付強(qiáng)+鄒頡+余婧+趙杰宏+任學(xué)良

摘要：為研究煙草識(shí)別病毒并將其降解為蛋白酶體基因，以擬南芥的蛋白酶體α2型亞單位基因全長cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：AF043520.1）為信息探針，用電子克隆的方法從煙草栽培品種中克隆到1個(gè)蛋白酶體基因NtPAB1，并對(duì)其進(jìn)行序列分析。結(jié)果表明，NtPAB1包含完整的開放讀碼框，編碼219個(gè)氨基酸，含有1個(gè)保守域proteasome_alpha_type_2；通過同源比對(duì)和進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，NtPAB1氨基酸序列與葡萄PAB1的序列一致性達(dá)到98%。以上結(jié)果表明，NtPAB1是栽培煙草中未報(bào)道的編碼蛋白酶體基因。

關(guān)鍵詞：栽培煙草；蛋白酶體α2型亞單位；蛋白降解；克?。恍蛄蟹治?/p>

中圖分類號(hào)： S188；S572.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0039-03

馬鈴薯Y病毒屬的蚜傳輔助因子（HC-Pro）是釋放感染所需病毒蛋白的三大蛋白酶之一[1]，HC-Pro抑制植物體內(nèi)起抗病毒作用的RNA干涉，但其具體分子機(jī)制尚無報(bào)道[2-3]。近期研究發(fā)現(xiàn)，萵苣花葉病毒的HC-Pro能干涉泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)中核心元件20S蛋白酶體的活性，而泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)參與抗病毒反應(yīng)[4]。Ballut等研究發(fā)現(xiàn)，煙草花葉病毒、萵苣花葉病毒的RNA能夠被蛋白酶體識(shí)別水解，這暗示20S蛋白酶體的核酸內(nèi)切酶活性可能參與植物體內(nèi)的抗病毒過程[5]。

泛素/26S蛋白酶體在植物發(fā)育的方方面面起著重要作用，影響著一系列生理過程，包括胚胎發(fā)育和衰老[6]。泛素/26S蛋白酶體的核心元件是受到緊密調(diào)控并高度特異的26S蛋白酶體，由二級(jí)結(jié)構(gòu)為圓柱形的20S核心蛋白酶結(jié)合1個(gè)19S調(diào)控因子構(gòu)成[7]。筒形的20S蛋白酶體由4個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)構(gòu)成，包括在2個(gè)外側(cè)的環(huán)形結(jié)構(gòu)中的7個(gè)α亞基，而內(nèi)側(cè)的2個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)上具有7個(gè)β亞基，其大體的構(gòu)型為α1-α7/β1-β7//β1-β7/α1-α7/α1-α7[7]。盡管已經(jīng)從煙草、土豆、綠豆、豌豆等植物中純化得到20S蛋白酶體[8-10]，但是目前尚無關(guān)于栽培煙草中蛋白酶體α2型亞單位基因序列的報(bào)道。

隨著近年來多個(gè)物種全基因組測(cè)序的完成和表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ESTs）計(jì)劃的發(fā)展，電子克隆技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，其技術(shù)核心是利用生物信息學(xué)技術(shù)組裝延伸ESTs序列，獲得基因的部分乃至全長cDNA序列。本研究采用電子克隆的方法獲得1個(gè)蛋白酶體α2型亞單位基因NtPAB1，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究煙草中外源蛋白、異常蛋白的降解奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 煙草PAB1基因的電子克隆

以擬南芥的蛋白酶體α2型亞單位基因全長cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：AF043520.1）為信息探針[11]，對(duì)GenBank中EST_others數(shù)據(jù)庫指定物種煙草（Nicotiana tabacum）進(jìn)行Blast比對(duì)，并利用菲莫公司林煙草和絨毛狀煙草的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)[12]，將比對(duì)到的煙草栽培品種美國普通煙草的全部EST序列使用Codon Code Aligner軟件進(jìn)行拼接，形成重疊群（contig）。利用拼接獲得的重疊群作為探針，再次進(jìn)行同源檢索、拼接，重復(fù)以上過程直至沒有更多EST被檢出，獲得普通煙草的PAB1 cDNA序列。最后，再以此片段在NCBI數(shù)據(jù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)比其他物種同源基因的相似性和一致性，判斷拼接所得cDNA片段的正確性以及讀碼框（open reading frame，ORF）序列的完整性。

1.2 煙草PAB1基因的生物信息學(xué)分析

序列比對(duì)、ORF查找和翻譯在“http：//www.ebi.ac.uk/”提供的相應(yīng)模塊上完成。采用ExPASy網(wǎng)站上Prot-Param、pI/Mw對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行基本分析；利用在線資源的SignalP 4.1、TargetP1.1、NetPhos、SOPMA軟件進(jìn)行信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn)、蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用ClustalX2.0、MEGA4.0軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草栽培品種PAB1基因的電子克隆

以擬南芥的蛋白酶體α2型亞單位基因全長cDNA序列為檢索探針，對(duì)GenBank中煙草EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索分析，同時(shí)比對(duì)菲莫公司2013年發(fā)布的煙草基因組測(cè)序數(shù)據(jù)[12]，發(fā)現(xiàn)10條一致性（identity）、相似性（similarity）較高的EST序列。按照“1.1”節(jié)所述方法進(jìn)行重疊群分析，結(jié)果顯示，10條EST可拼接成1條獨(dú)立的cDNA序列，長度為660 bp，暫命名NtPAB1（Nicotiana tabacum PAB1）（圖1）。

2.2 NtPAB1蛋白基本參數(shù)和可能的翻譯后修飾

NtPAB1蛋白含有219個(gè)氨基酸，分子量為23.71 ku，等電點(diǎn)（pI值）為7.8。NCBI保守域檢測(cè)表明，NtPAB1蛋白含有1個(gè)保守域PROTEASOME_ALPHA_1，說明所克隆的NtPAB1基因是植物蛋白酶體基因家族成員（圖2）。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為34.31，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為88.08，總平均親水性為-0.193，具有輕度疏水性。

采用SignalP 4.1[13]預(yù)測(cè)NtPAB1蛋白無信號(hào)肽。利用TargetP1.1[14]在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對(duì)推導(dǎo)蛋白的定位特性分析顯示，NtPAB1沒有特殊定位偏好性。用NetPhos2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)表明，NtPAB1蛋白存在20個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其潛在絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Tyr）活性位點(diǎn)數(shù)分別為5、3、1個(gè)，NtPAB1蛋白存在較多的磷酸化位點(diǎn)，說明磷酸化位點(diǎn)修飾對(duì)PAB家族蛋白的活化起著重要作用。

2.3 NtPAB1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過SOPMA方法分析NtPAB1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖3所示，可見參與α-螺旋的氨基酸含量達(dá)到37.90% （83個(gè)）；63個(gè)氨基酸可能參與形成無規(guī)則卷曲，占28.77%；另外有49個(gè)氨基酸可能參與延伸鏈，占22.37%；24個(gè)氨基酸可能參與β-轉(zhuǎn)角，占10.96%。說明α-螺旋、無規(guī)則卷曲是NtPAB1蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)。

2.4 NtPAB1基因同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為分析NtPAB1與其他植物的蛋白酶體基因的同源性，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTp。結(jié)果表明，NtPAB1所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與葡萄同源基因氨基酸相似性最高，達(dá)到98%，而在林煙草和本式煙草中未能找到該基因的同源基因。另外NtPAB1與楊樹、百脈根、可可的相關(guān)基因的相似性達(dá)到85%以上。從GenBank上獲得的多個(gè)植物PAB同源基因編碼蛋白的氨基酸序列，經(jīng)過ClustalX 2.0比對(duì)后生成aln比對(duì)文件，然后利用進(jìn)化分析軟件MEGA4.0打開比對(duì)文件，采用鄰接（Neighbor-Joint，N-J）算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[15- 16]。分析結(jié)果表明，NtPAB1與葡萄PAB基因編碼蛋白進(jìn)化關(guān)系更近（圖4）。

3 結(jié)論與討論

馬鈴薯Y病毒屬（potato virus Y，PVY）是包含范圍廣、增殖過程復(fù)雜但基因組簡單的一類重要病毒，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[17]。特別是在煙草行業(yè)，煙草馬鈴薯Y病毒分布于世界各煙區(qū)。在中國，近年來馬鈴薯Y病毒也有逐年加重的趨勢(shì)，在馬鈴薯、煙草及蔬菜混種或間種的地區(qū)發(fā)病尤為嚴(yán)重，已經(jīng)成為導(dǎo)致煙草減產(chǎn)和品質(zhì)下降的主要病毒之一。國外研究調(diào)查顯示，煙草感染PVY后，其單位面積產(chǎn)值減少11%～18%，煙葉等級(jí)指數(shù)也降低36%～62%。

近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了許多PVY侵染循環(huán)中的作用因子，加深了對(duì)PVY侵染過程中各項(xiàng)機(jī)制的研究。HC-Pro對(duì)于PVY的傳播至關(guān)重要，但是其具體分子機(jī)制尚未研究清楚。Ballut等研究表明，萵苣花葉病毒的HC-Pro能夠結(jié)合20S蛋白酶體[4]。因此可知，20S蛋白酶體對(duì)于植物抵御病毒的危害具有重要作用。

本研究通過電子克隆方法從煙草栽培品種中克隆到1個(gè)20S蛋白酶體基因NtPAB1，為利用該基因培育抗PVY病毒栽培煙草品系奠定了理論基礎(chǔ)。下一步工作是通過改變煙草20S蛋白酶體的序列，使得PVY病毒的HC-Pro無法識(shí)別靶標(biāo)序列，從而達(dá)到抗PVY的目的。

參考文獻(xiàn)：

[1]Plisson C，Drucker M，Blanc S，et al. Structural characterization ofHC-Pro，a plant virus multifunctional protein[J]. The Journal ofBiological Chemistry，2003，278（26）：23753-23761.

[2]Anandalakshmi R，Pruss G J，Ge X，et al. A viral suppressor of gene silencing in plants[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，1998，95（22）：13079-13084.

[3]Brigneti G，Voinnet O，Li W X，et al. Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana[J]. The EMBO Journal，1998，17（22）：6739-6746.

[4]Ballut L，Drucker M，Pugnière M，et al. HcPro，a multifunctional protein encoded by a plant RNA virus，targets the 20S proteasome and affects its enzymic activities[J]. The Journal of General Virology，2005，86（9）：2595-2603.

[5]Ballut L，Petit F，Mouzeyar S，et al. Biochemical identification ofproteasome-associated endonuclease activity in sunflower[J].Biochimica et Biophysica acta，2003，1645（1）：30-39.

[6]Hellmann H，Estelle M. Plant development：Regulation by protein degradation[J]. Science，2002，297（5582）：793-797.

[7]Vierstra R D. Proteolysis in plants：mechanisms and functions[J]. Plant Molecular Biology，1996，32（1/2）：275-302.

[8]Schliephacke M，Kremp A，Schmid H P，et al. Prosomes （proteasomes） of higher plants[J]. European Journal of Cell Biology，1991，55（1）：114-121.[HJ1.73mm]

[9]Kremp A，Schliephacke M，Kull U，et al. Prosomes exist in plant cells too[J]. Experimental Cell Research，1986，166（2）：553-557.

[10]Skoda B，Malek L. Dry pea seed proteasome：purification and enzymic activities[J]. Plant Physiology，1992，99（4）：1515-1519.

[11]Fu H，Doelling J H，Arendt C S，et al. Molecular organization of the 20S proteasome gene family from Arabidopsis thaliana[J].Genetics，1998，149（2）：677-692.

[12]Sierro N，Battey J N，Ouadi S，et al. Reference genomes and transcriptomes of Nicotiana sylvestris and Nicotiana tomentosiformis[J]. Genome Biology，2013，14（6）：R60.

[13]Petersen T N，Brunak S，von Heijne G，et al. SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods，2011，8（10）：785-786.

[14]Emanuelsson O，Brunak S，von Heijne G，et al. Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP and related tools[J]. NatureProtocols，2007，2（4）：953-971.

[15]Saitou N，Nei M. The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology andEvolution，1987，4（4）：406-425.

[16]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al. MEGA4：molecular evolutionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J]. MolecularBiology and Evolution，2007，24（8）：1596-1599.

[17]李萌萌，陳士華，吳興泉. 馬鈴薯塊莖壞死環(huán)斑病研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：143-146.