董珂珂　楊雪雨　趙騰騰　朱小蕾

(南京工業(yè)大學化工學院，材料化學工程國家重點實驗室，南京210009)

分子模擬方法研究四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物對GSK3β和CDK5的選擇性

董珂珂楊雪雨趙騰騰朱小蕾＊

(南京工業(yè)大學化工學院，材料化學工程國家重點實驗室，南京210009)

本文通過分子對接，分子動力學模擬(MD)和MM/PBSA能量計算的方法，從分子水平研究了3個四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物與CDK5和GSK3β的相互作用，并揭示了這些抑制劑對GSK3β的選擇性抑制機理。分子對接結果表明，抑制劑對2種激酶具有相似的結合模式，結合口袋處的殘基也都根據晶體結構的序列比對相互對應。研究體系的RMSD隨時間的穩(wěn)定變化，表明模擬體系已達到穩(wěn)定狀態(tài)，因而后續(xù)的分析是可靠的。CDK5/抑制劑體系，RMSD在0.15 nm上下波動，CDK5/M1和CDK5/M2骨架輕微波動，稍高于CDK5/M3；而GSK3β體系的RMSD值略高于CDK5體系，在0.17 nm上下波動，GSK3β/M1和GSK3ββ/M2的骨架波動平衡值則稍低于GSK3β/M3?；钚暂^大的抑制劑增強了蛋白骨架整體的“柔性”，即對激酶構象產生一定影響。能量分析表明，靜電能和范德華作用能夠區(qū)分不同抑制劑對同種激酶的生物活性差異。極性溶劑化自由能對區(qū)分抑制劑選擇性也很重要，殘基分解表明GSK3β的Glu97、Thr138是造成抑制劑選擇性的主要原因。抑制劑與CDK5和GSK3β結合的過程中，蛋白質殘基的動態(tài)相關性存在差異，鉸鏈區(qū)域的Thr138與Val135～Gln206區(qū)域殘基正相關，證實Thr138殘基是區(qū)分抑制劑選擇性的關鍵。

四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物；分子動力學模擬；選擇性；穩(wěn)定性

許多人類疾病通常都是由蛋白異常磷酸化所引起的。人類基因組中包含518種蛋白激酶，其中細胞周期素依賴性蛋白激酶(CDKs)和糖原合成激酶-3(GSK3)都屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族[1]，由于兩種激酶在大多數病理學中頻繁出現的反?，F象而引起關注。CDKs包含一個特定的絲氨酸/蘇氨酸催化位點，與調控分子的周期蛋白亞基一起控制激酶活性和亞基的特異性，能夠調控細胞周期循環(huán)的G1期、M期、S期、G2期的相互轉換以及影響其他酶的轉錄、復制，促進細胞分裂[2-4]，因此在細胞循環(huán)中起著重要作用。GSK3激酶由兩種單獨的基因編譯分別得到-α和-β兩種形式的激酶，通過磷酸化多種蛋白酶，參與多種生物學過程如干細胞自我更新、細胞分裂、細胞分化、細胞凋亡、生理節(jié)奏、轉錄和胰島素作用，其反常調節(jié)導致了許多代謝紊亂，神經系統(tǒng)疾病(如雙向性精神障礙、精神分裂癥和阿爾茲海默病(AD)等)以及癌癥的發(fā)生[5-8]。GSK3的兩種亞型激酶結構相似，但作用不同，GSK3活性的抑制通過保守性絲氨酸殘基GSK3α的Ser21和GSK3β的Ser9的磷酸化控制[9]，在ATP競爭性結合位點處也有氨基酸的差異(GSK3α的Glu196和GSK3β的Asp133)。

然而，神經系統(tǒng)疾病中，阿爾茲海默病是癡呆的最為普遍的形式，世界衛(wèi)生組織報道2015年，全世界近480萬人患上AD病，其主要病理為由tau蛋白過度磷酸化導致的神經元纖維纏結[10]，β淀粉樣多肽(Aβ)沉積導致的老年斑等有毒特性以及由神經元突觸和整個神經元缺失引起的腦萎縮[7]。而GSK3β的活化結構在AD患者中被發(fā)現，與聚集成雙螺旋絲的tau蛋白中tau的過度磷酸化直接相關[11]。當GSK3β被激活時，阿爾茲海默病患者的記憶能力衰退，影響突觸可塑性，損傷突觸的形態(tài)和功能[12]，同時還參與胞內和胞外通道，包括wnt信號和胰島素信號通道，以及G-蛋白偶聯受體和其他蛋白酶，主要通過磷酸化影響。另外，CDK5，作為CDKs家族的一員，不同于其他細胞周期素依賴性激酶涉及到細胞的增殖，細胞分裂等，其與激活因子p35和p39結合在神經元中達到高的活性，與通過鈣蛋白酶剪切得到的p25結合后導致CDK5的過度活化，導致AD病的發(fā)生；而相反CDK5的缺失則會抑制過度興奮，減少焦慮和記憶損傷[13]；CDK5與GSK3β類似在神經系統(tǒng)，突觸信號傳導以及學習和記憶過程中發(fā)揮重要作用[14]。幾個引起AD的因素如發(fā)炎和氧化應激也能夠導致CDK5活性增加?？偟恼f來，這些研究都強有力地表明CDK5與GSK3β在許多神經類疾病中都起著重要作用，目前都已成為治療多種病癥的重要靶標和新藥開發(fā)的熱點。

由于CDKs與GSK3β的結構相似性，不難發(fā)現大多數GSK3β的抑制劑同樣抑制CDKs，如Indirubin(靛玉紅類)[15]、Aloisines[16]、Hymenialdisine (生物堿類)[17]等。配體誘導的靶標蛋白來調控其活性在癌癥中已經成為有效的治療策略，然而受限于許多因素包括較差的靶向特異性和低的抑制潛能，選擇具有選擇性抑制劑能夠克服藥物抗性，減少毒副作用等[18]。目前研究的GSK3β而非CDK5的選擇性抑制劑有：Pyrazines(吡嗪類)[19]、Paullones(苯醌類)[20]和Valmerins(吡啶并吲哚酮類)[21-22]等。由于對GSK3β的選擇性機理并不明確也使得選擇性抑制劑的開發(fā)變得緩慢，并且實驗無法從分子水平詳細解釋，這就需要通過計算來解決。Dessalew等[23]用3D-QSAR和分子對接的方法研究了Bisarylmaleimide(二苯馬來酰亞胺)對于GSK3β的選擇性抑制，而對CDK2和CDK4活性較弱，通過打分評價了選擇性的定量差異以及與實驗的一致性。Chen等[20]用動力學模擬以及能量計算的方法研究了苯醌類抑制劑對于GSK3的選擇，計算表明了該抑制劑與GSK3的Val135殘基比與CDK5的Cys83殘基有更強的相互作用，同時與CDK5的Asp86殘基的相互作用較弱，導致了抑制劑的特異性，結構間的差異分析較少。然而吡啶并吲哚酮類抑制劑對GSK3β有較大的選擇性，但機理并不清楚。

本文用分子對接、分子動力學模擬、MM/PBSA (GBSA)能量計算，以及殘基間相互作用分析的方法首次深入研究由Rajaa Boulahjar合成的四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物[21]為什么對GSK3β抑制，而對結構和功能相似的CDK5卻有較低的抑制活性。這對于潛在的結構修飾以及開發(fā)更具潛力和選擇性的GSK3β的吡啶并吲哚酮抑制劑提供深入的指導。

1　實驗部分

1.1配體和受體結構準備

利用3D畫圖軟件構建3個四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物(圖1)，并在B3LYP/6-31G(d)水平上用Gaussian 09軟件[24]進行優(yōu)化得到最優(yōu)結構。通過Amber軟件[25]的Antechamber模塊擬合限制性靜電勢得到原子電荷以及其他的力場參數等，這種方法在許多文獻[26-28]中被證明是有效的。CDK5(Met1～Pro292)和GSK-3β(Ser35～Ile384)的晶體結構從蛋白質數據庫(the protein data bank)得到，PDB ID分別為1UNL[29]和2O5K[30]，分辨率為0.20 nm，刪除其中的水分子和抑制劑分子。CDK5的晶體結構為CDK5/p25二聚體，因此僅選取A鏈的CDK5和D鏈的p25作為對接的初始結構，以下簡寫為CDK5。

圖1　3個GSK3β選擇性抑制劑的結構和IC50[21]值Fig.1　Structures and in vitro activity of three specific inhibitors of GSK3β

1.2分子對接

小分子配體與受體的相互作用首先通過分子對接研究。分子對接采用Autodock4.0程序的半柔性對接方法，將極性氫原子添加到蛋白質的各個殘基上，配體的鍵可自由旋轉，受體則為剛性。將格點盒子的中心設在兩種激酶的ATP競爭性結合位點處，以使配體對接到此處，格點盒子大小設為90× 90×90，間隔為0.037 5 nm，用遺傳算法共進行200次獨立對接計算，其他參數默認，根據均方根偏差(RMSD)在0.20 nm范圍的標準聚類分析，得到最優(yōu)構象。且分別與含有R-roscovitine抑制劑的CDK5復合物(1UNL)，和含有抑制劑GSK3β的復合物比對，RMSD值都在0.10 nm內，因此證明對接結構也是合理的，為后續(xù)的MD分析奠定基礎。

1.3分子動力學模擬

在分子對接的基礎上，3個小分子抑制劑與兩種激酶形成的6個復合物體系采用Amber10[25]的Sander和Pmemd模塊進行MD模擬。與許多研究者[20,23,31-33]一樣，本文配體和受體分別采用GAFF力場[34]和AMBERFF03力場[35]，每個體系都融入被截斷的八面體的TIP3P水分子類型[36]的水盒子中，復合物與盒子邊界的最短距離為1 nm。氫原子通過LEaP模塊添加，殘基的質子化狀態(tài)在中性的pH值下采用默認，并添加抗衡離子(Na+或Cl-)使體系電荷呈中性。每個體系的能量最小化采用2 000步的最小化法和2 000步的共軛梯度法，非鍵截斷半徑設為1 nm。MD模擬過程主要包括200 ps的41 840 kJ·mol-1·nm-2)限制性加熱(0～300 K)，200 ps的密度平衡，200 ps的平衡以及在NPT系綜(P=101 kPa，T=300 K)下，時間步長為0.002 ps的20 ns未加限制的MD模擬。通過SHAKE算法[37]對氫原子在內的所有鍵固定，用Particle-mesh Ewald(PME)方法[38]處理長程靜電相互作用。MD軌跡坐標每1 ps保存一次用于每個體系的結構和能量分析。

1.4結合自由能計算

分子動力學模擬之后，通過每個體系的骨架原子的RMSD來評價其穩(wěn)定性。然后通過MM/PBSA (GBSA)方法[39]，取穩(wěn)定后的5 ns的軌跡，提取200個構象對抑制劑與兩種激酶的結合自由能計算來研究結合親和力的差異以及相同抑制劑與不同激酶的能量差異研究抑制劑選擇性。每個快照(snapshot)，配體與受體結合自由能差(ΔGbind)可表述為：

其中ΔGcomplex、ΔGprotein和ΔGligand)分別代表復合物、蛋白質以及配體的自由能。結合自由能又可分解為三部分：氣相結合能(ΔEgas)、溶劑化自由能(ΔGsol)和熵貢獻(TΔS)三部分(方程2)。ΔEgas又可進一步分解成靜電能(ΔEele)和范德華作用能(ΔEvdw)(方程3)。溶劑化自由能(ΔGsol)可以分為兩部分：極性溶劑化自由能(ΔGpolar)和非極性溶劑化自由能(ΔGnonpolar)(方程4)。極性溶劑化自由能通過amber10中的pbsa模塊解線性的PB(Poisson-Boltzmann)方程得到，溶劑探針半徑設為0.14 nm。溶質和溶劑的介電常數分別設為1和80。通過用Molsurf方法，可以得到溶劑可及表面積(SASA)，將溶劑參數γ和β分別設為0.226 77 kJ·mol-1·nm-1)和3.85 kJ·mol-1來計算非極性溶劑化自由能(ΔGnonpolar)(方程5)。由于抑制劑的選擇性主要在于CDK5和GSK3β之間的相似度，以及結合位點附近的殘基的差異。通過Clustal omega[24]軟件我們得到兩個序列的最佳比對，兩種激酶的序列一致性為29.0%，相似度為45.4%。另一方面，抑制劑對激酶的選擇性差異也在于兩種激酶相似位置的殘基對極性溶劑化自由能的貢獻差值，可以表述為(方程6)。一般說來，對于較大的體系計算熵非常耗時，并且對于相似的受體來說小分子的結合導致的熵變很接近[40-41]，為減少計算成本，許多文獻在計算過程都忽略了熵變[42-44]，本文我們也忽略熵變。

1.5動態(tài)相關性分析

為了評價不同蛋白區(qū)域之間的動態(tài)相關性，對3個抑制劑分別與CDK5和GSK3β結合的6個體系進行了動態(tài)相關性Dynamic Cross-Correlation Map(DCCM)分析[45-46]。兩個原子i和j之間的相關系數Cij定義為：

其中ΔRi表示第i個原子相對于它的平均位置的瞬時波動。正相關表示殘基以相同的方向運動，Cij=1；負相關表示殘基以相反方向運動，Cij=-1。整個20 ns模擬過程中，最低能量結構用于DCCM分析。PyMol v1.8軟件[47]用于蛋白質結構作圖分析。

2　結果與討論

2.1對接構象結合模式

3個四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物抑制劑對接到CDK5和GSK3β的ATP競爭性結合口袋中(圖2)，發(fā)現兩者具有相似的折疊結構，且結合位點也非常相似，都有一個很大的空腔，由周圍殘基(CDK5：I10、C83、L133和N144；GSK3β：I62、V135、L188和D200)包圍，主鏈原子疊合得都很好，與晶體結構的序列比對一致[20]。由圖2可知，在3個抑制劑與CDK5的對接結構中，3個抑制劑都處于由殘基Ile10、Glu12、Gly13、Val18、Ala31、Glu81、Phe82、Cys83、Asp84、Asp86、Gln130、Leu133和Asn144組成的疏水口袋中。與之相比，與GSK3β對接的復合物結構中，3個抑制劑位于由Ile62、Val70、Ala83、Asp133、Tyr134、Val135、Pro136、Gln185、Asn186、Leu188和Asp200組成的疏水性口袋中，這與其他文獻的對接研究結果一致[48]。值得注意的是，CDK5與M1和M2的相互作用殘基都有Lys33、Gln85、Lys89，而CDK5/M3復合物中則沒有，另外，小分子M1周圍的CDK5殘基數目相比M2和M3也是最多的。說明這幾個殘基對于抑制劑與激酶的結合比較關鍵，相應地，GSK3β的Lys85、Glu137、Arg141殘基也有此功能。

2.2體系的穩(wěn)定性和柔性分析

由對接構象可知，抑制劑與激酶之間形成的氫鍵作用使得復合物體系更加穩(wěn)定。結合抑制劑不同結構構象也有差異，且抑制劑與激酶結合過程也是動態(tài)的，這也造成了動力學特性包括穩(wěn)定性和柔性發(fā)生變化，結合自由能也由于抑制劑活性與選擇性的不同而不同。因此，本文對3個抑制劑與CDK5和GSK3β結合的6個體系在300 K下進行了20 ns的分子動力學模擬。在15 ns后，6個體系均達到平衡(圖3)。因而后續(xù)的能量和結構分析是可靠的。對CDK5/抑制劑體系，RMSD在0.15 nm上下波動，CDK5/M1和CDK5/M2骨架輕微波動，稍高于CDK5/M3，表明活性較大的抑制劑增強了蛋白骨架的“柔性”；而對GSK3β體系，RMSD在0.17 nm上下波動，GSK3β/M1和GSK3β/M2的骨架波動平衡值則稍低于GSK3β/M3。這表明3個抑制劑對2個激酶體系的活性差異有著不同機理。

圖2　CDK5/抑制劑(藍色)和GSK3β/抑制劑(紅色)對接后結構中ATP結合口袋的疊加Fig.2　Superimposition of the ATP-binding pocket of the CDK5/inhibitor(blue)and GSK3β/inhibitor(red)structures after dock

蛋白質柔性也由平均結構的均方根波動(RMSF)來評判，通過RMSF值也可以判斷MD模擬過程是否收斂。本文我們計算了6個體系的蛋白質骨架原子上的RMSF值，結果如圖4所示?？傮w上，所有體系的蛋白質結構與實驗晶體結構的RMSF值(由B-factor換算得到)分布基本一致。兩種蛋白質柔性略有差異，而3個抑制劑與兩種激酶的結合位點處的RMSF值相比幾乎沒變化，都略小于實驗中CDK5的RMSF值，表明活性區(qū)域有較高的剛性，活性越大，剛性也越強。GSK3β結構符合觀察到的“活化片段”蛋白激酶，包含一個N端的β-sheet區(qū)域和一個C端的α-helical區(qū)域。7個反平行的β折疊形成一個封閉的正交桶狀結構，即N端(Ser35～Tyr134)，其中在3個抑制劑與GSK3β結合的復合物中較為顯著的β5和β6連接的loop區(qū)域(Ser119～Glu125)，因其活性不同表現了不同的柔性，GSK3β/M3的RMSF值最高，柔性最大；參與催化活化區(qū)域(Gly210～Arg220)無論磷酸化與否，結構都處于活化狀態(tài)[49]，從圖4中也可以看出與3個抑制劑結合都表現了很強的剛性；結構可塑性延伸的loop區(qū)域(Asn285～His299)的柔性變化也與抑制劑活性相關，正如Dajani等[50]研究的axin和FRAT抑制劑與GSK3β結合造成的柔性不同，我們發(fā)現活性越大，剛性越強。側鏈殘基Ile62(G-loop區(qū)域)和Hinge區(qū)域的Val135殘基的柔性變化都不大。這些區(qū)域對于抑制劑的選擇性也有一定的影響。抑制劑翻轉或者其他構象改變引起的范德華或靜電作用將對結合有一定影響。

圖3　GSK3β和CDK5兩激酶與3個抑制劑形成的復合物的RMSD值隨時間的變化Fig.3　RMSD of backbone atoms of two kinases(GSK3β and CDK5)with three inhibitors as a function of time

圖4　CDK5(左)和GSK3β(右)的每個殘基主鏈原子對應的RMSF變化Fig.4　Root-mean-squared fluctuation(RMSF)of the backbone atoms of each amino acid residue of CDK5(left)and GSK3β(right)

回旋半徑是蛋白質致密性(compactness)的一個指標[51-52]，為了更直觀地從整體上了解抑制劑對蛋白質分子尺寸的影響，本文通過回旋半徑(Radius of Gyration，Rg)的計算研究了CDK5和GSK3β兩種激酶殘基的致密程度。CDK5/抑制劑復合物的回旋半徑平均值為2.364 nm±0.005 nm，這與前人計算得到的CDK5/p25/roscovitine復合物體系的Rg(2.384 nm±0.008 nm)，CDK5/p25的Rg(2.360 nm±0.008 nm)較一致，同時與實驗結果(Rg(CDK5/p25/roscovitine)：2.347 nm)[53]也沒有很大差異。GSK3β/抑制劑體系的Rg平均值為2.145 nm±0.008 nm，3個體系Rg值較為類似，但稍小于CDK5體系，這也是由于CDK5/ p25蛋白質殘基數目較多導致的。結果表明兩種激酶體系并未因為抑制劑的結合而導致蛋白質殘基的致密性發(fā)生變化，模擬過程中蛋白也是穩(wěn)定的。

2.3抑制劑對CDK5和GSK3β的生物活性

抑制劑與激酶的結合自由能計算是衡量抑制劑活性的重要方法，且計算得到的結合自由能與實驗活性值比較更進一步判斷計算的適用性和準確性。MM/PBSA方法和MM/GBSA方法是計算結合自由能的常用方法，許多研究工作者用MM/PBSA的方法計算結合自由能[39,54-55]，且研究證明MM/PBSA方法比MM/GBSA方法更加準確[54]。本文我們用MM/PBSA的方法計算了6個復合物體系的結合自由能以及不同能量項，結果列在表1中。表1中的能量值，正數表示這種作用不利于抑制劑與激酶的結合，負數表示這種作用使體系能量降低，有利于結合，負數絕對值越大，表示這種作用對結合的貢獻越大。

M1～M3對CDK5的結合自由能分別為：-107.57、-89.75、-68.95 kJ·mol-1，與實驗中抑制劑生物活性(IC50值分別為0.13、1.24、1.5 nmol·mL-1)一致；對GSK3β的結合自由能分別為：-109.04、-92.72、-91.88 kJ·mol-1，同樣與實驗中的抑制劑抑制活性(IC50值分別為0.076、0.12、0.38 nmol·mL-1) (圖1)[21]相一致。同時3個抑制劑也表現出了對GSK3β的選擇性。為了深入了解哪部分相互作用引起了抑制劑與2種激酶的結合，我們分析了各個能量項對結合親和力的貢獻大小。如表1所示，靜電能(ΔEele)、范德華作用項(ΔEvdW)和非極性溶劑化自由能(ΔGnonpolar)對結合是有利的。6個體系中，范德華作用都起主導作用。對于GSK3β體系，范德華作用能區(qū)分3個抑制劑的生物活性，而對CDK5體系，CDK5/M2和CDK5/M3的極性溶劑化自由能可區(qū)分其生物活性。盡管氣相的靜電能(ΔEele)對結合是有利的，但也不能完全抵消極性溶劑化自由能(ΔGpolar)對結合的不利影響。所有體系的非極性溶劑化自由能差別都不大。

表1　用MM-PBSA方法計算得到的蛋白質-配體復合物的結合自由能項aTable1　Binding free energy components for the proteininhibitor complexes by using the MM-PBSA methoda

為了深入地研究蛋白質的每個殘基在抑制劑的結合中發(fā)揮的作用，我們對每個殘基進行了能量分解。6個體系分解到每個殘基的結合自由能如圖6和圖9所示。圖6中我們列出了能量小于-4.184 kJ·mol-1的殘基，M1與GSK3β的結合親和力主要作用殘基為I62、Val70、Lys85、Thr138、Leu188和Cys199，M3的關鍵殘基與M1的類似，而M2的關鍵殘基則略有不同，Lys85殘基貢獻變小，這可能是因為M1與M3結構(用嘧啶基取代M1中的3-溴吡啶基)較為相似，而與M2骨架有較大差別有關。M2的可旋轉鍵較少，有極性基團的甲基磺酰基，盡管磺酰基和羰基大小相似，并有相似的電荷分布，但其提供2個氫鍵受體，在復合物中，伸向帶正電荷極性Lys85殘基(圖7)，兩者間作用力則較弱。另外，Lys85殘基對3個抑制劑結合的貢獻大小在能量上也體現在靜電作用，其靜電能分別為：-38.79、-14.14、-33.39 kJ·mol-1，這個差異主要是抑制劑骨架結構不同造成的。

由上述總的自由能和自由能分解項可知，范德華作用主要區(qū)分抑制劑對GSK3β的生物活性，因此我們計算了每個殘基的范德華作用能貢獻，如圖8所示，GSK3β/M1～M3復合物針對范德華作用貢獻的關鍵殘基由活性的減小而減小，計算所得與實驗測得的生物活性相符。GSK3β/M1的關鍵殘基為：Ile62、Val70、Tyr134、Thr138、Arg141、Leu188和Cys199，與兩外兩種復合物相比，作用主要集中在殘基Ile62、Val70、Leu188和Cys199。與總的結合能殘基分解相一致。

我們研究的3個抑制劑對CDK5和GSK3β兩種激酶都有選擇性，CDK5/M1復合物體系對能量的殘基分解顯示的關鍵殘基要少于GSK3β/M1體系，主要表現在殘基：Gly11、Val18、Phe80、Gln130、Asn131、Leu133和Asn144(圖9)，其中Val18和Leu133幾乎與GSK3β/M1的Val70和Leu188殘基發(fā)揮同樣的作用。CDK5/M1與CDK5/M3的關鍵殘基相似，說明有相似的相互作用，而CDK5/M2中Ile10殘基還對結合有較大的貢獻，其他2種復合物則沒有。另外Lys33殘基在CDK5/M1中起著不利作用，對應于GSK3β中的Lys85殘基，是區(qū)分選擇性的關鍵性殘基。

圖6　抑制劑(M1、M2和M3)與GSK3β的每個殘基之間的相互作用能Fig.6　Interaction energies between inhibitors(M1,M2 and M3)and each individual residue of GSK3β

圖7　3個復合物MD后最低能量結構構象圖Fig.7　Conformations with lowest energy after MD simulations for three complexes

圖8　抑制劑(M1、M2和M3)與GSK3β復合物抑制劑-殘基的范德華作用Fig.8　Van der Waals interaction energy of inhibitor-residue pair in GSK3β/inhibitor complexes

由上述圖1和表1的能量項分解可知，盡管M1和M3有著較小的差別，其靜電能和范德華能都能夠區(qū)分其生物活性。對于M1和M2來說，結構骨架差異較大，但也能通過這兩項來區(qū)分。對于結構極為相似的抑制劑M1和M3，其范德華作用主要殘基也是相似的(圖10)，其中主要區(qū)分其生物活性的殘基是：Asn131和Asn144。這與后續(xù)的氫鍵分析一致，同時與M1和M3兩個抑制劑的結構差異有關(M1中的3-溴吡啶基和M3中的嘧啶基的差異)。

前面，我們從能量的角度揭示了靜電作用和范德華作用如何影響抑制劑對激酶的生物活性。下面我們將更詳細地分析這些作用對抑制劑的生物活性的影響。如圖11所示，我們用Ligplot+程序[56]討論2種激酶和抑制劑的結合模式。CDK5/M1體系中，M1與相鄰殘基形成了2個穩(wěn)定的氫鍵。一個形成于M1的連接四氫吡啶并吲哚酮大環(huán)和吡啶環(huán)的骨架氮原子(N14)與Gln130的氧原子之間，另一個形成于M1中的連接3-溴吡啶基的氮原子(N15)與Gln130的氧原子之間；整個模擬過程中氫鍵占有率分別為98.15%和96.62%，鍵長平均為0.298和0.289 nm，且是穩(wěn)定存在的(圖12)。此外，M1還與周圍殘基形成了疏水作用，3-溴吡啶基與Glu12、Gln130和Asn144殘基之間的疏水作用；四氫吡啶并吲哚酮大環(huán)則與Ile10、Val18、Ala31、Asp86和Leu133殘基形成疏水作用。而GSK3β的更多的殘基與M1產生疏水作用，3-溴吡啶基與Ile62、Tyr134、Pro136和Arg141；四氫吡啶并吲哚酮大環(huán)與Val70、Ala83、Lys85、Leu132、Tyr134、Pro136、Gln185、Asn186、Leu188和Cys199殘基形成的疏水作用，發(fā)現相同基團產生的疏水作用卻是不同的，表明M1與GSK3β結合時發(fā)生了翻轉，且對GSK3β表現出了選擇性。

圖9　抑制劑(M1、M2和M3)與CDK5的每個殘基之間的相互作用能Fig.9　Interaction energies between inhibitors(M1,M2 and M3)and each individual residue of CDK5

圖10　抑制劑(M1和M3)與CDK5復合物抑制劑-殘基的范德華作用Fig.10　Van der Waals interaction energy of inhibitor-residue pair in CDK5/inhibitor complexes

圖11　氫鍵和疏水作用二維圖Fig.11　2D representation of hydrogen bond and hydrophobic interaction

M2與CDK5形成了3個氫鍵，其中2個是與咪唑基相連的羰基氧原子(O20)和氮原子(N21)分別與Cys83殘基的N原子和Asp86殘基上的氧原子(OD1)之間形成的氫鍵(表2)。另外1個則是磺?；难踉?O24)與Glu12上的氧原子形成的氫鍵，LigPlot+的氫鍵二維圖顯示M2與GSK3β也形成3個氫鍵，與M2有疏水作用的殘基相比CDK5來說也是增多的。M3與2種激酶的疏水作用殘基數目一樣，M3的嘧啶環(huán)與CDK5中的Gly13、Lys33、 Phe80、Asn131和Asn144有疏水作用，而在GSK3β中則是Ile62、Tyr134、Val135、Pro136和Arg141殘基，與CDK5中殘基Lys33序列比對的GSK3β中的殘基Lys85與M3形成了氫鍵，盡管氫鍵占有率較低，但最終是穩(wěn)定的。抑制劑與2種激酶的結合模式分析表明，GSK3β中的Lys85殘基對于區(qū)分選擇性比較關鍵。

2.4抑制劑對GSK3β的選擇性

基于上述能量分解，我們發(fā)現極性溶劑化自由能能夠區(qū)分抑制劑對于GSK3β的選擇性。盡管極性溶劑化自由能對結合是不利的，但對比CDK5和GSK3β兩種激酶與抑制劑的復合物發(fā)現，CDK5與抑制劑之間的極性溶劑化自由能對結合更加不利。這是由兩種激酶結構差異導致的極性溶劑化自由能的差異，而這體現了四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物對GSK3β的選擇性。

圖12　抑制劑與CDK5之間形成的H鍵的距離隨MD模擬的時間變化Fig.12　Interatomic distances in the course of the MD simulations show the stability of formed hydrogen bonds between three inhibitors(M1,M2 and M3)and CDK5

表2　抑制劑與CDK5和GSK3β之間形成的氫鍵Table2　Hydrogen bonds formed between inhibitors and CDK5 or GSK3β

基于2個激酶的序列比對，我們通過比對殘基的極性溶劑化自由能貢獻的差值來研究抑制劑的選擇性，如圖13所示。縱坐標為了能量間隔顯示一致，對于M2抑制劑，GSK3β的Thr138與CDK5的Gln85殘基的差值被截斷，實際值為-39.75 kJ· mol-1。M1～M3比較，從圖中不難發(fā)現，GSK3β的Glu97、Thr138是造成抑制劑選擇性的主要原因，而Lys85則對于抑制劑對GSK3β的選擇性不利。這與前邊活性和結構差異的討論一致。那么通過減小抑制劑對GSK3β中的Glu97和Thr138的不利作用，即增強抑制劑極性，理論上可以提高抑制劑對GSK3β的特異性。

通過上述能量分析我們了解到抑制劑與兩種激酶的相互作用機制以及抑制劑對GSK3β的選擇性機制，而在抑制劑與同源性很強的CDK5和GSK3β結合的過程中，其對兩種激酶本身結構，即激酶中各殘基間的相互作用影響的差異也是造成抑制劑選擇性的重要因素。為此我們針對M1采用了動態(tài)相關性分析(DCCM)，如圖14所示。M1與兩種激酶結合時，CDK5的Ile10～Arg36殘基與GSK3β的Ile62～Val70的相關性比較類似，差別較大的則是Val135～Val272區(qū)域蛋白質殘基的相關性，這些殘基所對應的CDK5的區(qū)域則是Cys83～Leu217殘基。對于GSK3β的這部分區(qū)域幾乎都是正相關的，蛋白質殘基運動方向一致，包括鉸鏈(Hinge)區(qū)域的Val135和Thr138與Val135～Gln206區(qū)域殘基的運動一致。而對應于CDK5的這部分區(qū)域則不顯著。這從蛋白質結構本身也說明了GSK3β的Thr138殘基在篩選CDK5和GSK3β的選擇性抑制劑中的重要性。

圖13　GSK3β和CDK5之間的相對每個殘基對的極性溶劑化自由能的差異Fig.13　Difference in the polar solvation energies ΔΔGpolbetween GSK3β and CDK5 as a function of residue index

圖14　GSK3β/M1和CDK5/M1的動態(tài)相關性(DCCM)分析Fig.14　Dynamic cross-correlation map(DCCM)analyses for GSK3β/M1 and CDK5/M1

3　結論

本文通過分子對接，分子動力學模擬(MD)、MM/ PBSA能量計算以及蛋白質結構的分析相結合的方法，從分子水平研究了3個四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物與CDK5和GSK3β的相互作用，并揭示了該抑制劑對GSK3β的選擇性抑制機理。分子對接結果表明，抑制劑對2種激酶具有相似的結合模式，結合口袋處的殘基也都根據序列比對相互對應。GSK3β體系的平均RMSD值(0.17 nm)略高于CDK5體系(0.15 nm)，且活性較大的抑制劑RMSD值較低，因為活性較大的抑制劑增強了蛋白骨架整體的“柔性”，即對激酶構象產生影響一定影響。能量分析表明，靜電能和范德華作用能夠區(qū)分不同抑制劑對同種激酶的生物活性差異。極性溶劑化自由能對區(qū)分抑制劑選擇性很重要，殘基分解表明GSK3β的Glu97、Thr138是造成抑制劑選擇性的主要原因。而CDK5和GSK3β在與抑制劑結合過程蛋白質殘基的動態(tài)相關性也存在差異，鉸鏈區(qū)域的Thr138與Val135～Gln206區(qū)域殘基正相關，證實Thr138殘基是區(qū)分抑制劑選擇性的關鍵。本文采用分子動力學模擬的方法從結構和能量方面較好地解釋了四氫化吡啶并[1，2-a]吲哚酮衍生物對GSK3β的選擇性抑制機理，為改善GSK3β選擇性抑制劑提供數據和理論指導。

[1]Frame S,Cohen P.Biochem.J.,2001,359:1-16

[2]Nurse P,Masui Y,Hartwell L.Nat.Med.,1998,4:1103-1106

[3]Sherr C J.Science,1996,274:1672-1677

[4]Hunt T.Biosci.Rep.,2002,22:465-486

[5]Li X,Lu F,Tian Q,et al.J.Neural Transm.,2005,113:93-102

[6]Vougolkov A,Dbilladeau D.Future Oncol.,2006,2:91-100

[7]Mondragon-Rodriguez S,Perry G,Zhu X,et al.Int.J. Alzheimer′s Dis.,2012,2012:1-4

[8]Rix L L,Kuenzi B M,Luo Y,et al.ACS Chem.Biol.,2014,9: 353-358

[9]Fang X,Yu S X,Lu Y,et al.PNAS,2000,97:11960-11965

[10]Goedert M,Spillantini M G,Crowther R A.Brain Pathol., 1991,1:279-286

[11]Leroy K,Boutajangout A,Authelet M,et al.Acta Neuropathol., 2002,103:91-99

[12]Bradley C A,Peineau S,Taghibiglou C,et al.Front.Mol. Neurosci.,2012,5:1-11

[13]Rudenko A,Seo J,Hu J,et al.J.Neurosci.,2015,35:2372-2383

[14]Engmann O,Giese K P.Front.Mol.Neurosci.,2009,2:1-5

[15]Leclerc S,Garnier M,Hoessel R,et al.J.Biol.Chem.,2001, 276:251-260

[16]Mettey Y,Gompel M,Thomas V,et al.J.Med.Chem.,2003, 46:222-236

[17]Tnguyen T,Jtepe J.Curr.Med.Chem.,2009,16:3122-3143

[18]Crunkhorn S.Nat.Rev.Drug Discovery,2015,14:457-457

[19]Berg S,Bergh M,Hellberg S,et al.J.Med.Chem.,2012,55: 9107-9119

[20]Chen Q,Cui W,Cheng Y,et al.J.Mol.Model.,2011,17: 795-803

[21]Boulahjar R,Ouach A,Matteo C,et al.J.Med.Chem.,2012, 55:9589-9606

[22]Ouach A,Boulahjar R,Vala C,et al.Eur.J.Med.Chem., 2016,115:311-325

[23]Dessalew N,Bharatam P V.Eur.J.Med.Chem.,2007,42: 1014-1027

[24]Larkin M,Blackshields G,Brown N P,et al.Bioinformatics, 2007,23:2947-2948

[25]Case D A,Cheatham T A,Simmerling C L.AMBER 10, University of California.San Francisco:San Francisco,CA, 2008.

[26]Bayly C I,Cieplak P,Cornell W D,et al.J.Phys.Chem., 1993,97:10269-10280

[27]Cieplak P,Cornell W D,Bayly C,et al.J.Comput.Chem., 1995,16:1357-1377

[28]Fox T,Kollman P A.J.Phys.Chem.B,1998,102:8070-8079

[29]Mapelli M,Massimilinao L,Crovace C.J.Med.Chem., 2005,48:671-679

[30]Shin D,Lee S C,Heo Y S,et al.Bioorg.Med.Chem.Lett., 2007,17:5686-5689

[31]Zhao P,Li Y,Gao G,et al.Eur.J.Med.Chem.,2014,86: 165-174

[31]Wu Q,Kang H,Tian C,et al.Mol.Inf.,2013,32:251-260

[33]Aixiao L,Florent B,Franois M,et al.J.Mol.Struct. THEOCHEM,2008,849:62-75

[34]Wang J,Wolf R M,Caldwell J W,et al.J.Comput.Chem., 2004,25:1157-1174

[35]Cornell W D,Cieplak P,Bayly C I,et al.J.Am.Chem. Soc.,1995,117:5179-519

[36]Shiekhattar R,Mermelstein F H,Fisher R P,et al.Nature, 1995,374:283-287

[37]Ryckaert J,Ciccotti G,Cberendsen H.J.Comput.Phys., 1977,23:327-341

[38]Darden T,Myork D,Gpedersen L.J.Chem.Phys.,1993,98: 10089-10092

[39]Hou T,Wang J,Li Y,et al.J.Chem.Inf.Model.,2011,51: 69-82

[40]Andricioaei I,Karplus M.J.Chem.Phys.,2001,115:6289-6292

[41]Gu Y,Wang W,Zhu X,et al.J.Mol.Model.,2014,20:1-12 [42]Andricioaei I,Karplus M.J.Chem.Phys.,2001,115:6289-6292

[43]Wang W,Cao X,Zhu X,et al.J.Mol.Model.,2013,19: 2635-2645

[44]Sa R,Fang L,Huang M,et al.J.Phys.Chem.A,2014,118: 9113-9119

[45]Li C,Ma N,Wang Y,et al.J.Phys.Chem.B,2014,118: 1273-1287

[46]Ichiye T,Karplus M.Proteins,1991,11:205-217

[47]Schrodinger LLC.PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8,2015.

[48]Pradeep H,Rajanikant G K.Mol.Diversity,2012,16:553-562

[49]Dajani R,Fraser E,Roe S M,et al.Cell,2001,105:721-732

[50]Dajani R,Fraser E,Roe S M.EMBO J.,2003,22:494-501

[51]Lobanov M Y,Bogatyreva N S,Galzitskaya O V.Mol.Biol., 2008,42:623-628

[52]ZHANG Chuan(張川),ZHANG Lu-Jia(張魯嘉),ZHANG Yang(張洋),et al.Acta Chim.Sinica(化學學報),2016,74: 74-80

[53]Otyepka M,Bartova I,Kriz Z,et al.J.Biol.Chem.,2006, 281:7271-7281

[54]Safi M,Lilien R H.J.Chem.Inf.Model.,2012,52:1529-1541

[55]Zhan D,Yu L,Jin H,et al.Int.J.Mol.Sci.,2014,15:17284-17303

[56]Laskowski R A,Swindells M B.J.Chem.Inf.Model.,2011, 51:2778-2786

Exploring the Selectivity of Tetrahydropyrido[1,2-a]isoindolone Derivatives to GSK3β and CDK5 by Computational Methods

DONG Ke-Ke YANG Xue-Yu ZHAO Teng-Teng ZHU Xiao-Lei＊
(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Chemical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China)

Tetrahydropyrido[1,2-a]isoindolone derivatives are potent inhibitors of glycogen synthase kinase 3β (GSK3β)instead of homologous cyclin-dependent kinase 5(CDK5).Molecular docking,molecular dynamics simulation,and MM/PBSA energy calculation are utilized to reveal the kinase inhibitors′selective mechanism at the molecular level for improving selectivity.Dynamic cross-correlation map(DCCM)analysis is applied to study the effect of the inhibitor on the interactions between each residue in CDK5 and GSK3β.The results of molecular docking indicate that the binding modes of three inhibitors with two kinases are especially similar,and residues in the binding pockets of two kinases are aligned with each other based on the sequence comparing analysis of crystal structures.The analysis of Root Mean Square Deviation(RMSD)with little fluctuation underlies the stability and reliability of systems.Its values of CDK5(～0.15 nm)are less than GSK3β(～0.17 nm),and the inhibitor with higher value holds stronger flexibility and conformational changes of kinases.In terms of energies,the electrostatic and van der Walls energies are the major interactions for differentiating the activity between thesame inhibitor and two kinases.And the polar solvation energy plays pivotal role in discriminating the selectivity of kinase inhibitor.The residue decomposition indicates that the residues Glu97 and Thr138 of GSK3β are the key residues for differentiating the inhibitor selectivity.On the other hand,in the aspect of inter-residue interaction in one kinase,results indicate that the dynamic correlation of residues is different during the binding process of CDK5 and GSK3β with inhibitors.The correlation of Thr138 in the hinge domain of GSK3β with that of residues Val135～Gln206 is positive,while the correlation of Gln85 and Cys83～Ala150 in CDK5 is unclear,which is a key factor to distinguish inhibitor selectivity.

tetrahydropyrido[1,2-a]isoindolone derivatives;molecular dynamics simulation;selectivity;stability

中國分類號：O643.1A

1001-4861(2016)11-1919-12

10.11862/CJIC.2016.263

2016-05-11。收修改稿日期：2016-09-12。

國家自然科學基金(No.20706029，20876073，91434109)資助項目。＊通信聯系人。E-mail：xlzhu@njtech.edu.cn