楊宗強，何 胤，施建黨，趙 晨，岳學峰，劉海濤，張小敏，王 潔

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INH-PZA-PLGA緩釋微球制備及體外釋藥性能的研究

楊宗強1*，何 胤2*，施建黨1，趙 晨2，岳學峰2，劉海濤3，張小敏4，王 潔4

目的 研究異煙肼(INH)、吡嗪酰胺乳酸(PZA)-羥基乙酸共聚物(PLGA)微球的制備及體外釋藥特性。方法 以PLGA為載體，采用復乳-溶劑揮發(fā)法制備INH-PZA-PLGA微球；掃描電子顯微鏡(SEM)觀察INH-PZA-PLGA微球形態(tài)特征；計算INH-PZA-PLGA微球中INH、PZA的載藥量、包封率；高效液相色譜法(HPLC)檢測INH-PZA-PLGA微球在不同時段模擬體液中INH、PZA的藥物濃度，觀察其是否均大于10倍最小抑菌濃度(MIC)，計算其各階段釋藥量、累計釋藥度并擬合藥物體外釋放數(shù)學方程并觀察其體外釋藥特性。結(jié)果 INH-PZA-PLGA微球成球規(guī)整、分布均勻、表面光滑、分散性好，平均粒徑為(11.04±0.4) μm，INH和PZA的載藥量分別為(21.78±0.27)%、(24.91±0.16)%，包封率分別為(58.52±1.65)%、(72.26±1.28)%。INH-PZA-PLGA微球中INH突釋現(xiàn)象較PZA突釋現(xiàn)象明顯，46 d INH累計釋放量93.01%，PZA累計釋放量77.40%。前9 d兩種藥物釋放規(guī)律擬合Higuchi曲線的R2值最大，可認為兩種藥物按從高濃度向低濃度的規(guī)律釋放；12 d后兩種藥物擬合零級曲線的R2值最大，可認為兩種藥物按等量的規(guī)律釋放。結(jié)論 INH-PZA-PLGA微球具有良好的體外藥物緩釋性能，階段釋放量均大于10倍的MIC，理論上可達到體內(nèi)殺死結(jié)核桿菌的濃度，為脊柱結(jié)核術(shù)后局部給藥研究奠定基礎(chǔ)。

脊柱結(jié)核；INH-PZA-PLGA緩釋微球；體外；釋藥性能

隨著脊柱結(jié)核生物材料的發(fā)展，其療效明顯改善，但藥物化療仍是治療的基礎(chǔ)和根本[1-2]。藥物療效取決于病灶局部藥物濃度，由于病灶部位硬化死骨形成，局部血運差，常規(guī)抗結(jié)核藥物化療難以達到有效殺菌藥物濃度，并易導致耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)，已成藥物化療難以奏效、疾病遷延不愈和復發(fā)的主因[3]。因此，開發(fā)具有靶向、高效、低毒、緩釋的新型抗結(jié)核藥物，提高脊柱結(jié)核局部藥物濃度成為急需解決的難題。聚乳酸-羥基乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)有良好的生物相容性、生物降解性、載藥性及定向性等特征[4]。異煙肼(isoniazide, INH)、吡嗪酰胺(pyrazinamide, PZA)是一線抗結(jié)核藥物，理化性質(zhì)相近，對殺死結(jié)核桿菌起到重要的作用。該研究以PLGA為載藥載體，采用復乳-溶劑揮發(fā)法制備載INH、PZA兩種抗結(jié)核藥物的微球[5]，為后期體內(nèi)藥代動力學研究及脊柱結(jié)核局部用藥治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 聚乳酸-乙醇酸(PLGA 90/10 M：9.7萬,濟南岱罡生物工程有限公司)；PBS 緩沖液(pH 7.4，美國Sigma公司)；聚乙烯醇(PVA，美國Sigma公司)；聚乙二醇(PEG進口分裝)；INH原藥、PZA原藥(美國Sigma公司)；INH、PZA標準品、庚烷磺酸鈉(中國藥品技術(shù)監(jiān)督檢驗所)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；高效液相色譜儀(HPLC)D-2000(日本日立公司)；CN(5 μm)，250 mm×4.6 mm色譜柱(美國Waters公司)；低溫高速離心機ALLEGRA6(美國Beckman公司)；精密電子天平(北京賽多利思科學儀器有限公司)；79HW-1型恒溫磁力攪拌器(浙江樂成電器廠)；超聲波清洗器(深圳市諾賽德精密科技有限公司)；冷凍干燥機(美國Labconco公司)；S3400掃描電鏡(日本日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 INH-PZA-PLGA微球的制備 準確稱量300 mg PLGA溶于10 ml二氯甲烷中，超聲振蕩均勻分散形成油相(O)；再分別準確稱量30 mg INH原藥、30 mg PZA原藥置于2 ml的超純水與甲醇的混合液(V/V=1 ∶1)，在37 ℃下使其完全溶解形成內(nèi)水相(W1)；將上述油相(O)緩慢注入內(nèi)水相溶液中持續(xù)攪拌乳化10 min，使其均勻分散形成初乳乳劑(W1/O)；將上述初乳乳劑60滴/min滴入50 ml 1%PVA溶液(外水相 W2)，外水相(W2)中含有5 ml 0.1%PEG溶液，持續(xù)攪拌形成復乳(W1/O/W2)；將復乳乳劑續(xù)攪拌過夜，使二氯甲烷完全揮發(fā)，達到固化微球的目的，充分離心(5 000 r/min，15 min)沉降微球，再經(jīng)超純水反復沖洗離心3次，凍干干燥并放置-20 ℃條件下避光保存?zhèn)溆?。同樣方法制?批備用。

1.2.2 HPLC色譜條件、標準曲線建立及回歸方程的計算 采用WatersCN色譜柱(5 μm，250 mm× 4.6 mm)；預柱SB-C18(5 μm，4.6 mm×2.5 mm)；流動相：0.01 mol/L庚烷磺酸鈉(純磷酸滴定pH 2.4)：乙腈=45 ∶55；檢測波長270 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積20 μl；流速1 ml/min。

利用HPLC在上述色譜條件下，檢測配制INH濃度分別為7.300、2.920、1.460、0.730、0.292、0.146 μg/ml，進樣6次，進樣體積為20 μl；檢測配制PZA濃度分別7.150、2.860、1.430、0.715、0.286、0.143 μg/ml，進樣6次，進樣體積為20 μl，記錄各自色譜圖的峰面積，以濃度X對峰面積Y進行線性回歸，分別得校準曲線方程：

1.2.3 空白PLGA聚合物緩釋微球干擾性研究 按1.2.1項的方法制備不含INH、PZA的聚合物緩釋微球，稱取一定量空白PLGA緩釋微球置于PBS(pH 7.4)溶液一定時間取浸提液，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。

1.3 INH-PZA-PLGA微球的研究

1.3.1 形態(tài)學分析及粒徑的測定 INH-PZA-PLGA聚合物微球分散導電膠帶表面，烘干，噴金后置于SEM觀察微球的形態(tài)特征并拍照存檔，分別觀察100粒微球，測量出各個微球的直徑，計算其平均粒徑。

1.3.2 載藥量及包封率測定 分別精確稱取50 mg INH-PZA-PLGA微球，于一定量的二氯甲烷中完全溶解，甲醇定容100 ml，超聲后,按上述條件HPLC法測定藥物含量并按如下公式計算載藥量。

載藥量(%)=微球中含藥量/載藥PLGA微球總質(zhì)量×100%

INH-PZA-PLGA微球備用微球稱量后，于一定量的二氯甲烷完全溶解，甲醇定容100 ml，超聲后，按上述條件HPLC法測定藥物含量并按如下公式計算包封率。

包封率(%)=微球中實際含藥量/理論投藥量×100%

1.3.3 INH-PZA-PLGA微球體外藥物緩釋實驗 準確稱取20 mg INH-PZA-PLGA 微球置于透析袋中，加入2.5 ml PBS 緩沖液(pH 7.4)，在37 ℃恒溫水浴箱中將密閉好的透析袋放入盛有10 ml PBS液搖床，嚴格于0.125、0.25、0.5、1、2、3、6、9、12、15、18、25、32、39、46 d各時間點取浸提液5 ml，每次取樣后向原緩沖液中及時補加5 ml PBS。微球浸提液用0.22 μm濾器過濾裝入1.5 ml進樣瓶中，采用“1.2.2”液相條件進行檢測并記錄峰面積，將峰面積值代入對應的標準曲線方程中，計算出各時間點藥物釋放量，再累計釋藥度，以緩釋時間為X軸，累計釋放度為Y軸，擬合零級動力學緩釋曲線；以釋放時間為X軸，累積釋放度的常用對數(shù)與1的差值為縱坐標，擬合一級動力學緩釋曲線；以釋放時間的1/2次方為X軸，累積釋放度為Y軸，擬合Higuchi釋放曲線，比較其R2值，觀察兩種藥物在體外的緩釋規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1 空白PLGA微球干擾性研究 按上述色譜條件，空白PLGA微球浸提液在INH和PZA的色譜峰處沒有出峰(圖1A)，再取實驗樣品浸提液按上述色譜條件進20 μl，樣品主峰保留時間與標準品溶液主峰的保留時間一致, 兩藥保留時間分別為3.76 min(INH)、2.96 min(PZA)，兩者分離良好(圖1B)，因此，空白PLGA微球在此色譜條件下對主峰無干擾。

2.2 INH-PZA-PLGA緩釋微球形態(tài)學觀察及粒徑分析 INH-PZA-PLGA微球外觀呈白色，掃描電子顯微鏡(SEM)下微球大小均勻、外觀圓整、表面光滑、互不粘連及分散性好。平均粒徑為(11.04±0.4) μm，粒徑變化范圍小，分布差異性小，見圖2。

2.3 INH-PZA-PLGA微球含藥量 INH-PZA-PLGA緩釋微球中INH和PZA的載藥量分別為(21.78±0.27)%、(24.91±0.16)%，包封率分別為(58.52±1.65)%、(72.26±1.28)%。

圖1 色譜圖

A：空白PLGA微球浸提液色譜圖；B：INH、PZA保留時間的色譜圖

圖2 INH-PZA-PLGA微球的掃描電鏡圖 ×500

2.4 INH-PZA-PLGA微球體外藥物釋放實驗 INH-PZA-PLGA微球中INH、PZA各時間段的釋藥量和累計釋藥度的結(jié)果見表1。第6天時INH的累計釋藥度達51.27%，第12天時PZA的累計釋藥度達53.76%，兩藥的累計緩釋度均超過了50%，46 d時INH累計釋放量達93.01%，PZA的累計釋放度達77.40%。INH的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)是0.025～0.05 μg/ml,在pH 5.0的情況下，PZA的MIC為1.5 μg/ ml，藥物濃度大于10倍MIC即達到殺死結(jié)核桿菌的藥物濃度，46 d時INH和PZA的階段釋放度分別為18.22、58.47 μg/ml，均大于兩種藥物各自10倍MIC。INH-PZA-PLGA微球INH、PZA體外藥物釋放曲線的數(shù)學方程(表2)，前9 d兩種藥物釋放進行擬合曲線，零級曲線和一級曲線二者R2均小于擬合Higuchi曲線的R2，可認為兩種藥物按從高濃度向低濃度的規(guī)律釋放；12 d后藥物釋放進行擬合曲線，Higuchi曲線和一級曲線二者R2均小于擬合零級曲線的R2，可認為兩種藥物按等量的規(guī)律緩釋。

表1 微球中INH、PZA階段釋藥量和累計釋藥度

表2 微球中INH、PZA各自釋放曲線的數(shù)學方程

3 討論

由于抗結(jié)核藥物的劑型特征、給藥方式等影響，對脊柱結(jié)核的治療效果影響最為嚴重。為了提高結(jié)核病灶局部的藥物濃度，許多研究者開始改變抗結(jié)核藥物的劑型和給藥方式，以提高化療效果。新型緩釋技術(shù)的研究是目前局部給藥的最佳選擇，PLGA微球具有良好的組織相容性、適宜的釋藥性能以及相對簡單的制備方式，在體內(nèi)最終產(chǎn)物是二氧化碳和水，降解速度緩慢[6-7]，故載抗結(jié)核藥物的PLGA緩釋微球的研究具有一定的可行性。

本研究表明PZA體外釋放規(guī)律與Malathi et al[8]制備載PZA-PLGA緩釋微球緩釋規(guī)律一致，但對于INH-PLGA緩釋微球體外釋放規(guī)律的研究未見文獻報道。載藥量和包封率是評價聚合物緩釋微球的重要指標，PLGA濃度、PVA濃度、油水相體積比等是決定PLGA緩釋微球載藥量和包封率的關(guān)鍵因素。劉江濤 等[9]制備INH聚乳酸微球其包封率為(67.51±0.57)%，載藥率為(32.82±0.65)%，42 d累計釋藥量占40%。但對于PLGA微球載兩種理化性質(zhì)相似INH、PZA的相關(guān)研究未見報道。本實驗采用黃術(shù)[10]研究報道PLGA微球，其最佳處方PLGA濃度15%、PVA濃度2%、油/水比1 ∶5，制備INH-PZA-PLGA微球中INH和PZA的載藥量分別為(21.78±0.27)%、(24.91±0.16)%，包封率分別為(58.52±1.65)%、(72.26±1.28)%，且藥物緩釋時間約46 d時INH和PZA累計釋藥度分別為93.01%、77.40%，本研究的載藥量、包封率、緩釋時間較其他研究有所改善，其存在很多方面的原因。本研究在微球制備過程中外水相中加入0.1% PEG溶液，PEG是一種線形聚醚二醇，常被用作非離子親水聚合物，具有極強的溶解性，能溶于大部分溶劑，而且其無毒性、無免疫原性和抗原性，并且其能改善材料的親水性，起到穩(wěn)定劑的作用[11]。Wu et al[12]研究表明聚賴氨酸和透明質(zhì)酸使得左氧氟沙星-PLGA微球中水溶性左氧氟沙星的載藥量由31%增加到約50%，且34 d藥物累計釋放量約為15.2%。INH的載藥量和包封率均低于PZA的載藥量和包封率，INH累計釋放量明顯大于PZA累計釋放量，究其原因可能與兩種藥物的理化性質(zhì)有關(guān)系。INH屬于極性分子，極易溶于水，PZA也屬于極性分子，但其微溶于水中，在甲醇中加熱37 ℃完全溶解，所以當初乳加入到外水相時，INH極易溶于水，導致微球在包封固化過程中含INH減少進而導致INH載藥率和包封率低于PZA，但未見其他相關(guān)文獻詳細報道。微球緩釋的整個過程中INH較PZA明顯存在不平穩(wěn)的突釋現(xiàn)象，前3 h內(nèi)兩種藥物的突釋可能與微球制備完成后沖洗不徹底有直接關(guān)系，但3～12 h INH存在其他不平穩(wěn)的突釋，主要是由于后期隨著微球在緩沖溶液中吸水溶漲并水解以及異煙肼的理化性質(zhì)造成[13]。約12 d兩種藥物濃度明顯增高，可能與微球支架崩解有直接關(guān)系。INH-PZA-PLGA微球藥物釋放時間較長，除上述藥物理化性質(zhì)的影響外，PBS不能和體內(nèi)完全一致，PLGA在體外和體內(nèi)降解速度完全不一致，但未見明確文獻報道。

聚合物緩釋微球的制備過程中，選擇的載藥載體及制備方法的不同，聚合物緩釋微球的粒徑差異性很大。Hu et al[14]采用SPG分散方法制備載RFP-PLGA微球，平均粒徑為1.748 μm。本實驗中制備的載藥PLGA微球的平均粒徑為(11.04±0.40) μm，緩釋微球的用途不同，其制備方法也就不同，導致粒徑有很大差異，主要因為本研究在外水相中加入1%PEG溶液5 ml，導致粒徑增大。在聚合物緩釋微球的制備過程中發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)速對微球粒徑大小有較大影響，轉(zhuǎn)速越快，微球粒徑越小，反之微球粒徑越大；油相滴入外水向的方法方式對粒徑大小也有關(guān)，與Hirota et al[15]在制備載利福平PLGA微球的過程中證實一致。

本研究以PLGA作為載體制備INH-PZA-PLGA二聯(lián)微球，載藥效果好，理論上能夠?qū)崿F(xiàn)局部給藥及達到有效治療濃度的目的，為后期體內(nèi)緩釋實驗提供研究基礎(chǔ)，但本實驗的研究結(jié)果對脊柱結(jié)核術(shù)后理論化療還存在載藥量低、緩釋時間短等缺點，應繼續(xù)完善或改進制備方法，提高載藥量、延長緩釋時間以及開展臨床研究等。

[1] Shi J D, Wang Z L, Geng G Q, et al. Intervertebral focal surgery for the treatment of non-contiguous multifocal spinal tuberculosis[J]. Int Orthop, 2012, 36(7):1423-7.

[2] Wang Z L, Shi J D, Geng G Q, et al. Ultra-short-course chemotherapy for spinal tuberculosis: five years of observation[J]. Eur Spine J,2013, 22 (2):274-81.

[3] Ozaki S, Saito A, Nakaminami H, et al. Comprehensive evaluation of fibrin glue as a local drug-delivery system-efficacy and safety of sustained release of vancomycin by fibrin glue against local methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection[J]. J Artif Organs, 2014, 17(1):42-9.

[4] Hong S J, Yu H S, Kim H W. Tissue engineering polymeric microcarriers with macroporous morphology and bone-bioactive surface[J]. Macromol Biosci, 2009, 9(7):639-45.

[5] Liu J, Lv X. The pharmacokinetics and pharmacodynamics of lidocaine-loaded biodegradable poly (lactic-co-glycolic acid) microspheres [J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(10):17469-77.

[6] Rossi F, Perale G, Papa S, et al. Current options for drug delivery to the spinal cord[J]. Expert Opin Drug Deliv,2013,10(3):385-96.

[7] Hua X, Tan S, Bandara H M, et al. Externally controlled triggered-release of drug from PLGA micro and nanoparticles [J]. PLoS One, 2014, 9(12):11-7.

[8] Malathi S, Balasubramanian S. PLGA Nanoparticles for Anti Tuberculosis Drug Delivery[J]. Adv Mat Res, 2012, 548(10):465-9.

[9] 劉江濤,王永清,夏 侃,等. 異煙肼聚乳酸緩釋體的制備及體內(nèi)外釋藥特性[J].中國脊柱脊髓雜志,2008,18(4):290-3.

[10] 黃 術(shù). RFP-PLGA骨緩釋復合體的初步實驗研究[D].長沙：中南大學,2013.

[11] Veronese F M, Pasut G. PEGylation: Posttranslational bioengineering of protein biotherapeutics[J]. Drug Discov TodayTechnol，2008, 5(2-3):e57-e64.

[12] Wu G, Chen L, Li H, et al. Comparing microspheres with different internal phase of polyelectrolyte as local drug delivery system for bone tuberculosis therapy [J]. Biomed Res Int,2014, 15(11):1-8.

[13] 楊宗強,何 胤，施建黨. 聚乙二醇對利福平-聚乳酸-羥基乙酸聚合物緩釋微球性能的影響[J].中國組織工程研究,2015,19(3):421-6.

[14] Hu C, Feng H, Zhu C. Preparation and characterization of rifampicin-PLGA microspheres/sodium alginate in situ gel combination delivery system[J].Colloids Surfaces B Biointerfaces,2012, 95(15):162-9.

[15] Hirota K, Hasegawa T, Nakajima T, et al. Delivery of rifampicin-PLGA microspheres into alveolar macrophages is promising for treatment of tuberculosis [J]. J Control Release, 2010, 142(3):339-46.

Yang Zongqiang1, He Yin2, Shi Jiandang1, et al

(1DeptofOrthopedicSpine,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004;2GraduateSchoolofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004 )

To research INH-PZA-PLGA sustained release microspheres preparation and the drug release characteristicsinvitro

Objective To research the INH, PZA poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) sustained-release microsphere preparation and the drug release characteristicinvitro. Methods PLGA as a carrier, INH-PZA-PLGA sustained-release microsphere was prepared by using double emulsion-solvent evaporation method. INH-PZA-PLGA sustained-release microsphere feature was observed by scanning electron microscopy (SEM). The drug loading and encapsulation efficiency of INH, PZA were computed respectively in INH-PZA-PLGA polymeric microsphere. The drug concentration and the cumulative release of INH,PZA were detected by high performance liquid chromatography(HPLC) in simulated body fluid in different periods and observed whether they were greater than minimal inhibitory concentrations(MIC) 10 times, and calculated the cumulative release rate, fitted mathematical equationsinvitro, and release characteristics observedinvitro. Results INH-PZA-PLGA microsphere was balling structured, evenly distributed, smooth surface and good dispersion each other, the average particle size was (11.04±0.4) μm under the SEM. The drug loading of INH was (21.78±0.27)%, PZA was (24.91±0.16)%, the encapsulation efficiency of INH was (58.52±1.65)%,PZA was (72.26±1.28)%. In the microsphere, INH was more obvious than PZA in burst release, the cumulative release degree of INH was 93.01% and PZA was 77.40% at 46th day. INH and PZA with Higuchi curve kinetics R2were the biggest 9th day before, so both drugs could be considered their releases behavior, which was from the high concentration to low concentrationinvitro. INH and PZA with zero-order kinetics R2were biggest 12th day after, so both drugs could be considered by the same amount of law to release. Conclusion INH-PZA-PLGA microspheres have good drug release performance, which the drug release is 10 times more than MICinvitro. It can be achieved to kill tuberculosisinvivoin theory and lay the foundation of postoperative chemotherapy for local drug delivery system for spinal tuberculosis.

spinal tuberculosis; sustained release microsphere;invitro; release property

時間：2015-12-30 14:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20151230.1438.006.html

國家自然科學基金(編號：81360275)；寧夏自然科學基金(編號：NZ13131)；寧夏醫(yī)科大學校級項目(編號：XT20)

寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院1脊柱骨科、3創(chuàng)傷骨科，銀川 750004

寧夏醫(yī)科大學2研究生學院、4醫(yī)學科學技術(shù)研究中心，銀川 750004

楊宗強，男，碩士研究生；

施建黨，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：shi_jiandang@163.com

R 978.3；R 944

A

1000-1492(2016)01-0009-05

2015-09-30接收

*對本文具有同等貢獻