郝莉花+吳曉宗+董彩文+陳春生+縱偉

摘要：為快速、靈敏并且特異性地檢測紅棗中鏈格孢菌，選取2對鏈格孢菌特異引物，優(yōu)化多重PCR檢測中的引物比例、退火溫度、dNTP濃度及Mg2+濃度等條件，結(jié)果表明多重PCR擴(kuò)增出了預(yù)計的鏈格孢菌PCR產(chǎn)物，優(yōu)化的條件為Alt-F2＼R2 ∶Alt-F1＼R1=3 ∶1、退火溫度52 ℃、dNTP濃度0.05 mmol/L、Mg2+濃度1.5 mmol/L。該方法在檢測紅棗鏈格孢菌中具有很好的應(yīng)用和開發(fā)前景。

關(guān)鍵詞：紅棗；鏈格孢菌；多重PCR；檢測

中圖分類號： TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0301-02

紅棗（Zizyphus jujuba Mill.）是集營養(yǎng)、保健于一體的優(yōu)質(zhì)干果，含有豐富的多糖、維生素C、黃酮、cAMP等成分[1-2]，但紅棗在自然條件下貯藏容易發(fā)生真菌病害侵染引起的霉變，在霉變過程中，真菌產(chǎn)生的二次代謝產(chǎn)物真菌毒素具有很強(qiáng)的毒性，會給食用者帶來危害[3-4]。近年來的研究表明，鏈格孢菌是紅棗霉變中的主要真菌之一[5-7]，因此對其進(jìn)行快速準(zhǔn)確地檢測，對控制紅棗產(chǎn)品的安全性具有重要意義。

多重PCR檢測技術(shù)具有快速、簡便且特異性的優(yōu)點(diǎn)，在許多植物真菌的檢測中得到廣泛應(yīng)用[8-10]，但對棗中鏈格孢菌的多重PCR檢測尚未見報道。本研究針對棗中鏈格孢菌特菌Alt-F1＼R1擴(kuò)增片段和Alt-F2＼R2擴(kuò)增片段設(shè)計引物，采用多重PCR對其進(jìn)行鑒定，研究其多重PCR檢測條件，旨在為棗產(chǎn)品的鏈格孢菌檢測提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

Tap酶、dNTP，均購自TaKaRa公司；真菌DNA提取試劑盒，Omega公司；5311型PCR儀，德國Eppendorf公司；LPH恒溫培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原真菌總DNA的提取 將霉變紅棗上刮下的菌絲洗滌、干燥，液氮研磨后轉(zhuǎn)移至EP管中，使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板，0.8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA。

1.2.2 鏈格孢菌引物單重PCR特異性試驗 根據(jù)序列比對結(jié)果，選取2對鏈格孢菌的特異引物：

Alt-F1：5′-TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT-3′；

Alt-R1：5′-CGACTTGTGCTGCGCTC-3′；

Alt-F2：5′-CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCC-3′；

Alt-R2：5′-CAGGCATGCCCTTTGGATAC-3′。

其中：Alt-F1、R1擴(kuò)增片段約370 bp；Alt-F2、R2擴(kuò)增片段約240 bp。

分別從不同紅棗真菌菌絲中提取基因組DNA，作為PCR反應(yīng)的模板，分別用以上2種引物進(jìn)行PCR，看能否擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。PCR反應(yīng)體系為50 μL：DNA模板2 μL、10×緩沖液5 μL、dNTP（每種2.5 mmol/L）2 μL、引物（10 μmol/L）各2 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，無菌水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上110 V電泳35 min。

1.2.3 2種引物的比例對多重PCR反應(yīng)的影響

引物Alt-F2＼R2和Alt-F1＼R1的比例分別為4 ∶1、3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶2，PCR反應(yīng)體系為50 μL：DNA模板2 μL、10×緩沖液5 μL、dNTP（每種2.5 mmol/L）2 μL、引物各2 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.4 μL、無菌水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物加1 μL 6×溴酚藍(lán)上樣緩沖液，在2%瓊脂糖凝膠上110 V電泳35 min。

1.2.4 退火溫度對多重PCR反應(yīng)的影響 選擇1種引物的比例，分別在不同的退火溫度下進(jìn)行PCR，其他條件不變。

1.2.5 Mg2+濃度對多重PCR反應(yīng)的影響

在PCR反應(yīng)體系中，改變Mg2+的加入量，使其終濃度分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mmol/L，其他條件不變，進(jìn)行PCR。

1.2.6 dNTP濃度對多重PCR反應(yīng)的影響

在PCR反應(yīng)體系中，改變dNTP的加入量，使其終濃度分別為0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mmol/L，其他條件不變，進(jìn)行PCR。

2 結(jié)果與討論

2.1 鏈格孢菌引物單重PCR特異性驗證

鏈格孢菌引物單重PCR特異性驗證結(jié)果見圖1、圖2。

從圖1、圖2可以看出，Alt-F1＼R1和Alt-F2＼R2引物能夠從鏈格孢屬中的2種菌株：XZJ1（Alternaria sp.）和XZJ2（Alternaria brassicae）的DNA中分別擴(kuò)展出大小約400、250bp的特異條帶，而從其他真菌如擴(kuò)展青霉、皮落青霉、根霉、毛霉、黑曲霉、鏈孢霉、長梗木霉的DNA中未能擴(kuò)增出條帶，說明這2對引物可以作為鏈格孢霉的特異性引物。

2.2 多重PCR反應(yīng)中2種引物的比例優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)中2種引物的比例優(yōu)化結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，當(dāng)引物Alt-F2＼R2和引物Alt-F1＼R1的比例為3 ∶1時，2條帶擴(kuò)增效果較好。隨著引物比例增大，小條帶逐漸減弱，因此2種引物的比例初步確定為Alt-F2＼R2 ∶Alt-F1＼R1=3 ∶1。

2.3 多重PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，當(dāng)退火溫度為52 ℃時，2條帶擴(kuò)增效果較好，因此退火溫度初步確定為52 ℃。

2.4 多重PCR反應(yīng)Mg2+濃度優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，Mg2+濃度變化對引物Alt-F2＼R2和引物Alt-F1＼R1的多重PCR反應(yīng)影響不大，因此Mg2+濃度采用1.5 mmol/L。

2.6 多重PCR反應(yīng)dNTP濃度優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)dNTP濃度優(yōu)化結(jié)果見圖6。從圖6可以看出，當(dāng)dNTP濃度超過0.05 mmol/L后，其濃度變化對引物Alt-F2＼R2和引物Alt-F1＼R1的多重PCR反應(yīng)影響不大。

3 結(jié)論

多重PCR檢測需要通過調(diào)整PCR反應(yīng)體系中某些反應(yīng)條件來實現(xiàn)。試驗中發(fā)現(xiàn)引物比例、退火溫度是影響多重PCR的2個重要因素，而dNTP、Mg2+濃度對多重PCR的影響較小。研究驗證了2對鏈格孢菌引物具有擴(kuò)增特異性，并初步確定了2對引物多重PCR的引物比例、退火溫度、Mg2+濃度和dNTP濃度。表明該方法可檢測棗中鏈格孢菌，具有快速、靈敏并且特異性的優(yōu)點(diǎn)。

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