進(jìn)行方差分析，SPSS 17.0軟件分析得出FMVK=716.86,FCyclinB1=55.346,FCyclinE=93.321，各組均為P>0.05,即方差齊性，對(duì)各指標(biāo)分別進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-mvk組、空白未處理組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組相比，MVK相對(duì)表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin B1、Cyclin E)相對(duì)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染MVKshRNA1/shRNA2組與空白未處理組、轉(zhuǎn)染piLenti-RNAi-GFP組相比，MVK相對(duì)表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin B1、Cyclin E)相對(duì)表達(dá)量也顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

甲羥戊酸代謝途徑是體內(nèi)合成脂類物質(zhì)的一種重要代謝途徑，參與細(xì)胞的生理進(jìn)程，幾乎存在于所有高等真核生物和病毒中[5]。其中MVK起到關(guān)鍵作用，是合成下游重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的橋梁[6]。研究[7-8]表明甲羥戊酸基因突變將導(dǎo)致MVK缺失癥，是一種稀有的常染色體代謝性疾病。

本研究通過(guò)體外構(gòu)建MVK基因的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至人胰腺癌細(xì)胞BxPC-3,旨在研究MVK基因不同程度表達(dá)對(duì)其增殖相關(guān)蛋白的影響。通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染含有野生型MVK基因的重組體使BxPC-3細(xì)胞MVK基因高表達(dá)，并在很大程度上降低細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表達(dá)水平；轉(zhuǎn)染MVK基因的shRNA1/2均能下調(diào)BxPC-3細(xì)胞MVK基因的表達(dá)水平且不同程度地抑制其周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表達(dá)。該研究采用基因工程及knockdown技術(shù)構(gòu)建不同基因表達(dá)載體來(lái)干預(yù)胰腺癌細(xì)胞MVK基因表達(dá)程度，從而為更詳細(xì)地研究甲羥戊酸途徑在胰腺癌中的作用機(jī)制打下了一個(gè)新的基礎(chǔ)。

縱觀甲羥戊酸整個(gè)代謝途徑，當(dāng)MVK缺失后將會(huì)導(dǎo)致下游的FPP、GGPP、CH等的缺失及上游甲羥戊酸的累積。其中FPP、GGPP是細(xì)胞蛋白質(zhì)酯化的戊二烯供體[9],細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的異戊二烯化使定位于細(xì)胞膜上的GTP酶介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡進(jìn)程。其中，研究最多的就是小G蛋白參與的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制。常見的小G蛋白如Ras、Rho、Rab、Ran家族等，它們是細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心環(huán)節(jié)，因此參與對(duì)細(xì)胞生理功能的影響，并與抗腫瘤治療有關(guān)[10]。代謝中產(chǎn)生的CH是細(xì)胞膜系統(tǒng)的重要組成成分，在細(xì)胞的生理功能各個(gè)方面扮演著非常重要的角色。由此可以推斷，MVK基因突變后導(dǎo)致MVK功能缺失，造成下游產(chǎn)物FPP、GGPP等缺乏，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白酯化過(guò)程不能進(jìn)行，從而可能影響細(xì)胞周期蛋白及其蛋白因子表達(dá)，進(jìn)而阻礙細(xì)胞的生長(zhǎng)。而當(dāng)MVK活性過(guò)度增強(qiáng)時(shí)，將很大程度加快代謝反應(yīng)的進(jìn)程，促使下游產(chǎn)物FPP、GGPP等合成持續(xù)增加，促進(jìn)細(xì)胞蛋白質(zhì)酯化過(guò)程加快過(guò)度，從而可能不同程度地影響細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)造成生理功能紊亂，如降低周期蛋白的表達(dá)水平，表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，其深入的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。因此，下一步將重點(diǎn)進(jìn)行MVK正常表達(dá)、低表達(dá)和高表達(dá)情況下，BxPC-3細(xì)胞增殖相關(guān)情況及其相同條件下小G蛋白酯化情況及其介導(dǎo)的信號(hào)通路方面的研究。

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The construction of eukaryotic and shRNA expression vector of mevalonate kinase gene and its effect on cyclins expression in BxPC-3

Jin Rui, Wang Fang, Luan Kang, et al

(Dept of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui Medical University, Hefei 230032)

Objective To construct the eukaryotic expression and shRNA expression vectors of mevalonate kinase (MVK) gene and study the effect on cyclins expression in BxPC-3 cells. Methods Total RNA was extracted from BxPC-3 cells, and the desired geneMVKwas obtained by RT-PCR and acquiring chemical synthesisMVK(751-779) andMVK(1089-1117) locus oligo fragments. After construction of eukaryotic and shRNA expression vectors using genetic engineering, the recombinant was transfected into BxPC-3 and cell lines of stable expression were selected by antibiotic. Western blot was used to analyze the expression ofMVKand cyclins in BxPC-3. ResultsMVKeukaryotic (pcDNA3.1-mvk) and two shRNA (piLenti-RNAi-shRNA1/2) expression vectors forMVKwere successfully constructed. The cell lines with stableMVKover-expression and knockdown were obtained by antibiotic selection and Western blot. Western blot results showed that Cyclin B1 and Cyclin E expressed significantly lower both in BxPC-3 cell withMVKover-expression andMVKknockdown compared with the control. Conclusion BothMVKover expression and knockdown can inhibit the expression of Cyclin B1, Cyclin E in BxPC-3.

mevalonate kinase; genetic recombination; oligos; cyclins; BxPC-3 cell; shRNA

時(shí)間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.012.html

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81271748)

安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，合肥 230032

金 銳，男，碩士研究生；

張勝權(quán)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail:sqz36@yahoo.com

R 349.83

A

1000-1492(2016)01-0022-05

2015-10-12接收