李珣+尚建超+藍(lán)瀟+田學(xué)軍+沈登榮

摘要：為尋找有機(jī)磷農(nóng)藥的快速降解途徑，采集污染嚴(yán)重的土樣，以毒死蜱為底物，采用梯度馴化法篩選得到菌株CJC-3，并研究該菌株對(duì)毒死蜱及其他4種常用有機(jī)磷農(nóng)藥（敵敵畏、辛硫磷、乙酰甲胺磷、草甘膦）的降解特性。結(jié)果表明，CJC-3對(duì)毒死蜱的最佳降解條件：溫度為28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，農(nóng)藥濃度為2 000 mg/L，降解率達(dá)76.03%。優(yōu)化CJC-3對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥的降解條件后，降解率分別為敵敵畏50.47%、辛硫磷65.29%、乙酰甲胺磷26.15%、草甘膦36.12%，表明該菌株對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑和有機(jī)磷除草劑均有一定的降解效果，適用于有機(jī)磷農(nóng)藥的普遍降解。

關(guān)鍵詞：毒死蜱；有機(jī)磷農(nóng)藥；降解菌；降解特性

中圖分類號(hào)： X592 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0479-03

據(jù)報(bào)道，2013年我國(guó)農(nóng)藥總使用量達(dá)到12萬(wàn)t，其中有機(jī)磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥使用量分別為86 300、5 800、3 600 t[1]。有機(jī)磷類農(nóng)藥已成為三大支柱之一，在世界的農(nóng)藥市場(chǎng)上有著十分重要的地位[2]。其中，毒死蜱是當(dāng)今有機(jī)磷農(nóng)藥中的代表性品種，現(xiàn)在我國(guó)約有15%的農(nóng)藥廠家擁有毒死蜱相關(guān)產(chǎn)品，按每個(gè)品種的平均原藥需求量10～15 t 計(jì)算，我國(guó)約有6 000～9 000 t的原藥需求量[3]。農(nóng)藥的使用在帶來(lái)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民增收的同時(shí)，農(nóng)藥殘留已成為嚴(yán)重危害人類生命健康的主要因素之一，如何消除其對(duì)生態(tài)環(huán)境造成的不良影響就成為了不得不考慮的問(wèn)題。目前根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究，認(rèn)為微生物降解是解決其殘留污染的有效途徑[4]，如董慶龍等通過(guò)改良定向培育法，馴化篩選到毒死蜱降解菌CAS17，當(dāng)毒死蜱濃度為100 mg/L 以下時(shí)，降解率可達(dá)到67%左右[5]。馮發(fā)運(yùn)等從農(nóng)藥廠廢液池旁采集小飛蓬植物，提取植物汁液后以毒死蜱作為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基連續(xù)篩選，得到1株高效降解菌XFP-gy，當(dāng)毒死蜱濃度為10 mg/L時(shí)，9 d可完全降解毒死蜱，實(shí)現(xiàn)無(wú)殘留[6]。本試驗(yàn)通過(guò)馴化、篩選得到毒死蜱降解菌，并探索其降解特性以提高對(duì)毒死蜱的降解率，同時(shí)還研究了該菌株對(duì)其他常用有機(jī)磷農(nóng)藥包括殺蟲劑和除草劑的降解效果，期望為有機(jī)磷農(nóng)藥的廣泛修復(fù)提供一定參考[7]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 云南曲靖蔡家沖復(fù)合化肥廠周邊土壤，采用五點(diǎn)采樣法。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）基本培養(yǎng)基：葡萄糖2.5 g、檸檬酸三鈉0.5 g、（NH4）2SO4 0.1 g、KH2PO3 3.0 g、K2HPO3 7.0 g、MgSO4 0.1 g、H2O 500 mL、瓊脂10.0 g，121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min。（2）無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO4 0.2 g、NH4NO31.0 g、K2HPO30.5 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO3 0.5 g、NaCl0.2 g、MnSO4 痕量、FeCl2 痕量、H2O 1000.0 mL，121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min。（3）富集培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g、氯化鈉 5.0 g、牛肉膏 5.0 g、瓊脂 20.0 g、H2O 1000.0 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min[8-10]。

1.2 方法

1.2.1 菌種馴化 取5.0 g土樣，用含毒死蜱4 mg/L的無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基于30 ℃、170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h；取10%轉(zhuǎn)接至新鮮無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中并將農(nóng)藥濃度提高1倍，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h；隨后加入5 mL含有機(jī)磷農(nóng)藥的原液，培養(yǎng)5個(gè)周期，共240 h [9-10]。

1.2.2 菌種分離純化 取100 μL馴化得到的土壤懸濁液涂布于基本培養(yǎng)基表面，經(jīng)培養(yǎng)后觀察，挑取不同形態(tài)的菌落，分離純化。配置毒死蜱濃度為8 mg/mL選擇培養(yǎng)基，將分離純化后的降解菌菌株接種于選擇培養(yǎng)基上，保存?zhèn)溆肹9-10]。

1.2.3 CJC-3菌株形態(tài)特征和主要生理生化特征 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)CJC-3的菌落形態(tài)特征及主要生理生化特征進(jìn)行試驗(yàn)和觀察記錄[11-12]。

1.2.4 CJC-3對(duì)毒死蜱的降解特性研究

分別研究培養(yǎng)時(shí)間、溫度、毒死蜱濃度、接種量對(duì)CJC-3降解的影響因素，以確定其最佳降解條件與最大降解率。設(shè)置時(shí)間梯度分別是6、12、18、24、36、48、60、72 h；溫度梯度分別是25、28、30、35、40 ℃；毒死蜱農(nóng)藥濃度分別是500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L；接種量分別為0.5%、1%、5%、10%、20%。按上述條件將培養(yǎng)管置于恒溫?fù)u床中170 r/min培養(yǎng)，得出最佳降解條件，利用鉬銻抗法測(cè)定復(fù)合菌劑的降解率[9-10，13]。

1.2.5 CJC-3對(duì)其他常用有機(jī)磷農(nóng)藥的降解特性研究

分別設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間24、36、48、60、72 h；培養(yǎng)溫度20、24、28、32、36 ℃；敵敵畏濃度20、40、60、80、160、240、320、400、480 mg/L；辛硫磷濃度100、140、180、220、260、300、340、380 mg/L；乙酰甲胺磷濃度60、120、180、240、300、360、420、480、540 mg/L；草甘膦濃度40、80、120、160、200、240、280、320 mg/L。將培養(yǎng)管置于恒溫?fù)u床中170 r/min培養(yǎng)，測(cè)定降解效率，得出最佳降解條件[7，10，13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌的分離純化

經(jīng)過(guò)分離、純化得到1株高效降解菌，編號(hào)為CJC-3。

2.2 CJC-3菌株形態(tài)特征和主要生理生化特征

經(jīng)初步生理生化鑒定后，CJC-3于選擇培養(yǎng)基上的單菌落呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，菌體隆起，邊緣整齊不透明。初生時(shí)為白色，生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)后為乳白色，菌體挑取時(shí)有黏著性，劃線時(shí)不易劃開，菌體常多個(gè)連在一起，呈短桿狀，菌體平均直徑為4.70 μm，革蘭氏反應(yīng)呈陽(yáng)性，存在芽孢和莢膜，為好氧菌。

2.3 CJC-3菌株對(duì)毒死蜱的降解特性

2.3.1 毒死蜱降解時(shí)間優(yōu)化

如圖1所示，當(dāng)降解時(shí)間較短時(shí)，CJC-3菌株數(shù)量少、生長(zhǎng)緩慢，菌株降解活性低，隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體利用培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分大量繁殖，CJC-3菌株對(duì)于毒死蜱的降解能力也逐漸增強(qiáng)、降解率明顯上升，于48 h時(shí)降解率達(dá)到最大；在48 h后，可能由于營(yíng)養(yǎng)成分的消耗、降解后的有機(jī)磷被菌體重新利用、菌體老化等原因，降解率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為48 h時(shí)，降解率最高，為57.01%。

2.3.2 毒死蜱降解溫度優(yōu)化

如圖2所示，CJC-3降解菌株在低溫和高溫時(shí)降解率低至18.90%，分析可能因高溫和低溫環(huán)境下抑制酶活性，不能有效地降解毒死蜱，在溫度為28 ℃時(shí)降解率最高，溫度達(dá)30 ℃時(shí)降解率驟降。最終溫度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)降解溫度為28 ℃時(shí)，降解率最高，為58.80%。

2.3.3 毒死蜱濃度優(yōu)化 如圖3所示，低濃度毒死蜱培養(yǎng)時(shí)，CJC-3降解菌株菌體降解能力弱，當(dāng)毒死蜱濃度自500 mg/L 逐漸上升至2 000 mg/L時(shí)，降解率達(dá)到最高，當(dāng)毒死蜱濃度再升高時(shí)，降解率下降，毒死蜱濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果：CJC-3降解菌株在毒死蜱濃度為2 000 mg/L時(shí)，降解率最高，為65.85%。

2.3.4 降解菌最佳接種量 如圖4所示，CJC-3降解菌株接種量為0.5%～5%時(shí)降解率迅速提升，接種量至5%后，繼續(xù)增加接種量降解率提升效率變化不明顯，因此最適接種量為5%。

綜合上述最優(yōu)條件，在溫度28 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h、農(nóng)藥濃度為2 000 mg/L、接種量為5%（D600 nm=1）的條件下，CJC-3菌株的降解率最高值可達(dá)到76.03%。

2.4 CJC-3對(duì)其他常用有機(jī)磷農(nóng)藥的降解特性

2.4.1 有機(jī)磷農(nóng)藥濃度對(duì)CJC-3降解效果的影響

設(shè)置敵敵畏濃度分別是20、40、60、80、160、240、320、400、480 mg/L。如圖5所示，敵敵畏濃度在80 mg/L時(shí)CJC-3菌株降解敵敵畏效果最好，降解率為42.72%。

如圖6所示，辛硫磷濃度在260 mg/L時(shí)CJC-3菌株對(duì)辛硫磷的降解最好，為39.54%。

如圖7所示，乙酰甲胺磷濃度在240 mg/L時(shí)CJC-3菌株對(duì)乙酰甲胺磷的降解率最佳，為24.15%。

如圖8所示，草甘膦濃度在120 mg/L時(shí)CJC-3菌株對(duì)草甘膦的降解效果最佳，為15.32%。

綜合上述，農(nóng)藥濃度對(duì)CJC-3菌株降解效果有顯著的影響。CJC-3菌株對(duì)這4種農(nóng)藥的降解率，隨著農(nóng)藥濃度的升高降解率逐漸升高，當(dāng)農(nóng)藥濃度達(dá)到最適濃度時(shí)，降解率達(dá)到最大，最后隨著農(nóng)藥濃度升高而逐漸減小。當(dāng)農(nóng)藥濃度超過(guò)菌體所能承受的濃度后，菌體逐漸裂解死亡，降解率逐漸減小。

2.4.2 溫度對(duì)CJC-3降解效果的影響

每種有機(jī)磷農(nóng)藥分別設(shè)置了5個(gè)溫度梯度：20、24、28、32、36 ℃，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)溫度對(duì)CJC-3菌株降解4種有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率變化和影響，如圖9所示。

CJC-3菌株在4種有機(jī)磷農(nóng)藥中表現(xiàn)一致，在20～28 ℃ 之間隨著溫度升高而逐漸增大。在28 ℃時(shí)達(dá)到最大，在28～36 ℃之間隨著溫度升高而降低。在28 ℃下，4種農(nóng)藥降解率分別為：草甘膦36.12%、敵敵畏41.54%、辛硫磷50.95%、乙酰甲胺磷26.15%。

2.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CJC-3降解效果的影響

分別測(cè)定4種有機(jī)磷農(nóng)藥條件下，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CJC-3降解效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，CJC-3菌株對(duì)草甘膦、敵敵畏、乙酰甲胺磷的降解率，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加降解率逐漸增大。在48 h降解率達(dá)到最大，分別為：草甘膦35.21%、敵敵畏50.47%、乙酰甲胺磷23.4%，之后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加降解率逐漸減小，辛硫磷在60 h降解率達(dá)到最大，為65.29%（圖10）。

3 結(jié)論與討論

以毒死蜱為底物，采用梯度馴化法篩選得到菌株CJC-3。通過(guò)降解特性研究，CJC-3對(duì)毒死蜱的最佳降解條件為：溫度28 ℃、培養(yǎng)時(shí)間48 h、農(nóng)藥濃度為2 000 mg/L，降解率達(dá)76.03%。然而，在實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，為保證有效防治有害生物，常常施用多種農(nóng)藥。為更好地發(fā)揮CJC-3降解菌的廣泛應(yīng)用性，試驗(yàn)還研究了CJC-3對(duì)敵敵畏、辛硫磷、乙酰甲胺磷3種有機(jī)磷殺蟲劑以及1種有機(jī)磷除草劑草甘膦的降解特性。結(jié)果表明，CJC-3菌株對(duì)4種農(nóng)藥的降解率從大到小依次為：辛硫磷65.29%、敵敵畏50.47%、草甘膦36.12%、乙酰甲胺磷24.15%，證明該菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有廣泛的降解特性，除可降解有機(jī)磷殺蟲劑外，對(duì)有機(jī)磷除草劑也有一定降解作用，可作為農(nóng)藥殘留控制的新途徑，為修復(fù)有機(jī)磷農(nóng)藥污染的土壤提供了有效參考。

參考文獻(xiàn)：

[1]李慧珍，韋燕莉，游 靜. 我國(guó)南方不同功能區(qū)域水體沉積物中常見農(nóng)藥的分布及毒性風(fēng)險(xiǎn)[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：地球科學(xué)版，2015，45（1）：1508-1527.

[2]賀紅武. 有機(jī)磷農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)農(nóng)藥，2008，30（6）：29-33.

[3]姜書凱. 毒死蜱產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀和前景[J]. 農(nóng)化新世紀(jì)，2008（6）：23-24.

[4]鄭永權(quán). 農(nóng)藥殘留研究進(jìn)展與展望[J]. 植物保護(hù)，2013，39（5）：90-98.

[5]董慶龍，劉嘉芬，安 淼，等. 嗜鐵細(xì)菌CAS17的分離鑒定及其對(duì)毒死蜱的降解特性研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（1）：136-142.

[6]馮發(fā)運(yùn)，朱 宏，李俊領(lǐng)，等. 一株小飛蓬內(nèi)生毒死蜱降解菌的分離鑒定及其降解特性研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2015，17（1）：89-96.

[7]田連生，陳 菲. 多菌靈降解菌T8-2的分離及其降解條件研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（6）：271-274.

[8]曹 銳. 毒死蜱及TCP對(duì)生物DNA損傷和土壤微生物多樣性的影響[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[9]唐 亮. 降解有機(jī)磷農(nóng)藥微生物的篩選及降解條件研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2008.

[10]明惠青. 有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的篩選及降解特性研究[D]. 沈陽(yáng)：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[11]布瑞德. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]. 8版. 北京：科學(xué)出版社，1984.

[12]葉 磊，楊學(xué)敏. 微生物檢測(cè)技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：141-142.

[13]李依韋，銀 玲，薛蘭蘭. 甲磺隆降解菌的降解特性及降解體系[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：614-616.