楊文婷+江明+朱文婷+韋琴

摘要：采用纖維素酶法提取曼地亞紅豆杉中的10-脫乙?；涂ǘ、螅?0-DAB），并對(duì)酶處理的條件進(jìn)行優(yōu)化。以10-DAB提取率為指標(biāo)，考察酶用量、酶處理時(shí)間、酶處理溫度及pH值等因素對(duì)提取率的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)得出纖維素酶法提取10-DAB的最佳條件，并結(jié)合實(shí)際進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果得到酶處理最佳條件為：纖維素酶用量2%、酶處理時(shí)間3 h、酶處理溫度42 ℃、pH值5.0，此時(shí)10-DAB提取率為0.5297%±0.001 067%，與模型預(yù)測(cè)值0.533 6%接近，說(shuō)明工藝條件穩(wěn)定，模型可靠。

關(guān)鍵詞：曼地亞紅豆杉；10-脫乙?；涂ǘ、?；纖維素酶；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0303-04

10-脫乙酰基巴卡丁Ⅲ（10-deacetylbaccatin Ⅲ，簡(jiǎn)稱(chēng)10-DAB）是合成抗癌藥物紫杉醇和多西紫杉醇的重要原料[1-3]。紫杉醇為治療多種晚期癌癥的藥物之一，因受到原材料來(lái)源的限制，其原料藥市場(chǎng)總體呈現(xiàn)供不應(yīng)求的趨勢(shì)[4]，其制備方法有多種，而以10-DAB作為原料半合成是最具實(shí)用價(jià)值的方法之一，目前已占紫杉醇原料藥總產(chǎn)量的2/3以上[5-6]，對(duì)于緩解紅豆杉資源的短缺具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。10-DAB主要從紅豆杉植株的枝葉中提取，但提取率通常比較低[7-10]，本研究利用纖維素酶對(duì)植物細(xì)胞壁進(jìn)行水解，以促進(jìn)10-DAB的溶出[11-12]，并通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶處理?xiàng)l件，從而確定酶法預(yù)處理的最佳條件[13-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曼地亞紅豆杉（產(chǎn)地江蘇）；石油醚（30～60 ℃），95%乙醇，二氯甲烷，甲醇，檸檬酸，檸檬酸鈉，以上化學(xué)試劑均為分析純；400～800 U/g纖維素酶（Sanland Chemical Co.LTD），400～800 U/g果膠酶（Biosharp）。

752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），KQ-50E型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司），YXQ-LS-50S11酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 精確稱(chēng)取10-DAB標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，定容至50 mL容量瓶中，得到0.1 mg/mL 10-DAB母液；再分別精確量取該母液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，稀釋至5 mL，于227 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.2 原材料的預(yù)處理 將曼地亞紅豆杉植株洗凈風(fēng)干，40 ℃ 干燥72 h，粉碎過(guò)30目篩，再以1 ∶5的比例用石油醚浸漬6 h，以初步脫脂及色素，陰涼處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取曼地亞紅豆杉粉末1 g，加入1%果膠酶及一定比例纖維素酶，再加入一定pH值的緩沖溶液至20 mL，振蕩混勻之后分別于一定溫度水浴一定時(shí)間，所得樣品5 000 r/min離心10 min，棄上清；以料液比1 g ∶30 mL 加入無(wú)水乙醇超聲處理30 min，取無(wú)水乙醇層去除溶劑，殘留物加15 mL蒸餾水混懸后用石油醚萃取至醚層接近無(wú)色，分液棄醚層，用10 mL二氯甲烷萃取，分離二氯甲烷層，通風(fēng)櫥中自然揮干除去溶劑，得干燥提取物[12]；精確量取10 mL甲醇溶解，并適當(dāng)稀釋?zhuān)?27 nm處測(cè)吸光度。

初步擬定酶處理?xiàng)l件為：纖維素酶用量2%、提取溫度為40 ℃、pH值5.0、酶處理時(shí)間2 h，其他條件不變，改變其中1個(gè)條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)，酶處理溫度分別為20、30、40、50、60 ℃，酶處理時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h，纖維素酶用量分別為1%、2%、3%、4%、5%，緩沖液pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0。不同pH值溶液用不同比例的0.1 mol/L檸檬酸溶液和0.1 mol/L檸檬酸鈉溶液配制，并用酸度計(jì)將pH值調(diào)至所需范圍。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理[13-14]，由單因素試驗(yàn)考察的結(jié)果選取酶預(yù)處理溫度（x1）、酶處理時(shí)間（x2）、pH值（x3）為自變量，利用Design-Expert 8.0.5軟件，根據(jù)Box-Behnken模型，以10-DAB提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17組試驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

以10-DAB濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為D=32.243C-0.0151，r2=0.998。由圖1可知，10-DAB 的濃度在0～0.02 μg/mL范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 酶處理溫度 由圖2可知，在20～40 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，10-DAB的提取率提高；超過(guò)40 ℃后，10-DAB 的提取率呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明纖維素酶的活力在40 ℃ 左右較高，10-DAB的溶出率較高。溫度較高時(shí)，10-DAB的提取率降低可能是由于10-DAB的熱不穩(wěn)定性，在溫度較高的條件下易降解或發(fā)生異構(gòu)化。

2.2.2 酶處理時(shí)間 由圖3可知，10-DAB的提取率隨酶預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。酶預(yù)處理3 h之后，10-DAB的提取率增幅變小，酶預(yù)處理5 h時(shí)甚至降低了。表明酶預(yù)處理3 h時(shí)幾乎能將10-DAB最大化提取，時(shí)間太長(zhǎng)反而對(duì)提取不利，所以將酶預(yù)處理時(shí)間控制在3 h之內(nèi)。

2.2.3 纖維素酶用量 由圖4可知，10-DAB的提取率隨纖維素酶用量的增加而升高。在纖維素酶用量達(dá)到2%之后，10-DAB的提取率趨近平緩，說(shuō)明纖維素酶用量達(dá)到2%以后，提取率變化不明顯。從節(jié)約資源的角度考慮，將纖維素酶用量確定為2%。

2.2.4 pH值 由圖5可見(jiàn)，在pH值為 4.0～5.0范圍內(nèi)，10-DAB的提取率隨pH值的升高而增大；當(dāng)pH值超過(guò)5.0時(shí)，提取率逐漸下降。表明所用酶的最適pH值在5.0左右。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶預(yù)處理溫度（x1）、酶處理時(shí)間（x2）、pH值（x3）為3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平選取情況見(jiàn)表1。以10-DAB提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert軟件，得到10-DAB提取率與3個(gè)因素關(guān)系的回歸方程：10-DAB提取率y=0.52+0.035x1-0.016x2 +0.017x3+0.008 5x1x2-0.017x1x3+0.006x2x3-0.036x12-0.06x22-0.088x32。分析結(jié)果（表3）顯示，回歸模型的R2為0.982 8，說(shuō)明此模型能解釋98%的響應(yīng)值變化，模型擬合程度良好。由回歸模型方差分析結(jié)果可知，方程的一次項(xiàng)x1、x3，二次項(xiàng)x12、x22、x32對(duì)10-DAB提取率的影響達(dá)極顯著水平，一次項(xiàng)x2、交互項(xiàng)x1x3對(duì)10-DAB提取率的影響達(dá)顯著水平。此外還可得出各因素對(duì)10-DAB提取率影響從大到小依次為酶預(yù)處理溫度（x1）>pH值（x2）>酶處理時(shí)間（x3）。等高線(xiàn)的形狀反映交互因素對(duì)提取率的影響是否顯著，圓形表明因素交互作用不顯著，馬鞍形和橢圓形則表示因素交互作用顯著。圖6、圖7、圖8直觀地呈現(xiàn)了各因素相互作用的響應(yīng)面的等高線(xiàn)圖和3D分析圖。從響應(yīng)面模型的等值線(xiàn)和最高點(diǎn)可以得到，在所選擇的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面模型的最高點(diǎn)，同樣也是等值線(xiàn)最小橢圓的中心點(diǎn)。由此可見(jiàn)，溫度、pH值的交互作用對(duì)10-DAB提取率的影響最為顯著，其顯著關(guān)系可通過(guò)等高線(xiàn)的形狀判斷，橢圓長(zhǎng)軸和短軸長(zhǎng)度相差越大，影響越顯著；接近圓形，影響不顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

回歸模型擬合出最佳條件為：溫度42.32 ℃、酶處理時(shí)間2.95 h、pH值5.03，根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整為：溫度42 ℃、酶處理時(shí)間3 h、pH值 5.0，在此條件下，平行試驗(yàn)3次，所得10-DAB 提取率為0.529 7%±0.001 067%，RSD=1.51%，重復(fù)性較好，條件穩(wěn)定。而理論預(yù)測(cè)值為0.533 6%，與實(shí)際提取率接近，進(jìn)一步說(shuō)明模型可靠、有效。

3 結(jié)論

10-DAB為合成抗癌藥物紫杉醇的重要中間體，主要從紅豆杉枝葉中提取，一般采用有機(jī)溶劑提取法、加熱回流提取法、超聲波法等方法提取，但提取率較低[8-10，16]，而酶法提取具有條件溫和、提取率較高等優(yōu)點(diǎn)，有利于紅豆杉資源的充分利用[11-12]；并利用響應(yīng)面中的Box-Behnken模型優(yōu)化提取工藝，克服傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)無(wú)法在連續(xù)水平上優(yōu)化工藝參數(shù)的缺點(diǎn)[13-15]。所得最佳工藝條件為：酶處理時(shí)間2.95 h、酶處理溫度42.32 ℃、pH值5.03、酶用量2%，在此條件下10-DAB的提取率為0.529 7%±0.001 067%，與預(yù)測(cè)值0.533 6%接近。在后續(xù)研究中，還可以結(jié)合酶的固定化技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)酶的重復(fù)利用，以進(jìn)一步提高該方法在工業(yè)上廣泛應(yīng)用的可行性。

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