陳希文+賴守勛+尹苗+周艷美+李蓮+汪謙+葉兆美+王雄清

摘要：采用超聲波輔助法對22種中藥多糖進行提取，用牛津杯法和試管二倍稀釋法測定中藥多糖的抗菌活性。結(jié)果表明，川牛膝、黃芩、茯苓、地榆、虎杖等5種中藥多糖對豬源金黃色葡萄球菌有較強的抑菌效果，抑菌圈在20 mm以上，最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）在3.9～7.8 mg/mL；9個復(fù)方提取物的體外抑菌結(jié)果表明，以黃芩、地榆、大黃、虎杖等中藥為主的復(fù)方對豬源金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，其最大抑菌圈直徑可達27.6 mm，MIC和MBC為3.9 mg/mL，表明它們在抗菌消炎方面具有較高的藥用開發(fā)價值，在中藥組方時可優(yōu)先考慮。

關(guān)鍵詞：中藥多糖；金黃色葡萄球菌；抑菌活性；MIC；MBC；中藥復(fù)方

中圖分類號： S853.7；S855.1+1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0264-03

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）簡稱金葡菌，是一種常見的人畜共患病原菌，其在人醫(yī)臨床上常引起皮膚、口腔以及鼻腔黏膜等組織局部化膿感染，也可引起肺炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、腸炎以及尿路感染等；在獸醫(yī)臨床常引起仔豬滲出性皮炎、牛羊乳房炎和子宮內(nèi)膜炎、犬貓鼻炎以及雞水腫病等多種動物疾病，若不及時治療常引起敗血癥、膿毒癥等全身感染導致動物死亡[1-3]。此外，由于金黃色葡萄球菌可以通過各種方式污染食品，因此該菌也是食品安全領(lǐng)域引起食物中毒的重要致病菌之一[4-6]。

近年來，隨著養(yǎng)豬規(guī)模的不斷擴大和養(yǎng)殖密度的不斷增加，豬細菌性疾病的發(fā)生更加復(fù)雜嚴重，其中由金黃色葡萄球菌引起的仔豬滲出性皮炎在規(guī)模化豬場也日趨嚴重。然而，由于抗菌素在獸醫(yī)臨床的濫用，細菌耐藥問題越來越突出[7-8]，臨床很難篩選得到對金葡菌敏感的藥物，一旦發(fā)病，死淘率可高達90%，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。中藥因其具有營養(yǎng)、保健、促生長以及藥用低毒、低殘留和不易產(chǎn)生耐藥性等特點，已逐漸被國內(nèi)外研究者重視[9-11]，并發(fā)現(xiàn)其對很多致病菌具有較強的抑制作用，有望成為抗菌素的替代藥物或輔助藥物。同時，隨著社會對食品安全及無抗養(yǎng)殖的重視和關(guān)注，篩選對致病菌敏感、高效、低毒、低殘留的中藥來防控動物疾病已經(jīng)成為當前獸醫(yī)工作者研究的熱點和趨勢，也是發(fā)展健康無抗養(yǎng)殖急需解決的1個重要課題。本研究選擇多糖含量較高的22種中藥，采用超聲波輔助法提取其多糖化合物，研究其對豬源金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性，以期為獸醫(yī)臨床合理用藥、有效防控豬金黃色葡萄球菌病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥材

22種常用中藥材 地榆（陜西）、大黃（四川）、虎杖（四川）、丹參（四川）、甘草（甘肅）、石榴皮（河南）、黃芪（陜西）、黃芩（甘肅）、茯苓（湖南）、苦參（內(nèi)蒙古）、黃連（四川）、魚腥草（四川）、柴胡（四川）、枸杞（寧夏）、白術(shù)（浙江）、升麻（陜西）、大棗（新疆）、何首烏（四川）、黨參（四川）、山茱萸（陜西）、大葉茜草（四川）、川牛膝（四川）和蒲公英（貴州），購自綿陽天源堂大藥房。根據(jù)中藥復(fù)方的組方原則[12]，選擇單味抑菌活性較好的中藥輔以補益理氣等藥物，組成9個復(fù)方，具體情況見表1。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基等，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；微量生化發(fā)酵管，購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、正丁醇、無水乙醇、丙酮等常規(guī)藥品為化學純，購自綿陽市信捷商貿(mào)有限責任公司。

1.3 供試菌種

豬源金黃色葡萄球菌，分離自綿陽市某規(guī)模化豬場仔豬滲出性皮炎病豬，由綿陽師范學院動物應(yīng)用技術(shù)研究所鑒定保存。

1.4 中藥多糖的提取

稱取干燥、粉碎后的中藥10 g，放入250 mL燒杯中，加入20倍的蒸餾水，65 ℃下超聲波提取15 min，2層醫(yī)用紗布過濾得提取液，濾渣重復(fù)上述操作，共得到3次提取液，合并3次提取液，低速離心10 min取上清液；濃縮至25 mL，以1 ∶3比例加入 95%乙醇，靜置1夜，次日于離心機以 3 000 r/min 離心 20 min，去除上清液得到多糖沉淀，加蒸餾水定容至10 mL；加入 Sevage 試劑（正丁醇 ∶三氯甲烷=4 ∶1，Sevage ∶濾液=1 ∶5），3 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)2次可有效除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，定容10 mL，具體方法參考文獻[13-15]。全部藥液用立式壓力蒸汽滅菌器，121 ℃滅菌15 min，取出后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌懸液的制備

將保存的豬源金黃色葡萄球菌活化后，接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng) 18～24 h，每支斜面加入 1.5 mL滅菌蒸餾水，洗下菌液，調(diào)整細菌濃度為150萬CFU/mL備用，具體方法參考文獻[16]。

1.6 體外抑菌活性的測定

采用牛津杯法，將滅菌后的液體培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)，待其凝固后，用微量移液器吸取 0.1 mL稀釋到一定濃度的菌懸液，滴入平板，用涂布器涂勻，用鑷子輕輕在每個培養(yǎng)皿中等距離放入4個牛津杯，用微量加樣器吸入含生藥1 g/mL 的中藥多糖溶液0.2 mL于對應(yīng)牛津杯中，置于37 ℃條件下，恒溫培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈直徑，具體參照文獻[17]。

1.7 最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用試管二倍稀釋法，每11支為1組，在1～11號試管中各加入2 mL無菌營養(yǎng)肉湯，在1號試管中加入2 mL含生藥1 g/mL 的中藥多糖溶液混勻，取出 2.0 mL放入第 2管中，依次類推，直到第 9管取出2.0 mL棄去，則1～9號試管混合液中藥提取物濃度依次為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、0.9 mg/mL，10號試管不含中藥作對照，11號試管不加菌懸液觀察是否染菌。將稀釋成一定濃度的菌懸液用微量移液器吸取0.1 mL于1～10號試管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18～24 h。觀察透明無渾濁試管，選出濃度最低的試管藥液，即為這種藥物對該細菌的最小抑菌濃度（ MIC），具體方法參照文獻[18]。

1.8 最低殺菌濃度（MBC）的測定

將上述選出的透明無渾濁試管，吸取菌藥液0.1 mL加入培養(yǎng)基中，用涂布器涂布均勻，置于37 ℃恒溫養(yǎng) 24 h。以99.9%殺死試驗菌菌體的藥物最高稀釋度為最低殺菌濃度（MBC），具體方法參照文獻[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單味中藥多糖的抑菌活性

由表2可知，22種中藥多糖的初提物對豬源金黃色葡萄球菌的抑菌效果存在較大差異，其中川牛膝的抑菌活性最強，抑菌圈直徑25.3 mm，MIC和MBC均為3.9 mg/mL，其次是黃芩、茯苓、地榆、虎杖等中藥，其抑菌圈直徑均在20 mm以上，具有極強的抑菌活性；而大棗、黨參和大葉茜草3種中藥對豬源金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑菌效果。

2.2 復(fù)方中藥多糖的抑菌活性

由表3可知，復(fù)方3和復(fù)方7明顯比各單味藥的抑菌效果都明顯增強，對豬源金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為26.3、27.6 mm，MIC和MBC均為3.9 mg/mL；而復(fù)方5和復(fù)方9均出現(xiàn)抗菌能力降低的現(xiàn)象。

3 結(jié)論與討論

中藥多糖的提取方法較多，不同的提取方法可影響其抑菌效果。其中，浸提法和醇沉法是傳統(tǒng)常用的提取方法，其利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，在濃縮液中加乙醇，使多糖從提取液中沉淀出來。但因水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性成分浸提出來，使提取液存放時易腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來困難，同時該法提取比較耗時，提取率也不高[21]，因此其使用受到限制。近年來，隨著超聲波技術(shù)的蓬勃發(fā)展，超聲波提取技術(shù)（ultrasound extraction，UE）已成為提取中藥有效成分的一種新方法，其具有低溫、常壓、安全、效率高、雜質(zhì)少、能耗低等優(yōu)點[22]。該法影響提取率的主要因素有時間、溫度、提取次數(shù)和料液比等[23]，本研究通過條件優(yōu)化，確定了提取時間20 min、提取溫度65 ℃、料液比1 g ∶20 mL、提取次數(shù)3次的最佳提取條件，結(jié)果表明，該法操作簡單、高效、方便，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ奶崛》椒?，值得在中藥提取實踐中推薦使用。

在抑菌試驗中，采用牛津杯法測定抑菌圈大小、試管二倍稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），是測定藥物效價和活性的通用方法，也是各國藥典規(guī)定的方法[24]。從本研究結(jié)果看，22種中藥抑菌圈大小、MIC和MBC三者之間的數(shù)據(jù)相關(guān)性基本相符合，說明試驗結(jié)果可靠。單味中藥的抑菌試驗結(jié)果顯示，22種中藥多糖的提取物對豬源金黃色葡萄球菌的抑菌效果存在較大差異，其中川牛膝的抑菌活性最強，抑菌圈直徑25.3 mm，MIC和MBC均為3.9 mg/mL；其次是黃芩、茯苓、地榆、虎杖等中藥，其抑菌圈直徑均在20 mm以上，也具有較強的抑菌活性；而大葉茜草、大棗和黨參3種中藥對豬源金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑菌效果。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，22種中藥的整體抑菌強弱順序為川牛膝>黃芩>茯苓>地榆>虎杖>大黃>石榴皮>丹參>何首烏>柴胡>黃芪>蒲公英>升麻>甘草>山茱萸>枸杞>苦參>魚腥草>黃連>大葉茜草=大棗=黨參。川牛膝因具有祛風利濕、通經(jīng)活血等功效，常用于產(chǎn)后跌打損傷、胞衣不下、尿血血淋、風濕痹痛等病癥[25]，未見其有抗菌抑菌作用的報道，而本研究結(jié)果表明川牛膝在22種中藥中抑菌活性最強，提示川牛膝可能在抗菌消炎藥方面具有一定的應(yīng)用價值，這為川牛膝的進一步開發(fā)應(yīng)用提供了參考。楊海燕等研究結(jié)果表明，黃芩、茯苓、地榆、虎杖等中藥對金黃色葡萄球菌具有較強的抑制作用，與本研究結(jié)果相符，說明這些中藥在抗菌中藥的開發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景[26-28]。但在具體的抑菌圈大小和MIC或MBC數(shù)值上，本研究結(jié)果與相關(guān)報道又存在一定差異，其原因可能與中藥的產(chǎn)地、提取方法、以及抑菌試驗測定方法的不同等有關(guān)，說明在應(yīng)用中藥時要充分考慮這些因素的影響。值得注意的是，在黨參多糖提取物的抑菌試驗中，不僅沒有出現(xiàn)抑菌圈，并且在裝有黨參多糖提取物的牛津杯周圍，金黃色葡萄球菌的菌落反而更加密集，說明黨參多糖可能具有促進細菌生長的作用，其具體機理有待進一步研究。

基于單味中藥的抑菌試驗結(jié)果，結(jié)合中藥的配伍原則，筆者對9個中藥復(fù)方多糖提取物進行體外抑菌試驗，結(jié)果表明，以黃芩、地榆、大黃、虎杖等中藥為主的復(fù)方多糖提取物對豬源金葡菌具有良好的抑菌活性，其最好的組方抑菌圈直徑可達27.6 mm，MIC和MBC為3.9 mg/mL，表明它們在抗菌消炎等方面具有較高的藥用開發(fā)價值，在中藥組方時可優(yōu)先考慮。MIC和MBC值是獸醫(yī)臨床選藥用藥的主要依據(jù)[29]。從本研究的MIC或MBC數(shù)值上看，某些復(fù)方中藥的MIC或MBC值低于單方，表明此復(fù)方效果優(yōu)于單方。而有些復(fù)方的MIC或MBC值高于單方，說明可能是此類組方中含有無抑菌效果或抑菌效果差藥物，從而使得復(fù)方制劑總質(zhì)量增加而有效活性物質(zhì)降低的結(jié)果，如本研究中的黨參、黃連、白術(shù)等中藥組方。但是，由于復(fù)方藥物是基于動物機體整體出發(fā)，兼顧了各種藥物成分的藥理、藥性以及之間的相互作用，發(fā)揮的是不同藥物的復(fù)合作用和對機體的整體效應(yīng)。因此，在抑菌活性相差不大的情況下，中藥復(fù)方在動物疾病的防控方面可能較單方更合理、更有效、更科學，而對于不同復(fù)方究竟在臨床生產(chǎn)中的運用效果如何仍需要進一步研究。

金黃色葡萄球菌是一種分布廣泛且對人類和動物危害嚴重的病原菌，篩選有效藥物控制該病不僅可降低畜禽養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失，同時對人類健康和食品安全具有重要意義。中藥作為我國的優(yōu)勢國藥，其資源豐富，來源廣泛，具有作用廣泛、毒副作用小和不易產(chǎn)生耐藥性等特點，是抗生素替代藥物研究的新方向，對疾病的預(yù)防和治療具有廣闊的應(yīng)用前景，本研究結(jié)果可為獸醫(yī)臨床合理用藥、有效防控豬葡萄球菌病提供科學參考。

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