傅冰

摘要：基于相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）建立地木耳菌株的特定序列擴(kuò)增（sequence characterized amplified regions，SCAR）標(biāo)記。通過隨機引物組合篩選獲得EM18-ME7作為SRAP標(biāo)記引物，擴(kuò)增地木耳基因組后獲得1.2 kb大小的特異性條帶，經(jīng)克隆、測序，根據(jù)測序結(jié)果利用Primer 5.0軟件設(shè)計出2對特異性引物，其中引物F-9-F1、F-9-R1經(jīng)SCAR-PCR擴(kuò)增出約1.1kb大小的特異性片段，說明成功構(gòu)建了“菌株3”的指紋圖譜。

關(guān)鍵詞：SRAP；SCAR；地木耳；分類鑒定；指紋圖譜；快速鑒定；種質(zhì)資源分類

中圖分類號： S646.602 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0064-03

地木耳（Nostoc commune Vauch）俗稱地皮菜、地耳、地軟、地衣、地?fù)炱さ龋且环N固氮型藍(lán)細(xì)菌，屬細(xì)菌界藍(lán)細(xì)菌門念珠藍(lán)細(xì)菌屬光能自養(yǎng)微生物，在全國廣泛分布，特別適宜在潮濕陰暗處生長。地木耳富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素等，特別是蛋白質(zhì)含量占干質(zhì)量的20%以上，營養(yǎng)價值極高[1-2]，中國多地均有將其入菜的習(xí)慣。已有研究發(fā)現(xiàn)，地木耳提取物還具有一定的抗氧化、抑菌以及提高免疫力的功效，甚至具有抑制老年癡呆以及抗腫瘤的功效，《本草綱目》《中國藥典》亦記載了地木耳的藥用價值[3-4]。這主要是由于地木耳中的黃酮、多糖、藻藍(lán)蛋白等活性成分在起作用，研究人員分別對這些物質(zhì)的理化性質(zhì)及分離提取進(jìn)行了研究。刁毅等發(fā)現(xiàn)從地木耳中提取的脂溶性物質(zhì)對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等6種細(xì)菌有較好的抑制作用[5]；錢森和等研究同樣證明了地木耳提取物對常見微生物具有較好的抑制作用[6]。張?zhí)苽サ韧ㄟ^研究地木耳多糖的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)其對·OH、DPPH自由基有較強的清除作用，但對O-2[KG-*2]· 和亞硝酸鹽的清除作用較小；同樣，該研究也發(fā)現(xiàn)，地木耳多糖對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等微生物有一定的抑制作用[4]。Ploutno等發(fā)現(xiàn)，地木耳的活性物質(zhì)具有抑制人鼻咽癌及直腸癌腫瘤細(xì)胞的效果[7-8]。張?zhí)苽サ炔捎肔9正交試驗研究時間、液料比、溫度對地木耳多糖提取的影響，得到最佳提取工藝：控制溫度為90 ℃、液料比60 mL ∶1 g的條件提取5次，提取時間為3 h，得率可達(dá)13.75%[9]。厲榮玉等通過研究得到地木耳總黃酮提取的最佳工藝：控制溫度為80 ℃、乙醇濃度為70%、料液比為1 g ∶20 mL的條件下提取2次，提取時間為2.5 h，得率可達(dá)6.84%[10]。梁文裕建立了通過鹽析、離子交換層析、凝膠過濾層析的分離純化地木耳藻藍(lán)蛋白α、β亞基的程序[11]。李三相等利用羥基磷灰石的柱層析以及鹽析、透析的方法分離得到地木耳的藻藍(lán)蛋白[12]。

由此可見，地木耳是一種很好的食品開發(fā)資源。李賢煜等研發(fā)出普通型地木耳蛋白飲料、酸性地木耳蛋白飲料2種配方[13]；張宗舟開發(fā)了辣味地木耳醬，具有口味好、營養(yǎng)價值高等特點[14]。

地木耳雖然分布廣泛，但是對生長環(huán)境要求較為嚴(yán)苛，野生資源難以滿足市場需求，阻礙了其大規(guī)模開發(fā)。因此，部分學(xué)者對地木耳的人工栽培進(jìn)行了研究。王東明等通過研究打漿后的地木耳在一定條件下的栽培情況發(fā)現(xiàn)，漿體所含的片段可逐漸恢復(fù)生長[2]。鄧中洋等研究跑道式培養(yǎng)池規(guī)?；囵B(yǎng)地木耳結(jié)果表明：在適宜條件下，可以實現(xiàn)地木耳的人工栽培[15]。同時，利用地木耳對環(huán)境因素敏感的特點，地木耳可以運用到環(huán)境污染的監(jiān)測中。楊學(xué)山等利用地木耳掛袋法監(jiān)測大氣SO2污染[16]；馬驥等利用地木耳的pH值監(jiān)測大氣污染的試驗[17]均證明此觀點。

目前，地木耳在分子標(biāo)記方面的研究很少，僅有趙惠玲等利用隨機引物及簡單重復(fù)序列區(qū)間（ISSR）引物初步研究地木耳的分子生物學(xué)特性[18]。特定序列擴(kuò)增（sequence characterized amplified regions，SCAR）分子標(biāo)記有別于傳統(tǒng)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有遺傳一致、序列已知、高效且重復(fù)性好等特點，已經(jīng)廣泛運用到黑木耳[19]、棉花[20]、草魚[21]等抗病育種以及分類鑒定中。本研究擬通過基于相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）分子標(biāo)記的SCAR標(biāo)記技術(shù)建立地木耳菌株的指紋圖譜，為地木耳菌株的快速鑒別、種質(zhì)資源分類等提供便利。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 地木耳菌株 供試地木耳菌株由麗水職業(yè)技術(shù)學(xué)院王東明老師提供，共10株，具體特征見表1。

1.1.2 儀器與試劑

1.1.2.1 儀器 Eppendorf Mastercycler personal PCR儀，德國；WEALTEC Dolphin-DOC凝膠成像系統(tǒng)，美國；DK-S24電熱恒溫水浴鍋，中國；HERMLEZ 300 K高速冷凍離心機，德國；SHIMADZU Corporation UV-1700紫外分光光計，日本。

1.1.2.2 試劑 DNA Marker：Trans 2k，北京全式金生物技術(shù)有限公司；EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；Taq酶；EasyTaq，北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 地木耳基因組的提取 用EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒提取地木耳基因組，用瓊脂糖凝膠電泳及UV-1700紫外分光光度計檢測DNA的濃度及質(zhì)量。

1.2.2 SRAP-PCR反應(yīng)體系及程序 參照李媛媛等研究[19，22]，設(shè)計地木耳SRAP-PCR擴(kuò)增體系及程序，經(jīng)實際驗證后，確定擴(kuò)增體系：2.5 mmol/L MgCl2、100 μmol/L dNTPs、0.8 U Taq 酶、40 ng DNA、2 μL 10×Reaction buffer，0.3 μmol/L 上游引物，0.3 μmol/L下游引物，用無菌蒸餾水將總體積補至20 μL。SRAP-PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，36 ℃ 1 min（退火溫度視引物Tm值而定），72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.2.3 引物篩選 SRAP引物序列見表2、表3，引物由北京全式金生物技術(shù)有限公司合成。隨機組合正、反向引物對地木耳基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出能擴(kuò)增出特異性條帶的引物組合。

1.2.4 SCAR特異性條帶測序及引物設(shè)計 利用篩選出的引物組合擴(kuò)增10個地木耳基因組DNA，選擇明亮、清晰的特異性條帶進(jìn)行膠回收、克隆并測序。根據(jù)測序結(jié)果，用Primer-5.0 軟件設(shè)計特異性引物轉(zhuǎn)化生成SCAR標(biāo)記。

1.2.5 SCAR標(biāo)記的建立 利用獲得的SCAR標(biāo)記擴(kuò)增10個地木耳基因組，驗證所獲得的SCAR標(biāo)記。參考丁煒東等研究[21，23]，優(yōu)化地木耳SCAR-PCR反應(yīng)體系：2.5 mmol/L MgCl2、120 μmol/L dNTPs、1.0 U Taq 酶、 40 ng DNA、2 μL10×Reaction buffer，各0.4 μmol/L上下游引物，補水至總體積為20 μL。優(yōu)化后的程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，61 ℃45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物組合的篩選

隨機組合表2、表3中的正反向引物，以菌株1基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并電泳檢測，結(jié)果見圖1。從中篩選出能擴(kuò)增出條帶較多且清晰、明亮的一系列引物組合：EM6-ME5、EM18-ME8、EM18-ME7、EM12-ME7、EM15-ME9。

2.2 特異性條帶的篩選及測序

進(jìn)一步利用所篩選的引物組合對10株菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終篩選出能擴(kuò)增出特異性條帶的引物組合EM18-ME7。利用篩選出的引物組合EM18-ME7進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖2。在擴(kuò)增出的位點（DNA條帶）中，挑選出1個條帶清晰、明亮且特異性明顯的DNA擴(kuò)增位點（1.2 kb），膠回收后交予南京百斯凱科技有限公司測序，成功獲得1個序列，詳見圖3，該序列長度共計1 211 bp。

2.3 SCAR特異性引物的設(shè)計與合成

根據(jù)測序結(jié)果，利用Primer 5.0軟件設(shè)計2對特異性引物。引物組合1：F-9-F1：5′-GTATGTACTGAGTAGTAGCC-3′；F-9-R1：5′-TGATCCATTGACATGGCGTC-3′。引物組合2：F-9-F2：5′-GCAACGAAGTTGATTGCCTC-3′；F-9-R2：5′-TGACTGACAACTGACT GAGC-3′。

2.4 SCAR標(biāo)記的建立

分別利用 2對引物對10個供試菌株的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中引物組合F-9-F1、F-9-R1成功在泳道“菌株3”中擴(kuò)增出1條1.1 kb的特異性條帶（圖4），說明成功構(gòu)建了“菌株3”的指紋圖譜；而F-9-F2與F-9-R2組合未能擴(kuò)增出SCAR標(biāo)記。

3 結(jié)果與討論

本研究隨機組合SRAP引物，對10個地木耳基因組進(jìn)行SRAP-PCR，篩選獲得能擴(kuò)增出特異性條帶的引物組合EM18-ME7，進(jìn)一步通過PCR獲得1條1.2 kb的特異性條帶，經(jīng)膠回收、克隆及測序后，利用Primer 5.0軟件設(shè)計2對特異性引物：F-9-F1，F(xiàn)-9-R1；F-9-F2，F(xiàn)-9-R2，通過SCAR-PCR擴(kuò)增10個地木耳基因組，其中引物組合 F-9-F1、F-9-R1在“菌株3”處成功擴(kuò)增出1條1.1 kb的特異性條帶，說明SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化成功，并成功構(gòu)建了其指紋圖譜，證明該方法是鑒定地木耳種內(nèi)、種間差異的有效手段。

目前，有些文獻(xiàn)資料把地木耳歸為植物，有些將其歸為微生物，但根據(jù)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)[24]應(yīng)屬原核微生物，因此認(rèn)為其歸屬細(xì)菌界藍(lán)細(xì)菌門念珠藍(lán)細(xì)菌屬光能自養(yǎng)微生物更為科學(xué)。在SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)轉(zhuǎn)化不成功的現(xiàn)象，究其原因可能是引物設(shè)計不合理、序列相似或者多拷貝以及甲基化作用等[25]，甚至PCR反應(yīng)條件也會影響最終結(jié)果。本研究設(shè)計了2對特異性引物，最終僅F-9-F1/F-9-R1引物組合成功轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，可能在引物設(shè)計及反應(yīng)條件上出現(xiàn)了問題。

隨著地木耳經(jīng)濟(jì)價值的日漸顯現(xiàn)，相信對于地木耳的研究將更加深入，本研究結(jié)果將為地木耳的抗病篩選、遺傳育種以及分類鑒定等提供一定的理論依據(jù)。

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