李小靜+張瑞萍+閻振立+陳迪新+張恒濤+劉珍珍+過國南

摘要：使用樹干分段級數(shù)加權(quán)的方法進行田間自然病情調(diào)查，并結(jié)合田間接種和離體枝條接種的方法對秦冠×富士雜交F1代進行抗病性鑒定，分析了各抗性指標的次數(shù)分布和正態(tài)分布，以及各抗性指標間的相關(guān)性，研究了蘋果雜交F1代枝干輪紋病抗性的遺傳規(guī)律。結(jié)果表明，皮孔密度和大小與輪紋病抗性各指標間沒有顯著相關(guān)性；田間自然感病的級數(shù)加權(quán)感病高度和加權(quán)感病級數(shù)與田間接種的感病指數(shù)均呈顯著正相關(guān)；蘋果雜交F1代枝干輪紋病感病指數(shù)和離體侵染率均表現(xiàn)廣泛分離，呈偏正態(tài)分布?？梢姡浩た酌芏群痛笮〔灰俗鳛橹Ω奢喖y病抗性的直接鑒定指標；田間接種較離體接種更適合與田間自然病情調(diào)查相結(jié)合對枝干輪紋病抗性進行評價；蘋果枝干輪紋病抗性是數(shù)量性狀，可進一步對其進行QTL定位等研究，以期更早實現(xiàn)分子抗病性育種。

關(guān)鍵詞：蘋果雜交F1代；枝干輪紋??；抗性；遺傳規(guī)律

中圖分類號： S661.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0171-04

蘋果枝干輪紋病是由輪紋病菌[Botryosphaeria dothidea（Moug.） Ces. et de Not.]在蘋果枝干上侵染而引起的一種病害[1]，是目前我國蘋果生產(chǎn)上三大病害之一，病害嚴重時可削弱樹勢，造成死枝死樹。雖然傳統(tǒng)防治方法如藥劑防治能達到一定的防治效果，但是有些藥劑會產(chǎn)生環(huán)境污染等問題，應(yīng)用抗病品種能明顯減少病害的發(fā)生，可以減少藥劑防治可能產(chǎn)生的環(huán)境污染等問題的出現(xiàn)，因此開發(fā)和利用蘋果本身的抗病基因，進行抗病育種和遺傳改良，是解決病害的有效途徑。

鑒定和評價蘋果種質(zhì)資源對輪紋病的抗病性是選育和利用抗病品種防治輪紋病的基礎(chǔ)，蘋果抗病性不僅與品種的遺傳性有關(guān)，與環(huán)境條件也有關(guān)，即便是同一品種，在不同地點環(huán)境下抗病性鑒定結(jié)果也可能不一致[2-3]。所以，采用簡便、準確、實用、可靠的評價方法對蘋果種質(zhì)資源進行抗病性評價十分必要。目前蘋果抗病性的研究方法主要有田間自然病情調(diào)查和人工接種鑒定，此外還可通過抗病與感病品種枝條的性狀差異進行鑒定。有研究表明，皮孔是病菌入侵的主要途徑，通過調(diào)查富士蘋果枝干輪紋病不同部位的輪紋病發(fā)生頻率，發(fā)現(xiàn)皮孔部位發(fā)病頻率為92%，因此認為皮孔密度與輪紋病發(fā)生程度關(guān)系密切[4-5]。李廣旭等認為皮孔密度與枝干輪紋病病情指數(shù)存在明顯正相關(guān)[5]，閻振立等認為皮孔密度、皮孔密度和皮孔直徑之積均與蘋果枝干輪紋病的自然發(fā)病程度存在顯著正相關(guān)，可以此來判斷品種對枝干輪紋病的抗病程度[6]，但韓園園等以紅玉×金冠雜種后代為試材發(fā)現(xiàn)枝條皮孔密度與枝干接種輪紋病后的病情指數(shù)間均未見顯著相關(guān)性[7]。

迄今為止，國內(nèi)有關(guān)蘋果種質(zhì)資源對輪紋病抗病性的研究報道較多，不同蘋果種質(zhì)資源對蘋果輪紋病的抗病性存在明顯差異，生產(chǎn)上的富士、金冠、華冠等主栽品種均為感病品種，而秦冠、北之幸、雞冠對枝干輪紋病具有較強的抗性[6，8-9]。除了了解品種的抗性外，掌握果樹性狀的遺傳規(guī)律對于育種工作者來說也很重要，它是進行果樹雜交育種的前提和基礎(chǔ)。搞清楚性狀的遺傳特點對于進行基因連鎖分析、基因定位和基因圖譜的繪制以及有目的地進行基因分離和克隆也是有必要的，但是由于果樹基因高度雜合，對其進行病害的遺傳研究有一定難度，目前關(guān)于輪紋病抗性遺傳研究報道相對較少。為了初步分析蘋果枝干輪紋病抗性的遺傳規(guī)律，比較蘋果枝干輪紋病抗性的多種評價方式，了解各抗性指標間的相關(guān)性，本研究以抗病品種秦冠為母本、感病品種富士為父本的雜交F1代為試材，使用樹干分段級數(shù)加權(quán)的方法進行田間自然病情調(diào)查，并結(jié)合田間接種和離體枝條接種的方法對蘋果雜交F1代輪紋病抗性進行研究，以期獲得更簡單、有效、準確的蘋果輪紋病評價方法，為蘋果枝干輪紋病抗性育種提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所蘋果育種課題組以秦冠×富士雜交培育的202個實生后代F1代為試材。供試材料于2003年雜交，2004年春播種，立地條件及管理水平相同。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌制備 蘋果枝干輪紋病病原菌是由中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所病害研究課題組提供的ZZ26菌株，該菌株從鄭州市十里鋪果園枝干典型病瘤分離獲得[6]，通過蘋果輪紋病菌的遺傳多樣性分析，被認為是優(yōu)勢類群[10]。

菌株保存在4 ℃的PDA培養(yǎng)基（葡萄糖20 g、瓊脂20 g、馬鈴薯200 g、蒸餾水1 000 mL）中，接種前1周在25 ℃條件下活化、擴繁，選取長勢均勻一致的輪紋病菌用于接種。

1.2.2 田間自然病情調(diào)查 田間自然病情調(diào)查于2014年5月份進行，采用觀察法[11]并結(jié)合分段級數(shù)加權(quán)的方法，逐株調(diào)查枝干輪紋病自然發(fā)病情況，發(fā)病程度按6級標準（表1）進行分級。

測量每棵樹樹干的總感病高度；判斷其由根部開始往上感病部位的不同等級，并測量每個等級所對應(yīng)的樹干長度，二者相乘加權(quán)得出級數(shù)加權(quán)感病高度；級數(shù)加權(quán)感病高度除以總感病高度得出加權(quán)感病級數(shù)。

級數(shù)加權(quán)感病高度=∑（感病高度×感病級數(shù)）；

加權(quán)感病級數(shù)=級數(shù)加權(quán)感病高度/總感病高度。

1.2.3 田間接種抗性鑒定 參照閻振立等的方法[6]，用直徑為5 mm帶有病原菌絲體的培養(yǎng)基塊直接接種于枝條表面，并參考其分級標準進行病情調(diào)查，計算平均感病指數(shù)：

感病指數(shù)=100×∑（接種數(shù)×該接種處感病級數(shù)）/（接種總數(shù)×發(fā)病最高一級代表值）。

1.2.4 皮孔密度及大小測定 參照于秋香等的方法[12]，每株實生樹取1年生枝5條，每條枝截取直徑為0.6 cm、長為2.0 cm的枝段，40倍顯微鏡下調(diào)查皮孔數(shù)目，計算皮孔密度；每根枝條測定5個皮孔縱橫徑，取平均值計算皮孔面積。

皮孔密度（個/cm2）=皮孔數(shù)目/（枝段長×枝段寬）；

皮孔面積（mm2）=π×皮孔縱徑×皮孔橫徑/4。

1.2.5 離體接種抗侵染鑒定 離體接種參照周增強的方法[2]，以田間光滑無病瘤病斑的粗0.3 cm、長10 cm的一年生枝條作為接種材料，每條枝接種寬0.3 cm、長2 cm菌塊，重復3次；接種3 d后參照孫月麗等的方法[13]進行單皮孔培養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿接種20個，每個試材接種3皿，25 ℃恒溫培養(yǎng)，24 h后于40倍顯微鏡下觀察皮孔周圍是否有菌絲生成，有菌絲生成即表示皮孔被侵染，統(tǒng)計侵染情況。

侵染率=被侵染的皮孔數(shù)/調(diào)查的皮孔數(shù)×100%。

1.2.6 統(tǒng)計分析 應(yīng)用Excel 2003進行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 22.0進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間自然抗病性遺傳規(guī)律

田間自然抗病性鑒定表明，供試的202個單株均發(fā)病，加權(quán)感病級數(shù)在0～7.5之間。不同試材的田間加權(quán)感病級數(shù)存在較大分離，呈連續(xù)、偏正態(tài)分布，分布曲線向低加權(quán)感病級數(shù)偏移（圖1）。以加權(quán)感病級數(shù)≥1為感病、加權(quán)感病級數(shù)<1為抗病進行分級，抗病/感病的實生樹株數(shù)的分離比為54 ∶148，卡方檢驗結(jié)果符合1 ∶3的孟德爾分離規(guī)律。以級數(shù)加權(quán)感病高度≥100為感病，級數(shù)加權(quán)感病高度<100為抗病分級，抗病/感病的實生樹株數(shù)的分離比為49 ∶153，卡方檢驗結(jié)果符合1 ∶3的孟德爾分離規(guī)律（圖2）。以上結(jié)果可初步確定秦冠×富士雜交F1代田間自然抗病性有數(shù)量性狀遺傳的特點，蘋果枝干輪紋病抗性受1對主效基因控制。

2.2 田間接種抗病性遺傳規(guī)律

采用田間活體枝條接種方法對雜交后代單株進行輪紋病抗病性鑒定，結(jié)果表明供試的202個單株的感病指數(shù)在0～38.89之間。田間接種的感病指數(shù)存在較大分離，呈連續(xù)性分布，其次數(shù)分布圖呈偏正態(tài)分布，分布曲線向低感病指數(shù)偏移（圖3）。以感病指數(shù)≥8為感病，以感病指數(shù)<8為抗病分級，抗病/感病的實生樹株數(shù)的分離比為48 ∶154，卡方檢驗結(jié)果符合1 ∶3的孟德爾分離規(guī)律。以上結(jié)果可初步確定秦冠×富士雜交F1代田間接種抗病性有數(shù)量性狀遺傳的特點，蘋果枝干輪紋病抗性受1對主效基因控制。

2.3 皮孔密度和大小

不同試材皮孔密度和大小存在明顯差異，調(diào)查的113個單株試材間皮孔密度差異較大，從6.72～16.71個/cm2不等，皮孔大小從0.30～0.49 mm2不等，呈連續(xù)分布（圖4、圖5）。

2.4 離體抗侵染能力

對試材的1年生枝條接種后進行單皮孔再分離培養(yǎng)，通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同試材皮孔侵染情況存在差異，如單株271、單株275皮孔未被侵染，皮孔周圍沒有菌絲生成（圖6-a和圖6-b），單株303皮孔被侵染，皮孔周圍有菌絲生成（圖6-e）。

供試的209個單株離體侵染率存在較大分離，其數(shù)值從0～85.00%不等，呈連續(xù)性分布。以離體侵染率為抗病性指標的次數(shù)分布圖呈偏正態(tài)分布，分布曲線向低離體侵染率偏移（圖7）。以侵染率≤30%為抗侵染試材，侵染率>30%為易感染試材進行劃分，抗侵染試材/易感染試材的實生樹株數(shù)的分離比為78 ∶68，卡方檢驗結(jié)果符合1 ∶1的孟德爾分離規(guī)律。以上結(jié)果可初步確定秦冠×富士雜交F1代離體接種抗輪紋病菌侵染能力有數(shù)量性狀遺傳的特點，蘋果枝干輪紋病抗性受1對主效基因控制。

2.5 各鑒定指標間的相互關(guān)系

由表2可知，田間接種的感病指數(shù)與自然發(fā)病的級數(shù)加權(quán)感病高度、自然發(fā)病的加權(quán)感病級數(shù)的相關(guān)系數(shù)分別是0.188**、0.159*，呈顯著性相關(guān)；與皮孔面積的相關(guān)系數(shù)為0.031，而與離體侵染率和皮孔密度呈負相關(guān)。自然發(fā)病的級數(shù)加權(quán)感病高度和加權(quán)感病級數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.829**，表現(xiàn)出極顯著的相關(guān)性。離體侵染率與田間接種感病指數(shù)、自然發(fā)病的級數(shù)加權(quán)感病高度、自然發(fā)病的加權(quán)感病級數(shù)和皮孔密度均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.215**、-0.216**、-0.307**和-0.093，與皮孔面積呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.056。皮孔面積與田間接種感病指數(shù)、自然發(fā)病的級數(shù)加權(quán)感病高度和自然發(fā)病的加權(quán)感病級數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)為0.031、-0.016和-0.037。皮孔密度與田間接種感病指數(shù)、自然發(fā)病的級數(shù)加權(quán)感病高度和加權(quán)感病級數(shù)之間的相關(guān)系數(shù)為-0.112、0.160和0.143。自然發(fā)病的級數(shù)加權(quán)感病高度和加權(quán)感病級數(shù)均與田間接種感病指數(shù)均呈顯著性相關(guān)，說明田間接種的抗性表現(xiàn)情況與單株在自然狀態(tài)下的抗性情況較為相近。皮孔面積、皮孔密度與離體侵染率以及田間接種和自然發(fā)病2種感病方式下的抗性指標并沒有同時呈現(xiàn)出顯著相關(guān)性，僅有皮孔面積與離體侵染率呈正相關(guān)，說明皮孔面積和密度并不從根本上決定蘋果枝干輪紋病的抗病，而植株本身的抗性所起的決定作用更大。同時也認為不宜直接把皮孔的形態(tài)特征指數(shù)作為評價蘋果枝干輪紋病菌抗性的鑒定指標。

3 討論與結(jié)論

3.1 抗性評價方式選擇

在植物抗病性遺傳研究中，田間自然感病情況能夠十分直觀地體現(xiàn)植株的綜合抗性，雖然無法排除樹勢、其他病害或環(huán)境條件等因素的影響，但它仍然是抗病研究中較為重要的參考指標[14]。但也有研究表明雜種實生樹抗病性采用活體接種鑒定方法所得結(jié)果的準確性好[4，15]，許多學者將它與田間自然病情調(diào)查結(jié)合起來對輪紋病抗性進行評價。本研究借鑒前人的田間調(diào)查法，測定了級數(shù)加權(quán)感病高度，然后計算出加權(quán)發(fā)病級數(shù)。該測定方法考慮到了主干發(fā)病高度的差異、相同發(fā)病高度下發(fā)病級數(shù)的差異，旨在盡量消除植株本身的長勢差異導致的樹干本身高度的不同，更客觀地體現(xiàn)出植株本身對輪紋病的抗性。

本研究中田間接種和自然發(fā)病的抗性趨勢一致、呈顯著正相關(guān)，這與周增強等的研究結(jié)果[2]一致。閻振立等研究顯示自然調(diào)查和田間接種鑒定結(jié)果具有極顯著相關(guān)性[6]，本研究中二者相關(guān)性未達到極顯著水平，可能是由于本研究選的材料為重復發(fā)病的多年生植株，不僅枝干輪紋病菌群復雜，而且樹體生長又受到其他病害影響。

本試驗采用離體枝條接種單皮孔再分離的方法對輪紋病抗侵染能力進行了鑒定，研究結(jié)果表明離體接種與自然調(diào)查鑒定結(jié)果沒有顯著相關(guān)性。孫月麗等研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同抗性試材的抗侵染能力與抗病性基本一致，但也存在抗侵染能力與抗病性不統(tǒng)一的情況[13]。

前人研究認為皮孔密度與輪紋病發(fā)生程度關(guān)系密切，皮孔密度或皮孔密度與直徑之積可以作為鑒定輪紋病抗性的形態(tài)指標[3-4]。本研究結(jié)果表明皮孔形態(tài)指標與輪紋病抗性指標間無顯著相關(guān)性，不宜作為枝干輪紋病抗性的直接鑒定指標，這與韓園園等以紅玉×金冠后代分離群體為試材的研究結(jié)果[7]一致。

3.2 蘋果枝干輪紋病抗病性遺傳規(guī)律

本研究中秦冠×富士雜交F1代個體輪紋病抗性有較大的分離，呈偏正態(tài)分布，屬于1對主效基因控制多基因共同作用的數(shù)量性狀遺傳。蘋果枝干輪紋病抗性在雜交后代有較大分離，同時分離呈偏正態(tài)分布，這與郭興科等以西府海棠×珠美海棠、西府海棠×S19、西府海棠×P22雜交后代為試材的研究結(jié)果[3]相同。本研究認為蘋果輪紋病抗性為1對主效基因控制多基因共同作用的數(shù)量性狀，而劉志認為蘋果輪紋病為單一主效基因控制的質(zhì)量性狀[16]。在蘋果斑點落葉病的研究中，Saito等認為蘋果斑點落葉病的抗病性由隱性單基因控制[17]，而趙磊等認為該病抗性由2對主效基因控制多基因共同作用，同時受加性效應(yīng)控制[18]，這種差異可能是抗病性評價標準不同及雜種實生群體的遺傳背景不同造成的[19]。本試驗田間自然總感病指數(shù)和田間接種感病指數(shù)的孟德爾分離比均為1 ∶3，離體侵染率的孟德爾分離比為1 ∶1，這說明秦冠的蘋果枝干輪紋病的抗性和抗侵染性的控制基因及其遺傳規(guī)律是不同的。

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