蔡小東+Zhanao+Deng

摘要：以Tapestry彩葉芋（Caladium ×hortulanum Birdsey）未展開(kāi)葉片和葉柄薄層切片為外植體，研究了不同激素濃度配比對(duì)Tapestry彩葉芋愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及植株再生的影響。結(jié)果表明：在4種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生愈傷組織，其中2 mg/L TDZ和1 mg/L 6-BA是彩葉芋愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素配比；葉柄薄層切片是誘導(dǎo)愈傷組織的理想外植體，其愈傷組織誘導(dǎo)率均在90%以上；愈傷組織在MS基本培養(yǎng)基上增殖率最高，愈傷組織質(zhì)地致密，呈顆粒狀；誘導(dǎo)的愈傷組織分化能力很強(qiáng)，在附加有1 mg/L 6-BA和1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上再生了許多幼苗。

關(guān)鍵詞：彩葉芋；愈傷組織誘導(dǎo)；橫切薄層培養(yǎng)；植株再生

中圖分類號(hào)： S682.360.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0075-03

彩葉芋（Caladium×hortulanum Birdsey）為天南星科彩葉芋屬多年生草本觀葉植物，又稱花葉芋、五彩竿，原產(chǎn)南美洲熱帶地區(qū)。因其葉色、脈色、條紋、斑塊艷麗奪目，觀賞期較長(zhǎng)，常常用于盆栽觀賞、花圃栽培，在美化城市方面效果極佳[1-3]。為改良彩葉芋園藝性狀，增加其觀賞價(jià)值，培育新品種，常常采用商業(yè)品種與育種系列進(jìn)行有性雜交[1-2]。然而，彩葉芋花偏少、花期不固定、花粉及種子壽命短等因素極大地影響了有性雜交育種效率[4]。而且，目前有性雜交育種最大的問(wèn)題是，即使大量增加雜交后代的數(shù)量，雜交后代群體中新類型也越來(lái)越缺乏[1]。因此，有必要采用新的育種手段來(lái)培育彩葉芋新類型。

愈傷組織是快速繁殖、種質(zhì)保存、體細(xì)胞誘變、原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合、遺傳轉(zhuǎn)化及有用化合物生產(chǎn)等研究的理想起始材料。建立彩葉芋愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及再生體系，通過(guò)轉(zhuǎn)化或體細(xì)胞雜交等方法進(jìn)行彩葉芋品種的遺傳改良，在彩葉芋生物技術(shù)研究中具有重要的意義。本試驗(yàn)對(duì)彩葉芋愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖及小苗再生進(jìn)行了研究，以期為將來(lái)彩葉芋生物技術(shù)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Tapestry（Caladium×hortulanum Birdsey）彩葉芋是塊莖繁殖苗，種植于美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)海灣沿岸研究教育中心（the University of Floridas Gulf Coast Research and Education Center，Wimauma，F(xiàn)lorida，U.S.A.）溫室中。從溫室中剪取生長(zhǎng)良好的彩葉芋未展開(kāi)葉片和未展開(kāi)葉的葉柄備用。

1.2 外植體的處理

取Tapestry彩葉芋未展開(kāi)葉片和葉柄，在自來(lái)水下沖洗30 min后先用75%乙醇浸泡15 s，再用0.5%二氯異氰尿酸鈉（PhytoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，Kansas，U.S.A.）外加2～3滴吐溫-20浸泡20 min，其間輕輕振蕩4～5次。消毒處理后葉片葉柄分別用無(wú)菌水沖洗3次，再用無(wú)菌濾紙吸干葉片和葉柄表面的水分。然后在超凈工作臺(tái)上用手術(shù)刀片將消毒后的葉片切成約0.5 cm×0.5 cm小塊，葉柄則被橫切成1.5～2.0 mm厚的薄片。

1.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，在前人的研究[5-9]基礎(chǔ)上共設(shè)計(jì)了4種培養(yǎng)基用于Tapestry彩葉芋2種外植體愈傷組織的誘導(dǎo)，分別為CI1：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D；CI2：MS+1 mg/L TDZ+1 mg/L NAA；CI3：MS+2 mg/L TDZ+1 mg/L BA；CI4：MS+1 mg/L TDZ+1 mg/L 2，4-D。所有培養(yǎng)基均添加20 g/L蔗糖和7.0 g/L瓊脂，pH 值為5.8。每培養(yǎng)皿接種10～12個(gè)葉片切塊或18～20個(gè)葉柄薄層切片，試驗(yàn)重復(fù)3次。接種后放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃。60 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.4 愈傷組織的增殖

以MS為基本培養(yǎng)基，附加水解乳蛋白0.5 g/L及不同濃度的TDZ和KT，共設(shè)計(jì)5種培養(yǎng)基用于愈傷組織的增殖。將愈傷組織從原來(lái)的外植體上剝離下來(lái)，切成固定大小，稱取約0.5 g愈傷組織分別接種于愈傷組織增殖培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種5瓶。接種后進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±2） ℃。30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織增殖率。

愈傷組織增殖率=（增殖后質(zhì)量-增殖前質(zhì)量）/增殖前質(zhì)量×100%。

1.5 植株再生

挑選直徑在0.4 cm左右的愈傷組織塊，轉(zhuǎn)入含有1 mg/L 6-BA和1 mg/L NAA的分化培養(yǎng)基中，在光照條件下培養(yǎng)，光照度為2 000 lx 左右，光—暗周期16 h—8 h，溫度（25±2） ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種外植體愈傷組織形成的過(guò)程

外植體接種7 d后開(kāi)始觀察愈傷組織的形成過(guò)程，結(jié)果如圖1所示：雖然不同培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)彩葉芋2種外植體產(chǎn)生愈傷組織，但這2種外植體愈傷組織形成過(guò)程各不相同。Tapestry彩葉芋未展開(kāi)葉片切塊在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，葉片邊緣慢慢向上拱起，切口邊緣處顏色漸漸變淡，開(kāi)始膨大。培養(yǎng)1個(gè)月后，部分葉片切口附近開(kāi)始出現(xiàn)淡黃色愈傷組織。培養(yǎng)2個(gè)月后，在添加有2 mg/L TDZ和1 mg/L BA的CI3培養(yǎng)基上葉片切口處再生了大量淡黃色顆粒狀愈傷組織（圖1-C），而在其他3種培養(yǎng)基上只再生了少量致密的愈傷組織（圖1-A、B、D）。葉柄薄層切片愈傷組織發(fā)生時(shí)間要早10 d左右，培養(yǎng)20 d后，葉柄薄層切片邊緣就開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織。培養(yǎng)至2個(gè)月時(shí)，在這4種培養(yǎng)基上，葉柄薄層切片四周及表面即布滿了大量淡黃色愈傷組織（圖1-E、F、G、H）。并且在附加0.5 mg/L和0.1 mg/L 2，4-D的CI1培養(yǎng)基上（圖1-A、E），2種外植體誘導(dǎo)的愈傷組織有少量分化出胚狀體，甚至有芽和根的再生。這些在CI1培養(yǎng)基上再生的愈傷組織繼續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月后，愈傷組織體積繼續(xù)增大，部分分化為胚狀體，并且再生了許多具有根和芽的小苗。這說(shuō)明CI1培養(yǎng)基非常適合于彩葉芋愈傷組織的分化。

2.2 不同激素組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

激素的種類及其濃度組合是調(diào)控外植體產(chǎn)生愈傷組織的主導(dǎo)因素。外植體接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上2個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果如表2所示：這2種外植體在不同種類和濃度激素的誘導(dǎo)下，都能產(chǎn)生愈傷組織，但對(duì)不同種類激素的反應(yīng)不同。對(duì)于未展開(kāi)葉片切塊，CI3培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)92.8%，顯著高于其他處理（P<0.05）。對(duì)于葉柄薄層切片，所設(shè)計(jì)的4種培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率均在90%以上，其中CI3培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率也是最高，達(dá)到97.9%，但這4種培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率之間沒(méi)有顯著性差異。這表明彩葉芋愈傷組織的誘導(dǎo)對(duì)激素的適應(yīng)范圍比較廣，是很容易誘導(dǎo)愈傷組織的單子葉植物。葉柄薄層切片愈傷組織誘導(dǎo)效果優(yōu)于葉片切塊，而2 mg/L TDZ和1 mg/L6-BA 是彩葉芋愈傷組織誘導(dǎo)的理想激素組合。

2.3 不同激素組合對(duì)愈傷組織增殖的影響

雖然本研究中2種外植體在適宜的培養(yǎng)基上均能形成愈傷組織，但數(shù)量相對(duì)較少。為獲得狀態(tài)良好、足夠數(shù)量的彩葉芋愈傷組織，需進(jìn)行增殖培養(yǎng)。試驗(yàn)比較了不同濃度TDZ和NAA組合對(duì)彩葉芋愈傷組織增殖的影響。表2結(jié)果顯示，培養(yǎng)1個(gè)月后，愈傷組織在這些培養(yǎng)基上均實(shí)現(xiàn)了不同程度的增殖。其中未添加任何激素的CP1培養(yǎng)基上，愈傷組織增殖率達(dá)到517.1%，顯著高于其他處理。然而，如圖2-A和2-B所示，這些愈傷組織在所有這些培養(yǎng)基上雖然能夠快速增殖，但是愈傷組織仍然呈現(xiàn)顆粒狀。少數(shù)愈傷組織再生了胚狀體，甚至還再生了芽或根（圖2-A），這可能是由于添加一定濃度的TDZ和NAA促使愈傷組織發(fā)生了分化。在解剖顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，這些愈傷組織大多呈顆粒狀，結(jié)構(gòu)較致密（圖2-C）。

2.4 小苗的再生

愈傷組織在附加有1 mg/L 6-BA和1 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)1個(gè)月后，再生了大量帶有根和芽的小苗。所有愈傷組織塊均再生了帶有芽和根的幼苗，且單個(gè)愈傷組織塊可分化出多棵小苗。這些小苗葉片是綠色的，沒(méi)有彩色葉脈和彩色斑點(diǎn)。當(dāng)小苗長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶時(shí)，培養(yǎng)基表面還生長(zhǎng)有大量愈傷組織和胚狀體。

3 討論

愈傷組織的產(chǎn)生是不同種類及濃度激素相互作用的結(jié)果。6-BA、2，4-D、TDZ等是外植體誘導(dǎo)愈傷組織所常采用的激素，6-BA能刺激愈傷組織的形成，2，4-D在誘導(dǎo)脫分化和細(xì)胞增殖方面效果較為明顯，而TDZ是一種具有很強(qiáng)細(xì)胞分裂素活性的激素，具有促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)的作用。前人研究表明，彩葉芋在組織培養(yǎng)中對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的適應(yīng)范圍比較廣[5-10]。如王穎等在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，彩葉芋在不同組合的激素培養(yǎng)下都能產(chǎn)生愈傷組織，再生出小植株，但是愈傷組織啟動(dòng)時(shí)間、愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織分化率不同[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在4種不同激素配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生愈傷組織，這與前人的研究結(jié)果是一致的。

此外，植物葉片、莖尖、葉柄、葉脈及子葉等是愈傷組織誘導(dǎo)常用的外植體。彩葉芋一般以葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，葉柄薄層切片作為外植體在彩葉芋離體培養(yǎng)中鮮見(jiàn)報(bào)道[11]。橫切薄層培養(yǎng)（transverse thin cell layer culture，tTCL）是指將外植體橫切成大約1 mm厚的切片進(jìn)行培養(yǎng)的方法。本研究中以彩葉芋未展開(kāi)葉片和葉柄薄層切片為外植體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葉柄薄層切片是誘導(dǎo)愈傷組織的理想外植體，其愈傷組織誘導(dǎo)率均在90%以上。這可能是由于薄層培養(yǎng)具有組織結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、對(duì)調(diào)控因子敏感、培養(yǎng)易成功等優(yōu)點(diǎn)[12]。

優(yōu)良的愈傷組織應(yīng)具備質(zhì)地疏松、增殖迅速、分化容易等特點(diǎn)[13]。狀態(tài)良好的愈傷組織是原生質(zhì)體操作、體細(xì)胞雜交、轉(zhuǎn)基因、植株再生等的重要基礎(chǔ)。本研究中獲得的愈傷組織大多顆粒較大，結(jié)構(gòu)致密，易于分化成苗，適合于組培快繁，但不適合于原生質(zhì)體培養(yǎng)等研究。因此，彩葉芋愈傷組織在繼代保存、愈傷組織懸浮系的建立等方面仍需進(jìn)一步研究。

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