陸玉建+王書平+王寧寧+劉俊華+高春明

摘要：以普通小麥的成熟胚為試驗材料，研究不同激素組合對小麥愈傷組織誘導和植株再生的影響。結果表明，小麥愈傷組織誘導效果最好的培養(yǎng)基為W5[MS+0.5 g/L 水解絡蛋白（CH）+2.0 mg/L 2，4-D+0.15 g/L天冬酰胺（Asn）]，在此培養(yǎng)基中，成熟胚產(chǎn)生的愈傷組織質量最好，誘導率最高。對于不定芽誘導，最適培養(yǎng)基為WF8（MS+0.5 g/L CH+4.0 mg/L KT+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA），在此培養(yǎng)基中，愈傷組織分化產(chǎn)生的不定芽數(shù)量最多，速度最快，分化率最高。比較適宜誘導生根的培養(yǎng)基為WR4（1/2MS+0.5 g/L CH+0.5 mg/L NAA），在此培養(yǎng)基中，不定芽生根速度最快，數(shù)量最多，并且較為粗壯。本試驗旨在探索小麥組織培養(yǎng)的最適條件，為今后通過基因工程手段改良小麥的品質奠定基礎。

關鍵詞：小麥；成熟胚；愈傷組織；不定芽；再生體系

中圖分類號： S512.104.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0067-04

小麥為禾本科小麥屬植物，是世界上最早栽培的重要農(nóng)作物之一[1]。小麥品質的改良是提高小麥產(chǎn)量的主要措施，而穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系的建立則是小麥育種的重要基礎和保證[2]。目前，有關小麥愈傷組織的誘導、分化和再生已有不少的報道，但小麥植株再生率低，建立穩(wěn)定的再生體系比較困難[2-6]。影響小麥再生的因素有很多，包括外植體來源、基因型、生理狀態(tài)和培養(yǎng)條件等[3，5-8]。建立高效的植株再生體系需要良好的外植體來源。小麥幼胚是公認的最好的外植體源，其愈傷組織誘導效果好，植株再生能力強，且以幼胚為轉化受體，已成功獲得轉基因植株[2，6，9]。雖然小麥幼胚再生能力強，但取材受時間和空間限制，適宜轉化的生理狀態(tài)難以掌握，轉化周期也比較長；而成熟胚取材方便、生理狀態(tài)一致、不受生長季節(jié)限制，是組織培養(yǎng)和遺傳轉化理想的外植體[7，10-12]。

現(xiàn)階段，雖然有關小麥成熟胚離體培養(yǎng)方面的研究較多，但穩(wěn)定的高頻率植株再生體系仍未建立，因此本試驗以黃河流域廣泛種植的普通小麥豫寶1號成熟胚為外植體，研究不同激素組合對小麥愈傷組織誘導和不定芽分化的影響，進而獲得比較適合成熟胚高效再生的培養(yǎng)基類型。通過探索小麥組織培養(yǎng)的最適條件，為今后小麥遺傳轉化體系的建立和品質的改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為普通小麥種子（豫保1號），由濱州學院生命科學系基因工程實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 MS基本培養(yǎng)基的制備 在小麥組織培養(yǎng)過程中，采用MS或1/2MS作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中均添加3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH值為5.8。

1.2.2 愈傷組織誘導培養(yǎng)基的配制 以MS為基本培養(yǎng)基，添加一定濃度的水解酪蛋白（CH）、2，4-D、NAA、天冬酰胺（Asn）或谷氨酰胺（Gln），配制小麥愈傷組織誘導培養(yǎng)基（表1）。

1.2.3 分化培養(yǎng)基的配制 在基本培養(yǎng)基的基礎上，配制誘導小麥分化的培養(yǎng)基（表2）。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的配制 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，配制誘導小麥生根培養(yǎng)基（表3）。

1.2.5 小麥種子的消毒及成熟胚的剝離 挑取籽粒飽滿的小麥種子，用水浸泡，26 ℃處理24 h左右，70%乙醇消毒5 min，HgCl2處理15 min，無菌水沖洗5～6次，剝胚，然后接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，26 ℃暗培養(yǎng)15 d。

1.2.6 愈傷組織的增殖培養(yǎng) 選取生長良好的愈傷組織，除胚，將愈傷組織接種到增殖培養(yǎng)基中，26 ℃暗培養(yǎng)2周；選擇生長效果較好的愈傷組織繼續(xù)進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)基的類型和培養(yǎng)條件不變。

1.2.7 不定芽的誘導 選取增殖效果比較好的愈傷組織，接種到不定芽誘導培養(yǎng)基中，放入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d左右。

1.2.8 生根誘導 當不定芽的長度5～6 cm時，切取生長較為健壯的不定芽，接種到生根培養(yǎng)基中，誘導不定芽生根。

1.3 結果觀測與統(tǒng)計

成熟胚接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，15 d后進行第1次繼代培養(yǎng)，統(tǒng)計愈傷組織誘導率；愈傷組織經(jīng)過2次繼代培養(yǎng)，然后進行不定芽誘導，分別于接種后15、30 d統(tǒng)計不定芽分化率；不定芽接種到生根培養(yǎng)基中30 d后統(tǒng)計生根率。有關計算公式如下：出愈率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

分化率=產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

生根率=產(chǎn)生不定根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 17.0軟件進行方差分析及Duncans多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 愈傷組織的誘導

根據(jù)前期預試驗的結果，選取12種培養(yǎng)基進行小麥愈傷組織的誘導。采用微損法將消毒后的小麥剝胚，接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基中（圖1-A），26 ℃暗培養(yǎng)約1周，可以觀察到胚上已有明顯的白色透明的愈傷組織產(chǎn)生（圖1-B）；繼續(xù)培養(yǎng)15 d，愈傷組織體積明顯增大，形成蓬松的球形（圖1-C），統(tǒng)計愈傷組織誘導率并進行繼代增殖。圖2表明，在W1～W12這12種愈傷組織誘導培養(yǎng)基中，W5的誘導效果最好，愈傷組織誘導率超過90%，差異極顯著（P<0.01）。通過分析愈傷組織的誘導情況，初步獲得比較適合愈傷組織誘導的培養(yǎng)基類型。

2.2 愈傷組織的繼代增殖

挑取生長良好的小麥愈傷組織，接種到增殖培養(yǎng)基（W5）中，26 ℃暗培養(yǎng)2周后觀察愈傷組織的生長情況（圖1-D），由此可以看到愈傷組織細胞分裂旺盛，體積明顯增大，但結構還不夠致密；將愈傷組織再次繼代培養(yǎng)2周，愈傷組織的團塊繼續(xù)增大，細胞排列更加緊密，適合不定芽的誘導培養(yǎng)（圖1-E）。

2.3 不定芽的形成

將繼代培養(yǎng)后的小麥愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中進行不定芽誘導，于26 ℃下光照培養(yǎng)。愈傷組織接種2 d后，可以觀察到部分愈傷組織的顏色開始變綠，出現(xiàn)少量的深綠色芽點；分化培養(yǎng)2周左右即可清楚地看到愈傷組織塊上長出成簇的不定芽（圖1-F）。繼續(xù)培養(yǎng)30 d左右，產(chǎn)生不定芽的愈傷組織增多，不定芽生長旺盛（圖1-G）。對統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)（圖3），在愈傷組織分化誘導后15 d，不定芽分化率較低，最高在15%左右；當分化誘導30 d時，不定芽分化率迅速提高，最高達到60%。顯著性分析表明，在WF1～WF8這8種不定芽誘導培養(yǎng)基中，WF5～WF8的誘導效果較好，和WF1～WF4之間存在極顯著差異。在WF5～WF8這4種培養(yǎng)基中，WF8誘導愈傷組織分化的效果則最好。此外，通過觀察愈傷組織的分化情況，發(fā)現(xiàn)愈傷組織在WF1～WF4這4種培養(yǎng)基中主要分化產(chǎn)生大量的不定根，而不定芽則極少。通過分析愈傷組織不定芽的誘導情況，初步獲得比較適合愈傷組織分化的培養(yǎng)基類型。

2.4 生根誘導

切取生長健壯的不定芽，接種到生根誘導培養(yǎng)基WR1～WR6中進行生根誘導，誘導培養(yǎng)30 d后，即可獲得試管苗（圖1-H）。在這6種生根培養(yǎng)基中，不定芽均可誘導產(chǎn)生根，且在WR4中不定芽產(chǎn)生根的效果最好，生根率超過50%（圖4）。顯著性分析表明，WR4和其他5種生根培養(yǎng)基之間存在極顯著差異。

3 結論與討論

小麥在長期種植的過程中，由于受到諸多因素的影響，其產(chǎn)量及品質不斷下降，利用基因工程技術是提高小麥產(chǎn)量和改良小麥品質的有效途徑。雖然目前有關小麥遺傳轉化的研究較多，但效果不佳，其中限制因素之一就是小麥植株的再生頻率低，建立穩(wěn)定的再生體系比較困難。因此，如何建立起高效的小麥再生體系是提高小麥產(chǎn)量和品質面臨的重要問題。本試驗以小麥成熟胚為外植體，通過研究不同激素組合對小麥愈傷組織誘導、分化以及植株再生的影響，以此探索小麥組織培養(yǎng)的最適條件。與幼胚相比，成熟胚的取材方便容易，不受季節(jié)限制，因此逐漸成為小麥組織培養(yǎng)的首選材料。在小麥無性系建立的過程中，乙醇和HgCl2處理種子的時間要適度，70%乙醇消毒5 min，HgCl2處理15 min效果較好。時間太短，消毒不徹底，污染率較高；時間過長，影響胚的活性，愈傷組織的能力下降。成熟胚的剝離是一個重要環(huán)節(jié)，剝胚前，須事先將種子浸泡，再于26 ℃下處理24 h左右，為的是使種子膨脹疏松，從而利于剝胚，其中浸泡的時間不宜過長，否則造成種子腐爛，胚易破碎且活力下降，愈傷組織誘導率下降；浸泡的時間也不宜過短，否則種子比較堅硬，胚難剝離。CH營養(yǎng)豐富，是多種氨基酸混合物，對胚狀體、不定芽的分化具有良好的促進作用。在小麥成熟胚培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加0.5 g/L CH有利于愈傷組織誘導和不定芽分化。生長素的主要作用為誘導愈傷組織的形成和根的分化，促進根、莖、芽的生長。2，4-D可以促進細胞脫分化，產(chǎn)生愈傷組織，因此是愈傷組織誘導過程中比較常用的生長素類似物。通過比較小麥愈傷組織的誘導情況可以看出，2.0 mg/L 2，4-D對于小麥成熟胚愈傷組織的形成非常重要，而NAA的效果似乎并不明顯。Asn或Gln是培養(yǎng)基中重要的有機氮源，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的Asn或Gln有助于小麥愈傷組織的誘導。Asn和Gln相比，0.15 g/L Asn對小麥愈傷組織誘導的促進作用更明顯。因此，在小麥成熟胚誘導過程中，可在添加2，4-D和CH的基礎上，在培養(yǎng)基中附加一定含量的Asn或Gln，從而能夠獲得質量較高的愈傷組織，這對于隨后進行的愈傷組織分化培養(yǎng)很有必要。如果直接將小麥的愈傷組織進行分化誘導，往往不能產(chǎn)生不定芽，可能是因為初期產(chǎn)生的愈傷組織結構疏松，主要為非胚性愈傷組織，但通過2次繼代培養(yǎng)，可以使愈傷組織的結構變得更為致密，胚性愈傷組織的比例大大提高，從而有利于不定芽的誘導。在小麥愈傷組織的分化誘導過程中，WF8的效果最好，愈傷組織的分化率最高，不定芽產(chǎn)生的速度快、數(shù)量多，但不定根的產(chǎn)生則不明顯。在前4種分化培養(yǎng)基中，愈傷組織產(chǎn)生不定芽的速度要慢得多，數(shù)量極少，并且有大量的不定根形成。對照各培養(yǎng)基的成分發(fā)現(xiàn)，在KT濃度為1.0～4.0 mg/L時，其含量的變化對不定芽的誘導率影響不大，但在培養(yǎng)基中加入NAA和6-BA后，不定芽的誘導率明顯提高，說明NAA和6-BA對不定芽誘導影響較大，是愈傷組織分化過程中起關鍵作用的激素。而培養(yǎng)基中包含NAA和6-BA的前提下，KT濃度達到4.0 mg/L 時，不定芽的分化率顯著提高，可見只有在合適種類和濃度激素的協(xié)同作用下，小麥愈傷組織的分化方可達到比較理想的效果。對于小麥生根誘導，應用1/2MS作為基本培養(yǎng)基，附加一定濃度NAA和IBA均可促進根的生成，但NAA的效果要優(yōu)于IBA，其中比較適宜的NAA濃度為0.5 mg/L，在此濃度下，不定芽生根速度快，數(shù)量多，根系較為發(fā)達。

在小麥組織培養(yǎng)過程中，不同種類和含量的激素組合在愈傷組織誘導和再生植株的獲得方面具有不同的效果。本研究通過探索小麥組織培養(yǎng)的最適條件，并初步建立起較為穩(wěn)定的小麥再生體系，本試驗結果對于今后小麥遺傳轉化體系的建立和品質的改良具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

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