蘇江碩+陳素梅+管志勇+陳發(fā)棣

摘要：以耐鹽性中等水平的切花菊品種雪中花為材料，采用1/2Hoagland培養(yǎng)法研究添加不同濃度外源Ca2+（0、5、10、15、20 mmol/L）對150 mmol/L NaCl脅迫下菊花幼苗葉片丙二醛含量、脯氨酸含量、相對電導率、葉綠素含量、凈光合速率等光合指標的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與菊花幼苗單純鹽脅迫相比，幼苗受到鹽脅迫后加入一定濃度的外源Ca2+，MDA含量降低23.99%～46.27%，Pro含量降低1.28%～46.90%，相對電導率降低22.81%～50.45%，葉綠素含量增加5.74%～42.16%，凈光合速率增加78.32%～161.74%，葉片Na+降低48.04%～61.04%，Ca2+、K+含量和Ca2+/Na+、K+/Na+增加幅度分別為5.65%～87.88%、9.36%～20.41%、98.37%～373.98%、121.30%～205.05%。以上結(jié)果表明，一定濃度的外源Ca2+可以提高鹽脅迫下菊花幼苗的抗性，緩解高濃度NaCl對植株造成的傷害，其中以15 mmol/L Ca2+處理效果最佳。

關鍵詞：菊花；外源鈣離子；鹽脅迫；生理特性

中圖分類號： S682.1+10.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0199-05

土壤鹽堿化是全球性問題，嚴重影響了生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。菊花（Chrysanthemum morifolium）系菊科菊屬多年生宿根花卉，是我國的十大傳統(tǒng)名花和世界四大切花之一，具有極高的觀賞和經(jīng)濟價值，在花卉生產(chǎn)中占有非常重要的地位[1]。目前我國菊花生產(chǎn)基本上為分散型區(qū)域性生產(chǎn)，沿海和北方地區(qū)的鹽漬土壤嚴重限制了菊花的栽培推廣。因此，研究菊花耐鹽機理并找到有效緩解鹽害的方法是菊花研究工作的重要任務之一。

鈣離子作為一種大量元素，不僅可以滿足植物正常生長發(fā)育，還是植物代謝和發(fā)育的重要調(diào)控者。有研究表明，鹽分脅迫條件下施加適量的外源鈣，不僅可以緩解因鈣不足造成的礦質(zhì)營養(yǎng)脅迫，而且能夠增加質(zhì)膜的穩(wěn)定性和保證鈣信號系統(tǒng)的正常發(fā)生和傳遞，從而維持細胞內(nèi)離子平衡[2]。植物在受到逆境脅迫時能提高游離鈣離子的濃度，并通過Ca2+與鈣調(diào)節(jié)蛋白（CaM）結(jié)合啟動一系列生理生化過程，從而在植物對逆境的感受、傳遞、響應和適應過程中發(fā)揮重要作用[3]。目前外源鈣對植物鹽害的緩解效應已在擬南芥[4]、玉米[5]、小麥[6]、黃瓜[7]等多種植物上有報道，但在菊花上，除米銀法等的研究[8]外，尚未見其他報道。為此，筆者研究了不同濃度的Ca2+對鹽脅迫下菊花幼苗的生長、生理反應、光合作用的影響，以期找到能夠緩解菊花鹽脅迫的最適Ca2+濃度，同時為闡明外源鈣緩解鹽害機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

供試材料為耐鹽性中等水平的切花菊品種雪中花，由南京農(nóng)業(yè)大學“中國菊花種質(zhì)資源保存中心”提供。春季取生長一致的腳芽在穴盤中扦插（扦插基質(zhì)蛭石與珍珠巖質(zhì)量比為1 ∶1），待菊花幼苗生根長至10～12葉齡后，取出幼苗，洗凈根部基質(zhì)后轉(zhuǎn)入盛有清水的周轉(zhuǎn)箱內(nèi)（氣泵24 h/d通氣），放入溫室進行培養(yǎng)。緩苗5 d后選取生長一致的菊花幼苗，放入較小的周轉(zhuǎn)箱中，每箱10株，共6個處理。具體處理如下：

CK：即對照，1/2Hoagland；T1：1/2Hoagland+150 mmol/L NaCl；T2：1/2Hoagland+150 mmol/L NaCl+5 mmol/L CaCl2；T3：1/2Hoagland+150 mmol/L NaCl+10 mmol/L CaCl2；T4：1/2Hoagland+150 mmol/L NaCl+15 mmol/L CaCl2；T5：1/2Hoagland+150 mmol/L NaCl+20 mmol/L CaCl2。

處理5 d進行各項生理指標的測定，混合取樣，其中每個指標測定時各處理中的不同植株均取同一葉位的葉片。每處理重復測定3次，取平均值。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 形態(tài)指標測定 處理后每天觀察記錄植株的形態(tài)特征變化，用數(shù)碼相機拍照記錄。

1.2.2 葉片丙二醛（MDA）含量的測定 MDA含量測定采用硫代巴比妥酸TBA法[9]，取0.2 g鮮樣，加3 mL 5% TCA，研磨后所得勻漿在3 000 r/min下離心20 min。取上清液2 mL，加2 mL 0.67% TBA，混合后沸水浴30 min，冷卻后再離心1次。分別測定上清液在450、532、600 nm處的吸光度，并按公式算出MDA濃度，再算出單位鮮量組織中的MDA含量。

1.2.3 葉片脯氨酸（Pro）含量的測定 Pro含量測定采用磺基水楊酸法，具體步驟參考張治安等的試驗[10]。

1.2.4 相對電導率的測定 參照張治安等的方法[10]，用去離子水沖洗葉片3遍，用打孔器打5個葉圓片放入含有6 mL離心管中，隔夜后測定其電導值（EC1），放入沸水浴煮沸20 min，冷卻后再次測定電導值（EC2）。

相對電導率=EC1/EC2×100%。

1.2.5 葉綠素含量測定 按李合生等的方法[9]測定葉片葉綠素含量，取新鮮葉片用蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干多余水分，剪碎稱取0.02 g放入10 mL離心管中，加9 mL 95%乙醇提取液于黑暗條件下浸提48 h，測定D649 nm、D665 nm的值。

葉綠體色素含量（mg/g）=（色素濃度×提取液體積）/樣品鮮量。

1.2.6 光合指標測定 用美國LI-COR公司產(chǎn)Ll-6400型光合儀于晴天上午09：00—11：00測定凈光合速率（Pn）、胞間二氧化碳濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）。測定時使用開放氣路，光強為1 000 μmol/（m2·s），CO2氣體采自相對穩(wěn)定的3～4 m高的空氣層，葉室溫度為25 ℃。

1.2.7 離子測定 Ca2+、K+、Na+的提取參照王寶山等的方法[11]進行，略加修改。稱取0.2 g鮮葉，剪碎后放進試管，加入8 mL去離子水，沸水浴1.5 h，冷卻后過濾，用Perkin Elmer公司生產(chǎn)的Optimal 2100DV電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測定過濾得到的浸提液中的Ca2+、K+、Na+離子含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007、SPSS 19.0軟件進行分析處理，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），在α=0.05水平上進行比較，用Duncans多重比較檢驗不同材料處理之間植株的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源Ca2+對NaCl脅迫下菊花幼苗生長形態(tài)的影響

鹽脅迫處理4 d后，對照組植株葉片全部正常，處理組植株葉片從下到上均出現(xiàn)不同程度的失綠、焦枯、萎蔫等鹽害現(xiàn)象。鹽害程度最大的植株出現(xiàn)在沒有添加Ca2+的T1組，該組菊花幼苗基部有4～5張葉子形態(tài)異常且新葉發(fā)黃。加入一定濃度的Ca2+后鹽害現(xiàn)象有所緩解，其中T4組菊花受害程度最小，該組菊花幼苗基部只有1～2張葉子異常；T2、T3、T5組菊花幼苗受害程度相似，基部均有2～3張葉子異常（圖1）。結(jié)果表明，加入一定濃度的外源Ca2+可緩解菊花幼苗的鹽害現(xiàn)象，其中Ca2+濃度為15 mmol/L的緩解效果相對較好。

2.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下菊花幼苗MDA含量的影響

與CK相比，菊花在150 mmol/L NaCl脅迫處理后MDA含量均有所升高，其中MDA含量最高出現(xiàn)在未添加Ca2+的T1組，為CK的2.31倍（圖2），說明高濃度的NaCl可能導致了氧化脅迫，增強了膜脂過氧化程度。加入不同濃度的外源Ca2+后，與T1相比各處理植株葉片的MDA含量顯著下降，分別下降了T1的33.40%、38.88%、46.27%、23.99%，各處理之間差異不顯著，其中以加入15 mmol/L Ca2+的T4處理效果最好（圖2）。以上結(jié)果表明加入一定濃度的Ca2+可能抑制了NaCl脅迫下菊花幼苗的膜脂過氧化作用，從而減輕膜脂過氧化對細胞的傷害，但Ca2+濃度過高又可能會降低這種抑制作用。

2.3 外源Ca2+對NaCl 脅迫下菊花幼苗Pro含量的影響

菊花幼苗在150 mmol/L NaCl脅迫處理后，各處理Pro含量均有所上升，其中Pro含量最高出現(xiàn)在未加Ca2+的T1組，為CK的2.65倍；與T1相比，加入不同濃度的外源Ca2+后各處理Pro含量出現(xiàn)不同程度的下降，分別下降了T1的1.28%、8.48%、46.90%、16.04%，其中T2、T3、T1處理間差異不顯著， 而T4處理植株的Pro含量下降得最多， 與對照無顯著差異（圖3）。結(jié)果表明，鹽脅迫下增施一定濃度的外源鈣離子可能增強了植株的滲透調(diào)節(jié)能力，從而緩解鹽脅迫對植株的滲透脅迫傷害。

2.4 外源Ca2+對NaCl 脅迫下菊花幼苗相對電導率的影響

與CK相比，菊花在150 mmol/L NaCl脅迫處理后T1處理植株的相對電導率顯著上升了324.24%（圖4），說明高濃度的NaCl使菊花細胞質(zhì)膜受到損傷，增強膜的透性，從而加劇了細胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲；加入不同濃度的外源Ca2+后，與T1相比，處理組T2、T3、T4、T5的相對電導率均顯著下降，分別下降了T1的26.42%、33.35%、50.45%、22.81%，其中加入15 mmol/L Ca2+的T4處理的相對電導率最低，而加入20 mmol/L Ca2+的T5處理相對電導率最高（圖4）。以上結(jié)果表明鹽脅迫下增施一定濃度的外源鈣離子可有效提高膜的穩(wěn)定性，緩解電解質(zhì)的外滲，但Ca2+濃度過高，可能與Na+、Cl-一樣會對植株產(chǎn)生離子脅迫。

2.5 外源Ca2+對NaCl 脅迫下菊花幼苗葉綠素含量的影響

與CK相比，菊花在150 mmol/L NaCl脅迫處理后各處理植株的葉綠素含量均顯著下降，其中下降最多的是T1處理，為CK的51.50%；與T1相比，加入不同濃度的外源Ca2+后各處理葉綠素含量均有不同程度上升，總體趨勢是先上升后下降，其中T2上升的最少，T4上升的最多，分別是T1處理的1.06、1.42倍（圖5）。這表明一定濃度的外源鈣離子可能減緩了NaCl脅迫下菊花幼苗葉片葉綠素的降解速度，一定程度上穩(wěn)定了葉綠素含量，從而對菊花葉片的光合作用起到了一定的保護作用。

2.6 外源Ca2+對NaCl 脅迫下菊花幼苗光合作用的影響

與CK相比，菊花幼苗在150 mmol/L NaCl脅迫下，T1處理植株Pn、Gs、Ci、Tr均顯著下降，分別下降了71.15%、70.27%、40.47%、63.64%；各處理與T1相比，加入不同濃度的外源Ca2+后Pn、Gs、Ci、Tr均出現(xiàn)不同程度升高，且隨著Ca2+濃度的升高，各光合指標均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并都在T4處理達到最大值，該處理植株葉片的Pn、Gs、Ci、Tr比T1分別顯著上升了161.74%、136.67%、279.92%、175.00%。但與CK相比，T4處理植株的Pn、Ci顯著低于CK，Gs與CK無顯著差異，而Tr顯著高于CK，這可能是由于鹽脅迫下植物自身適應調(diào)節(jié)的一種方式；氣孔導度和胞間二氧化碳濃度變化趨勢一致，從而推斷，鹽脅迫下凈光合速率的降低主要是由于氣孔因子造成的（表1）。以上結(jié)果表明，鹽脅迫導致了菊花葉片Pn、Gs、Ci、Tr的下降，但Ca2+卻減輕了其下降的程度，即一定濃度的Ca2+能維持鹽脅迫下菊花較高的同化能力。

2.7 外源Ca2+對NaCl脅迫下菊花幼苗K+、Ca2+、Na+含量的影響

與CK相比，菊花幼苗在150 mmol/L NaCl脅迫后各處理植株的葉片中Ca2+、K+含量均降低而Na+含量均升高，其中T1處理植株的離子含量變化最大，分別是CK的0.4、0.66、3.35倍；與T1相比，加入不同濃度的外源Ca2+后各處理植株葉片的的Ca2+分別上升了10.71%、16.11%、87.68%、5.65%，K+分別上升9.36%、12.90%、20.41%、17.46%，而Na+分別下降了54.81%、57.43%、61.04%、48.04%（圖6-A）。這表明一定濃度的外源鈣處理可減少菊花幼苗葉片Na+的積累而增加K+、Ca2+的濃度，最佳鈣離子濃度為15 mmol/L。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，與CK相比，單純鹽脅迫下菊花幼苗葉片Ca2+/Na+、K+/Na+顯著降低，分別比CK下降了86.23%、79.84%； 加入不同濃度的外源Ca2+后， 各處理植株的Ca2+/Na+、K+/Na+呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與T1相比各處理的Ca2+/Na+、K+/Na+除T5處理的Ca2+/Na+與T1差異不顯著外，其他處理均顯著高于T1。T4處理效果最好，Ca2+/Na+、K+/Na+分別是T1的4.80、3.05倍，但與CK相比，加鈣后各處理的Ca2+/Na+、K+/Na+仍顯著小于CK（圖6-B）。這表明外源鈣離子可能通過降低Na+離子在葉片中積累，提高葉片對Ca2+、K+的選擇性吸收從而維持較高的Ca2+/Na+、K+/Na+ 來減輕葉片的離子毒害或保持鹽脅迫下細胞內(nèi)的離子平衡，進而緩解植株的鹽脅迫危害。

3 討論

在鹽脅迫等逆境條件下，植物體內(nèi)活性氧代謝系統(tǒng)的平衡受到影響，導致體內(nèi)積累較多的活性氧（如O-2· 、H2O2、·OH 等）[12]以啟動膜脂過氧化作用，損傷或破壞膜結(jié)構(gòu)，從而在植物體內(nèi)積累較多的MDA，進而引起電解質(zhì)外滲。鈣除了是植物體內(nèi)一種大量礦質(zhì)元素外，還作為一種重要的細胞膜的保護物質(zhì)，通過把膜表面的磷酸鹽和磷酸脂以及蛋白質(zhì)的羥基橋連起來從而維持鹽脅迫下細胞質(zhì)膜、液泡膜、葉綠體膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及ATPase的活性[3]。本研究結(jié)果表明，單純鹽脅迫下菊花幼苗葉片的MDA含量、相對電導率顯著高于對照，與T1相比，加入不同濃度的Ca2+后各處理MDA含量和相對電導率又顯著降低，且這種緩解效果隨著Ca2+濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中以15 mmol/L的T4處理效果最好（MDA含量為T1的53.73%，相對電導率為T1的49.65%），這表明Ca2+只有在一定濃度范圍內(nèi)起到保護質(zhì)膜的作用，超過最適濃度，Ca2+可能會與磷酸反應生成沉淀而擾亂以磷酸為基礎的能量代謝，過高濃度的Ca2+也可能對植物產(chǎn)生新的鹽害。這與劉新星等在豌豆[13]、陳全戰(zhàn)等在油用向日葵[14]、尹增芳等在海濱錦葵[15]上的研究結(jié)果一致。

鹽脅迫下，外界環(huán)境的滲透勢降低，鹽分對植物細胞會產(chǎn)生滲透脅迫。滲透調(diào)節(jié)能力是植物耐鹽的最基本特征之一[16]。大量研究試驗表明，植物在鹽脅迫下會合成一些小分子有機物質(zhì)（如多元醇、甜菜堿、可溶性糖等）以增強植物的滲透調(diào)節(jié)能力，改善水分狀態(tài)，從而緩解鹽脅迫危害。在眾多滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中，脯氨酸以游離狀態(tài)存在于植物細胞中，具有水溶性高、分子量低、在生理pH值范圍內(nèi)無靜電荷等特點[17]，是分布最廣的一種相容滲透劑，在植物對鹽的抗脅迫適應中具有非常重要的意義。本研究結(jié)果表明，在單純鹽脅迫下菊花幼苗的脯氨酸含量比對照顯著升高了265.25%。加入不同濃度的Ca2+后，各處理的脯氨酸有不同程度的下降，其中T4處理下降得最多，與CK無顯著差異。研究結(jié)果與前人得出的部分結(jié)果相似，如程玉靜等研究外源硝酸鈣對黃瓜幼苗鹽脅迫傷害的緩解作用時發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下黃瓜幼苗葉片脯氨酸含量高出對照的28.1%，葉面噴施2 mmol/L硝酸鈣后，脯氨酸含量顯著低于對照[18]。但也有研究得到了不太一致的結(jié)果，如朱曉軍等研究發(fā)現(xiàn)加入5、10 mmol/L Ca2+后促進了鹽脅迫下水稻幼苗脯氨酸的積累[19]；劉新星等研究發(fā)現(xiàn)豌豆幼苗葉片脯氨酸含量隨處理時間的延長，對照及各處理豌豆幼苗葉片脯氨酸含量呈總體上升趨勢，且加鈣處理明顯高于單純鹽脅迫[13]。目前對于脯氨酸的積累與抗鹽性的關系仍存在不同的看法：有學者認為脯氨酸在鹽害條件下的積累起到了細胞滲透壓調(diào)節(jié)劑的作用，保護膜與酶的結(jié)構(gòu)，從而緩解鹽脅迫[20]；也有學者認為鈣離子濃度與鹽脅迫下脯氨酸的積累呈負相關[21]。從本研究的結(jié)果來看，脯氨酸可能僅是鹽脅迫下的一種產(chǎn)物，外加一定濃度的Ca2+可能通過保護膜的穩(wěn)定性、保持離子平衡等途徑減少植物鹽脅迫所受的傷害，從而減少脯氨酸的積累?？傊?，關于植物在鹽脅迫下脯氨酸的積累與抗鹽性還有待進一步研究。

細胞內(nèi)一價離子Na+、K+和二價離子Ca2+之間的平衡是維持質(zhì)膜通透性和細胞膜結(jié)構(gòu)完整性的重要因素之一。Cramer等認為鹽脅迫下植株體內(nèi)K+、Ca2+等元素含量下降，一方面是由于外界高濃度Na+顯著降低了K+、Ca2+等離子活度；另一方面是由于具有高度活性的單價離子如Na+、Cl-等競爭一些必需營養(yǎng)元素在膜上的運轉(zhuǎn)位點[21]。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫下加入不同濃度外源鈣可顯著降低菊花幼苗葉片的Na+含量，提高K+、Ca2+含量及Ca2+/Na+、K+/Na+ 來緩解菊花鹽害。隨著Ca2+濃度的升高，這種緩解效果呈先上升后下降的趨勢，其中以加入15 mmol/L Ca2+的T4處理效果最好。一方面可能是適宜濃度的Ca2+緩解了Ca2+不足引起的礦質(zhì)營養(yǎng)脅迫；另一方面可能是適宜濃度的Ca2+激活了與離子運輸有關的酶的活性，使植物體K+、Ca2+ 含量提高而Na+、Cl-含量下降，從而維持細胞內(nèi)離子平衡以減少離子脅迫帶給植物的傷害，與馬淑英等的研究結(jié)果[4，18，22]一致。

光合作用是植物生長發(fā)育的基礎[23-24]，葉綠素是光合作用的主要色素，其含量的高低在一定程度上反映了植物的同化能力的強弱。鹽脅迫下植物葉片中葉綠素含量下降，其主要原因是鹽脅迫提高了葉綠素酶的活性，促進了葉綠素的降解，從而導致葉綠素含量減小[25]。本研究結(jié)果表明，單純鹽脅迫顯著降低了菊花幼苗葉綠素含量，而加入一定濃度的Ca2+后，能夠顯著抑制葉綠素含量的下降，在一定程度上促進菊花在鹽脅迫下維持較高的光合速率。植物葉片凈光合速率的降低主要有由于氣孔的部分關閉導致的氣孔限制和葉肉細胞光合活性的下降導致的非氣孔限制2類，判斷依據(jù)是細胞間隙CO2濃度和氣孔導度的變化方向[26]。本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下加入不同濃度的Ca2+后，各處理的細胞間隙CO2濃度和氣孔導度均同步呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，因此認為此時期菊花凈光合速率下降的原因主要是由氣孔因子限制。本研究通過對凈光合速率等光合指標測定，結(jié)果表明一定濃度的Ca2+可以減輕鹽脅迫下菊花凈光合速率、氣孔導度、細胞間隙CO2濃度、蒸騰速率的下降程度，使其在一定程度上維持較高的光合速率。

綜上所述，菊花幼苗在鹽脅迫下加入一定濃度的Ca2+后能夠有效緩解鹽脅迫對菊花的傷害，且這種緩解效果隨著Ca2+濃度的升高表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，其中以加入15 mmol/L Ca2+的緩解效果最好。在鹽脅迫下，適宜濃度的Ca2+通過穩(wěn)定菊花的細胞膜結(jié)構(gòu)、抑制膜脂的過氧化、激活或抑制細胞膜上的各種離子通道，提高Ca2+/Na+、K+/Na+達到細胞內(nèi)外離子濃度平衡、減少鹽脅迫下形成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)所消耗的能量等途徑緩解鹽害效應，從而維持菊花幼苗較高的光合效率，提高菊花幼苗的耐鹽性。但當外源Ca2+濃度較高時，其緩解作用明顯減弱，高濃度Ca2+對植物生長的影響還有待于進一步研究。

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