李青燕+陳向東+董娜+李淦+茹振鋼

摘要：表達(dá)序列標(biāo)簽-微衛(wèi)星DNA（EST-SSR）、序列標(biāo)志位點(diǎn)（STS）是基于特異引物PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，具有共顯性遺傳、位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于指紋圖譜構(gòu)建、品種鑒定等方面。選用小麥低溫敏雄性不育系BNS和來(lái)自不同生態(tài)區(qū)的7個(gè)小麥品種（系），從192對(duì)引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富、覆蓋小麥所有染色體的21對(duì)引物，在8個(gè)小麥品種（系）中擴(kuò)增出72個(gè)等位位點(diǎn)，每個(gè)引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)2～7個(gè)，平均3.43個(gè)；基因多樣性指數(shù)變幅為0.218 8～0.843 8，平均值為0.544 3；每個(gè)引物的多態(tài)性信息含量（PIC值）的變化范圍在0.194 8～0.824 7之間，平均值0.495 7。由結(jié)果可以看出，引物SWES33、CFE11、CFE188、CFE138擴(kuò)增出來(lái)的帶型多，易于進(jìn)行品種的鑒定和區(qū)分，其中引物SWES33和CFE11結(jié)合起來(lái)，可以將這8個(gè)小麥品種區(qū)分開(kāi)，這為BNS型雜交小麥品種的鑒定工作提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥；BNS；分子標(biāo)記；指紋圖譜

中圖分類號(hào)： S512.103.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0032-03

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物之一。隨著社會(huì)的進(jìn)步、人們生活水平的提高，對(duì)小麥的要求變得更高，不僅要求小麥高產(chǎn)，而且對(duì)小麥的品質(zhì)也要求達(dá)到優(yōu)質(zhì)。為了滿足人們的需求，育種家開(kāi)始研究?jī)?yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的小麥品種，通過(guò)雜交等方法使優(yōu)良的小麥基因集中到一起而培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的小麥品種。但是，在新品種培育過(guò)程中，含有優(yōu)良基因的小麥親本的反復(fù)利用，使小麥的遺傳多樣性降低，新品種之間的相似性變高，對(duì)小麥新品種的鑒定帶來(lái)了很大的困難。對(duì)小麥品種鑒定和認(rèn)證的傳統(tǒng)方法是采用形態(tài)學(xué)標(biāo)記，但是該方法易受外界因素的影響，結(jié)果準(zhǔn)確性較差，隨后發(fā)展的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記也易受到各種因素的影響，直到分子標(biāo)記的出現(xiàn)并成為一種廣泛應(yīng)用的方法。分子標(biāo)記的方法有微衛(wèi)星DNA（simple sequence repeats，SSR）、序列標(biāo)志位點(diǎn)（sequence tagged site，STS）、表達(dá)序列標(biāo)簽（experssed sequence tags，EST）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、特定序列擴(kuò)增（sequence characterized amplified regions，SCAR）等。EST-SSR是從EST序列中開(kāi)發(fā)的一種新型SSR標(biāo)記。EST-SSR和STS是基于特異引物PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，具有共顯性遺傳、位點(diǎn)數(shù)量多、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。目前，很多作物如大麥[1-2]、小麥[3]、葡萄[4]等的SSR標(biāo)記已被用于遺傳作圖、遺傳多樣性、比較作圖、品種指紋圖譜等研究中。另外，還有一些學(xué)者利用分子標(biāo)記構(gòu)建農(nóng)作物的分子身份證，用于農(nóng)作物品種純度鑒定，例如聶新輝等利用40對(duì)引物完全區(qū)分開(kāi)新陸早51份常規(guī)品種，并可用于構(gòu)建供試品種的指紋圖譜[5]；陸徐忠等采用SSR標(biāo)記與商品信息相結(jié)合的方法構(gòu)建水稻品種身份證，有利于了解品種信息，方便品種的管理等[6]；顏靜宛等構(gòu)建了137個(gè)水稻品種材料24個(gè)標(biāo)記的分子身份證數(shù)據(jù)庫(kù)[7]；李偉忠等利用64對(duì)SSR引物對(duì)257份玉米自交系建立了分子身份證[8]；巫桂芬等利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related amplifedpolymorphism，SRAP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間擴(kuò)增（inter simple sequence nepeat，ISSR）、SSR標(biāo)記繪制了154份黃麻品種基因組DNA分子指紋圖譜[9]。但是構(gòu)建小麥分子身份證的研究很少，因此，本研究采用EST-SSR和STS分子標(biāo)記，對(duì)部分BNS型雜交小麥親本進(jìn)行遺傳多樣性分析，構(gòu)建小麥分子身份證，有利于小麥品種的收集和保存，同時(shí)也為育種家親本選配提供有力依據(jù)，加速育種進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用來(lái)自不同地區(qū)的8份小麥材料，其種子均由河南科技學(xué)院小麥中心提供。包括黃淮地區(qū)的BNS、周麥18，西南地區(qū)的川麥107，西北地區(qū)的新春6號(hào)，長(zhǎng)江流域的浙豐2號(hào)，東北地區(qū)的小冰麥33，國(guó)外的CL0433（智利）、FRA01（法國(guó)）。

1.2 DNA的提取

在小麥4～5葉期時(shí)取幼苗葉片，通過(guò)CTAB法提取其 DNA[10]。

1.3 SSR檢測(cè)

本試驗(yàn)所用引物SWES[11]、CFE[12]和Xmag（http：//avena.pw.usda.gov）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。對(duì)供試品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳（每次的點(diǎn)樣順序都是固定的，即品種順序固定），電泳結(jié)束后顯影。顯影的方法：（1）銀染：將其放入600 mL 蒸餾水+0.6 g硝酸銀溶液中浸泡15 min；（2）水洗：迅速放入蒸餾水中沖洗；（3）顯影：放入500 mL蒸餾水+8 g NaOH+0.3 g Na2CO3+4 mL甲醛溶液中，直至出現(xiàn)帶型即可。拍照并記錄位點(diǎn)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

帶型的記錄參考顏靜宛等的方法[7]，根據(jù)帶型（基因型）：記錄每1個(gè)引物在8個(gè)品種（系）中擴(kuò)增的帶型，相同帶型（相同的基因型） 代號(hào)相同，不同帶型（不同的基因型），依次記作 1，2，3，…，n。

利用PowerMarker V3.25 軟件計(jì)算不同引物的基因多樣性指數(shù)及多態(tài)信息含量（PIC值）。

1.5 小麥分子身份證的初步構(gòu)建

根據(jù)帶型記錄電泳結(jié)果，8個(gè)小麥品種以BNS作為對(duì)照品種，由對(duì)照品種擴(kuò)增出的帶型標(biāo)記為1，其他品種擴(kuò)增出的帶型，與對(duì)照品種相同的同樣標(biāo)記為1，不同的標(biāo)記為2，與帶型2不同的標(biāo)記為3，依此類推。得到8個(gè)小麥品種由21對(duì)引物擴(kuò)增出的基因帶型碼后，按照染色體1A、1B、1D、2A、2B、2D等順序依次排列，建立小麥的分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR和STS分子標(biāo)記的多態(tài)性分析

從192對(duì)引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富的21對(duì)引物。這些引物在8個(gè)小麥品種（系）中擴(kuò)增出72個(gè)等位位點(diǎn)，每個(gè)引物擴(kuò)增出的位點(diǎn)數(shù)2～7個(gè)，平均3.43個(gè)；基因多樣性指數(shù)變幅為0.218 8～0.843 8，平均值為0.544 3，每個(gè)引物的多態(tài)性信息含量（PIC值）的變化范圍在0.194 8～0.824 7 之間，平均值0.495 7（表1）。在這21對(duì)引物中，有6對(duì)引物檢測(cè)到2個(gè)等位變異位點(diǎn)，有6對(duì)引物檢測(cè)到3個(gè)等位變異位點(diǎn)，有5對(duì)引物檢測(cè)到4個(gè)等位變異位點(diǎn)，有3對(duì)引物檢測(cè)到5個(gè)等位變異位點(diǎn)，有1對(duì)引物檢測(cè)到7個(gè)等位變異位點(diǎn)。

2.2 基于EST-SSR和STS分子標(biāo)記構(gòu)建小麥品種的分子身份證

以BNS作為對(duì)照種，21對(duì)引物對(duì)BNS擴(kuò)增出來(lái)的帶型都標(biāo)記為1，獲得這些引物對(duì)其他品種擴(kuò)增的帶型碼。以引物SWES131（圖1）為例，第1條泳道BNS擴(kuò)增出的帶型標(biāo)記為1；第2條泳道周麥18擴(kuò)增出的帶型與BNS的帶型不同，標(biāo)記為2；第3、4、5、8條泳道分別是川麥107、新春6號(hào)、浙豐2號(hào)、小冰麥33擴(kuò)增出的帶型，與周麥18擴(kuò)增的帶型相同，同樣標(biāo)記為2；第6、7條泳道分別是CL0433、財(cái)富麥（FRA01）擴(kuò)增的帶型，與前2種帶型都不同，標(biāo)記為3。依此類推，得到引物SWES131在8個(gè)小麥品種（系）中擴(kuò)增的帶型碼是12222332，然后獲得21對(duì)引物在8個(gè)小麥品種（系）中擴(kuò)增的帶型碼標(biāo)記。同一品種在不同引物中擴(kuò)增的帶型碼標(biāo)記按照引物所在染色體1A、1B、1D、2A、2B、2D等順序依次排列，獲得1組由21個(gè)數(shù)字組成的分子身份證號(hào)，如川麥107的分子身份證號(hào)是：212222113331112121233，該分子身份證號(hào)的第1位數(shù)字2表示川麥107在引物SWES131上擴(kuò)增的帶型標(biāo)記為2，第2位數(shù)字1表示在引物CFE150上擴(kuò)增的帶型標(biāo)記為1（即與對(duì)照種的帶型碼相同），第3位數(shù)字2表示在引物CFE136上擴(kuò)增的帶型標(biāo)記為2，后面的依此類推，獲得8個(gè)小麥品種（系）的分子身份證號(hào)（表2）。

3 討論

分子ID（即分子身份證） 是把品種的特征數(shù)字化，即每個(gè)品種都有屬于自己的1套字符串形式的代碼，從而可以簡(jiǎn)單明了地區(qū)分品種。構(gòu)建小麥分子身份證，就需要選擇具有條帶清晰、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)的引物，并選擇合適的分子標(biāo)記方法。隨著分子標(biāo)記的不斷發(fā)展，農(nóng)作物在分子水平上的研究越來(lái)越深入[13-14]，但是由于小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，分子水平上的研究相對(duì)落后于水稻、玉米等農(nóng)作物，其完整的遺傳圖譜尚未完成。雖然小麥的分子標(biāo)記很多，但是它們?cè)谌旧w上的分布不均勻，要想構(gòu)建完整的遺傳圖譜需要不斷地開(kāi)發(fā)新的分子標(biāo)記，采用不同的分子標(biāo)記相結(jié)合的方法構(gòu)建。本研究利用覆蓋小麥整個(gè)基因組的19對(duì)EST-SSRs引物和2對(duì)STS引物，以小麥低溫敏雄性不育系BNS為對(duì)照種，構(gòu)建雜交小麥親本分子身份證。從結(jié)果中可以看出，引物SWES33、CFE11、CFE188、CFE138擴(kuò)增出來(lái)的帶型多，易于品種的鑒定和區(qū)分，其中引物SWES33和CFE11結(jié)合起來(lái)，可以將這8個(gè)小麥品種區(qū)分開(kāi)，這為BNS型雜交小麥品種的鑒定工作提供了依據(jù)，有利于區(qū)分不同的品種，辨別假冒種子，防止假冒種子流入市場(chǎng)，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。

本研究中，記錄帶型數(shù)據(jù)主要是依靠人工對(duì)比獲得，可能結(jié)果中存在一定的誤差。隨著科技的迅速發(fā)展，擴(kuò)增產(chǎn)物可以借助基因分析儀進(jìn)行直接讀取[15-16]，構(gòu)建更為精確的結(jié)果，但是該方法成本昂貴。另外，本研究只是針對(duì)8個(gè)代表性的雜交小麥親本品種進(jìn)行初步的探討，以后還須對(duì)更多的雜交小麥親本構(gòu)建分子身份證，并結(jié)合田間農(nóng)藝性狀、商品信息等，使小麥品種有完善的數(shù)據(jù)庫(kù)，為品種區(qū)分提供更為便利的方法，也將為雜交新品種的選育提供理論基礎(chǔ)，推進(jìn)雜交小麥育種的進(jìn)程。

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