高保燕 黃羅冬 張成武

（暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)學(xué)系水生生物研究中心，廣州 510632）

微藻藻種的篩選和育種及基因工程改造

高保燕 黃羅冬 張成武

（暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)學(xué)系水生生物研究中心，廣州 510632）

張成武，教授，博士生導(dǎo)師。目前主要從事微藻生物能源、微藻生物活性物質(zhì)、微藻主要代謝產(chǎn)物的合成與代謝調(diào)控機(jī)制、光生物反應(yīng)器系統(tǒng)設(shè)計(jì)以及微藻規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)的研究。

E-mail:tzhangcw@jnu.edu.cn

利用微藻油脂、烷烴或微藻淀粉生產(chǎn)生物柴油或生物酒精已成為國際生物能源研究領(lǐng)域的前沿和各個國家尤其是西方發(fā)達(dá)國家能源科技競爭的熱點(diǎn)。然而，微藻生物燃料面臨用于大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)的微藻品種較少、生產(chǎn)成本高而難于商業(yè)化應(yīng)用的問題。文章深入研究微藻生物技術(shù)的發(fā)展，對目前微藻藻種篩選、育種和基因工程技術(shù)改造進(jìn)行分析，為進(jìn)一步發(fā)掘篩選新的微藻生物資源、獲得富含生物燃料原料成分及多種生物活性成分的優(yōu)良藻種提供指導(dǎo)，加快微藻的生物產(chǎn)品和生物燃料商業(yè)化生產(chǎn)。

1 微藻生物技術(shù)及其發(fā)展

微觀藻類（微藻）需要借助顯微鏡才能觀察到其形態(tài)，是一類系統(tǒng)發(fā)生各異、個體較小、通常為單細(xì)胞或多細(xì)胞群體（絲狀體、膜狀體）的、能進(jìn)行光合作用的水生低等植物。與高等植物相比，微藻有許多獨(dú)特的優(yōu)勢，它們細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，通常能夠更有效地轉(zhuǎn)化太陽能，并且繁殖速度較快，單位面積產(chǎn)量是陸生高等植物的若干倍1 2。

人類食用微藻的歷史悠久，幾千年前中國人就使用一種普通念珠藻（Nostoc commune，又稱地皮菜或葛仙米）作為食物逃避饑荒。另外，一種在我國西北草原上生長的被稱之為“發(fā)菜”的生物也是一種藻類，它是發(fā)狀念珠藻（Nostoc flagelliforme）。古代乍得人和墨西哥人也以節(jié)旋藻（Arthrospira）[原名為螺旋藻（Spirulina）]作為食物的來源。其他藍(lán)藻，如束絲藻（Aphanizomenon）的食用歷史也超過幾千年3。

但人類培養(yǎng)微藻的歷史卻很短暫。19世紀(jì)50年代，隨著人口的急劇增加，食物和蛋白資源短缺，人們開始尋找新的可替代的非傳統(tǒng)蛋白資源。盡管藻類一直被用于食物來源，但規(guī)模卻非常有限。直到第二次世界大戰(zhàn)時，德國才真正考慮大規(guī)模培養(yǎng)微藻制備生物質(zhì)用于食用產(chǎn)品的生產(chǎn)。20世紀(jì)60年代初，日本開始大規(guī)模商業(yè)化培養(yǎng)小球藻（Chlorella）。1973年，Sosa Texcoco公司在墨西哥Texcoco湖建立了節(jié)旋藻收獲和培養(yǎng)設(shè)備，開設(shè)了世界上第一個節(jié)旋藻工廠。1986年，澳大利亞Western Biotechnology和Betatene（現(xiàn)為Cognis Nutrition and Health）公司建立規(guī)?；纳a(chǎn)設(shè)備培養(yǎng)鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）來生產(chǎn)β-胡蘿卜素。之后，美國、以色列（由日本建立的公司）和印度等國家也相繼建立了工廠來培養(yǎng)微藻生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品。目前，在亞太地區(qū)，大約有110家微藻生產(chǎn)企業(yè)，每年生產(chǎn)數(shù)千噸的干藻粉。據(jù)估算2016年全球微藻市場規(guī)模為2萬噸干物質(zhì)，總銷售額大約為50億美元。

微藻在醫(yī)療方面的應(yīng)用已經(jīng)有很長的歷史，但從微藻中開發(fā)生物活性成分，特別是抗氧化活性物質(zhì)，始于20世紀(jì)50年代。但直到20世紀(jì)80年代，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室研究仍局限于大型海藻。目前，已有超過15 000種天然海洋產(chǎn)物被篩選用于生物活性研究，但僅45種被應(yīng)用于臨床前和臨床試驗(yàn)的藥物研究，其中只有2種成為注冊藥品，分別來自海蝸牛和海鞘，還沒有一種來自微藻。當(dāng)然，現(xiàn)在有許多研究表明，從微藻中提取的活性成分具有抗腫瘤、抗炎及抵抗艾滋病病毒感染等功能。同時，一種來自藍(lán)藻——大鞘絲藻（Lyngbya majuscula）的抗腫瘤藥物正在進(jìn)行臨床前試驗(yàn)4。

目前，已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)的藻株大多具有生長速度快或耐受極端環(huán)境的特點(diǎn)，如小球藻在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長良好，能快速積累生物量，而節(jié)旋藻生長需要高pH和碳酸氫鈉濃度，鹽生杜氏藻能夠在高鹽條件下生長和積累β-胡蘿卜素，因此它們可以在開放體系中培養(yǎng)而不易被其他藻類及原生動物污染。而一些不具備環(huán)境選擇性的優(yōu)勢藻株，如多數(shù)的海水微藻——中肋骨條藻（Skeletonema costatum）、牟氏角毛藻（Chaetoceros muelleri）、威氏海鏈藻（Thalassiosira weissfl ogii）、亞心形四爿藻（Tetraselmis subcordiformis）和球等鞭金藻（Isochrysis galbana）等，則需要在封閉的系統(tǒng)中培養(yǎng)3。

微藻種類繁多，具有豐富的代謝多樣性，不同類型的微藻細(xì)胞中分別含有或結(jié)合存在各種生物活性成分，目前已知的色素類，如蝦青素（astaxanthin）、葉黃素（lutein）、β-胡蘿卜素（β-carotene）、巖藻黃素（f u c o x a n t h i n）、葉綠素（c h l o r o p h y l l）、藻膽蛋白（phycobiliprotein）、馬雷訥素（marennine）；多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸（DHA）、二十碳五烯酸（EPA）、花生四烯酸（AA）和γ-亞麻酸（GLA）；多糖，如硫酸酯多糖、β-1，3-葡聚糖。微藻的這些生物活性分子具有明顯的生理功能，利用微藻生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，應(yīng)用于營養(yǎng)品、食品、化妝品、醫(yī)藥及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域具有巨大的潛力2 3。

CHISTI Y.Biodiesel form microalgae.Biotechnology Advances, 2007, 25(3): 294-306.

2 參考文獻(xiàn)

SPOLAORE P, JOANNIS-CASSAN C, DURAN E, et al.Commercial applications of microalgae.Journal of Bioscience and Bioengineering, 2006, 101(2): 87-96.

3 參考文獻(xiàn)

MILLEDGE J J.Commercial application of microalgae other than as biofuels: a brief review.Reviews in Environmental Science and Bio technology, 2011, 10(1): 31-41.

4 參考文獻(xiàn)

JENSEN G S, GINSBERG D I, DRAPEAU M S.Blue green algae as an immuno-enhancer and biomodulator.Journal of American Nutraceutical Associate, 2001, 3: 24-30.

5 參考文獻(xiàn)

SCHENK P M, THOMAS-HALL S R, STEPHENS E, et al.Second generation biofuels: high-efficiencymicroalgae for biodiesel production.Bioenergy Research, 2008, 1(1): 20-43.

6 參考文獻(xiàn)

M U T A N D A T, R A M E S H D, KARTHIKEYAN S, et al.Bioprospecting for hyperlipid producing microalgal strains for sustainable biofuel production.Bioresource Technology, 2011, 102(1): 57-70.

7 參考文獻(xiàn)

GEORGIANNA D R, MAYFIELD S P.Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels.Nature, 2012, 488(7411): 329-335.

近年來，微藻生物技術(shù)成為一個廣受關(guān)注的研究領(lǐng)域，關(guān)于微藻的研究論文逐年增加。其中，利用微藻制備生物燃料是熱點(diǎn)之一。利用微藻油脂、烷烴或微藻淀粉生產(chǎn)生物柴油或生物酒精已成為國際生物能源研究領(lǐng)域的前沿和各個國家尤其是西方發(fā)達(dá)國家能源科技競爭的焦點(diǎn)。但以現(xiàn)在的生產(chǎn)成本，相對其他生物燃料，微藻生物燃料還缺乏競爭力，生產(chǎn)成本仍需大幅減少。目前，超過50家的藻類能源公司中，沒有任何一家能夠以具有競爭力的價格生產(chǎn)商業(yè)規(guī)模的微藻生物燃料。歐洲藻類生物質(zhì)協(xié)會（European Algae Biomass Association）預(yù)計(jì)，藻類生物燃料從實(shí)驗(yàn)室走向工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)還需要10～15年的時間。因此，如果要使微藻生物燃料的價格更具競爭力，還需要克服一些技術(shù)上的難題5。

2 微藻藻種的篩選、育種和工程改造

2.1 自然藻株的篩選

不同的自然環(huán)境中生長著不同類型的微藻，由于長期自然的選擇作用微藻也適應(yīng)著不同的生境：水體（淡水、海水、半咸水），陸生和氣生（潮濕土壤、干旱和半干旱沙漠、巖石表面、樹皮表面），共生（植物體內(nèi)、真菌和動物體表或體內(nèi)），以及某些極端的環(huán)境（高溫溫泉、低溫冷泉、高山雪地、極地、酸性環(huán)境、堿性環(huán)境、高鹽環(huán)境和高壓環(huán)境）。不同生境中生長的微藻具有其獨(dú)特的分類學(xué)、生物學(xué)、生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)的特性，亦具有廣泛的生物多樣性，在進(jìn)化過程中它們產(chǎn)生了與陸生生物不同的代謝系統(tǒng)和機(jī)體防御系統(tǒng)?？梢云诖龔倪@些藻類細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)不同于陸生生物來源的特異、新穎、多種多樣化學(xué)結(jié)構(gòu)的新化學(xué)物質(zhì)或生化成分，為人類的食品、營養(yǎng)品、化妝品、藥品和能源物質(zhì)提供了豐富的資源。它們是一個潛在的尚未開發(fā)的生物產(chǎn)品和生物燃料生產(chǎn)的生物資源庫。

利用微藻時，通常采用的方法包括：樣品采集、分離、純化、分類鑒定、生長和生理特性評價及純藻種維護(hù)和保藏（圖1）。分離和純化的方法主要有傳統(tǒng)的技術(shù)（加富培養(yǎng)、利用毛細(xì)管挑取單個細(xì)胞、固體瓊脂平板劃線分離、稀釋法、重力分離法、趨光法）和先進(jìn)的技術(shù)（流式細(xì)胞儀分選、微孔板和微流控技術(shù)），無菌藻株的獲得還需采用抗生素處理法進(jìn)行多次反復(fù)的固體瓊脂平板劃線分離。獲得純化株系后，采用經(jīng)典的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生化組分分析并結(jié)合分子生物學(xué)手段，包括18s rRNA、ITS、rbcL基因序列分析，對藻株進(jìn)行分類鑒定，確證其分類地位6～11。

8 參考文獻(xiàn)

LARKUM A W, ROSS I L, KRUSE O, et al.Selection, breeding and engineering of microalgae for bioenergy and biofuel production.Trends in Biotechnology, 2012, 30(4): 198-205.

9 參考文獻(xiàn)

DAY J G, SLOCOMBE S P, STANLEY M S.Overcoming biological constraints to enable the exploitation of microalgae.Bioresource Technology, 2012, 109: 245-251.

10 參考文獻(xiàn)

PEREIRA H, BARREIRA L, MOZES A, et al.Microplate-based high throughput screening procedure for the isolation of lipid-rich marine microalgae.Biotechnology for Biofuels, 2011, 4(1):61.

11 參考文獻(xiàn)

HYKA P, LICKOVA S, P?IBYL P, et al.Flow cytometry for the development of biotechnological processes with microalgae.Biotechnology Advances, 2013, 31(1): 2-16.

12 參考文獻(xiàn)

SERIVE B, KAAS R, BéRARD J B, et al.Selection and optimization of a method for efficient metabolites extraction.Bioresource Technology, 2012, 124: 311-320.

13 參考文獻(xiàn)

HLAVOVA M, TUROCZY Z, BISOVA K.Improving microalgae for biotechnology-from genetics to synthetic biology.Biotechnology Advances, 2015, 33: 1194-1203.

14 參考文獻(xiàn)

HARTUNG F, SCHIEMANN J.Precise plant breeding using new genome editing techniques: opportunities, safety and regulation in the EU.The Plant Journal, 2014, 78(5): 742-752.

為了進(jìn)一步了解分離、純化所獲得的微藻藻株的潛在價值，還需要對其進(jìn)行生長和培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及細(xì)胞代謝成分的分析。通過測定培養(yǎng)物生物質(zhì)濃度變化進(jìn)而推算其比生長速率，采用正交法、響應(yīng)面法和主成分分析法優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，獲得藻株的最適生長條件。細(xì)胞代謝成分分析采用微量樣品提取高通量篩選法，利用高效液相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用儀和液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行代謝成分的定性與定量測定。候選藻株還需在開放或封閉光生物反應(yīng)器系統(tǒng)中進(jìn)行規(guī)模放大培養(yǎng)評價，從而提出規(guī)模化放大培養(yǎng)時所要采取的一些措施和培養(yǎng)方案12。

圖1 自然界中分離、純化具有潛在價值的微藻藻株的一般步驟和流程

2.2 微藻育種技術(shù)

相對于高等植物，微藻具有許多優(yōu)點(diǎn)有利于進(jìn)行育種以改善其表現(xiàn)型。首先，不同于高等植物的生活史需要有季節(jié)性循環(huán)，微藻的生活史只有數(shù)小時或數(shù)天；其次，不同于高等植物的育種需要經(jīng)歷幼苗階段，微藻大多為單細(xì)胞生物，節(jié)約了育種成本；第三，相對原核生物來說，真核微藻可以進(jìn)行有性和無性繁殖，加速了遺傳多樣性的產(chǎn)生；第四，相比較高等植物而言，紫外和化學(xué)誘變能夠比較容易地應(yīng)用于微藻，特殊選擇壓力的應(yīng)用能夠較大幅度地提高藻株育種的效率。除了萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）已建立起可相互交配的實(shí)驗(yàn)室分離株外，針對微藻育種的研究還相當(dāng)少，主要的原因在于缺乏可相互交配的分離株。可通過野生型分離株間的交配來尋找表型的異質(zhì)性達(dá)到改善微藻性狀的目的。由于微藻的有性生殖周期較短生長快速，這樣就能夠從巨大的表型庫中快速挑選，這些完全不同于高等植物的育種要經(jīng)過多年的育種周期78。

2.3 微藻誘變育種和基因轉(zhuǎn)化

所有生命體的遺傳物質(zhì)都是從親一代遺傳給子一代的，最簡單的遺傳單元——基因被從親代傳遞給下一代。自19世紀(jì)中期以來，這個最基本的法則被育種專家用于在子代中雜交獲得所需的性狀。自然發(fā)生的突變株是由于環(huán)境（紫外輻射、代謝所產(chǎn)生的活性氧自基）與遺傳物質(zhì)間的相互作用而產(chǎn)生的，這樣的過程發(fā)生需要慢長的時間，通過特定的化學(xué)或物理方法可以加大突變的頻率，從而獲得所需要的性狀突變株。通常采用的化學(xué)誘變劑有亞硝基胍、亞硝基甲基脲、1-亞硝基-3-硝基胍、5-氟脫氧尿嘧啶和N-甲基-N-亞硝基脲；物理誘變方法有紫外線輻射、60Coγ射線、離子灌注、太空場突變以及新的誘變系統(tǒng)——大氣室溫等離子體技術(shù)。采用化學(xué)或物理方法進(jìn)行誘變時可能會獲得不同類型的表型，如細(xì)胞體積增大、生長改善、適應(yīng)不同化學(xué)物的抗性或增加特定代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，所有這些表型獲得都需要采用特定、不同的篩選規(guī)程。另外，隨機(jī)插入法也是獲取突變株的有效方法，插入法是基于外源DNA片段插入到基因組內(nèi)。相對于化學(xué)和物理誘變法，隨機(jī)插入法有其相應(yīng)的特點(diǎn)。首先，為了在一定生物中進(jìn)行插入法誘變，必須建立DNA轉(zhuǎn)化的方法，轉(zhuǎn)化過程中要有可轉(zhuǎn)化的DNA片段或包含可篩選的標(biāo)記物；其次，大片段的DNA插入會對插入位點(diǎn)/基因造成不利的影響；由于插入DNA片段帶有特定的標(biāo)記，突變位點(diǎn)鑒定是較容易的7～9 13。上述描述的誘變方法屬于正向遺傳學(xué)法（圖2a）。

圖2 正向和反向遺傳學(xué)方法改善微藻特性

傳統(tǒng)的誘變育種過程是在突變株產(chǎn)生后挑選那些所要尋找的表型，造成突變的基因是在突變株獲得后才能鑒定出來。通常情況下，這樣的誘變育種方式其誘變的遺傳背景是不需要了解的。隨著許多藻株基因組序列的測序，如萊茵衣藻、三角褐指藻（P haeodactylum tricornutum）和多變 小球藻（C hlorella variabilis NC64A）等物種基因組的解析13，不同藻類的全基因組或細(xì)胞器（葉綠體）基因組測序的完成，擴(kuò)大了不同藻類的基因鑒定與特殊功能基因家族的分析。藻類中已知序列和功能的基因可以直接從不同的數(shù)據(jù)庫中獲得，通過內(nèi)源基因的異常表達(dá)或過表達(dá)可以增強(qiáng)微藻的特定性狀。另外，隨著越來越多的微藻基因組信息的公布，微藻分子遺傳轉(zhuǎn)化體系不斷完善，萊茵衣藻和小球藻等相繼建立起了完善的高效表達(dá)體系。通過遺傳操作的方式，其他生物中已知的基因經(jīng)異源表達(dá)也能夠轉(zhuǎn)移到所要求的微藻細(xì)胞中，從而獲得所需求的性狀，這些涉及特定代謝途徑的成套基因表達(dá)是代謝工程的潛在方法。除了加入基因外，基因組中的基因表達(dá)還可通過一些特定方式進(jìn)行基因敲落（gene knockdown）或基因敲除（gene knockout）或基因開關(guān)來改變；在微藻系統(tǒng)中，亦可通過RNAi進(jìn)行基因沉默以降低基因的表達(dá)水平。目前，高效的同源重組方式也在微藻細(xì)胞中獲得成功。此外，由于基因定向編輯平臺CRISPR/ Cas9體系的建立，理論上能夠定向激活和失活任何基因，在微藻基因工程定向改造方面具有巨大的應(yīng)用前景13 14。因此，微藻遺傳性狀的改善正逐步轉(zhuǎn)向反向遺傳學(xué)方面的研究（圖2b）。

目前，商業(yè)化培養(yǎng)的微藻都來自于自然型野生藻株經(jīng)過馴化后被應(yīng)用的。藻類在生命系統(tǒng)樹中廣泛分布，包括多個真核生物組群，藻類的多樣性在研究不同生命過程，包括代謝途徑、信號傳導(dǎo)、發(fā)育調(diào)控與分化機(jī)制等方面具有巨大的研究價值。自然界中一些新的還未被發(fā)掘的藻株仍然具有較大的商業(yè)應(yīng)用潛力，先進(jìn)的誘變技術(shù)和基因?qū)W、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)的不斷發(fā)展以及新的基因工程手段的不斷涌現(xiàn)，將為微藻生物技術(shù)的發(fā)展帶來巨大的機(jī)遇。

10.3969/j.issn.1674-0319.2016.04.004