楊立榮（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，杭州 310027）

生物催化技術(shù)研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢

楊立榮（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，杭州 310027）

楊立榮，教授，研究方向?yàn)樯锕こ獭?/p>

E-mail:lryang@zju.edu.cn

生物催化技術(shù)是當(dāng)今國際科技發(fā)展的熱點(diǎn)，將繼信息技術(shù)后引領(lǐng)新一輪的全球科技革命。文章介紹了近年來國內(nèi)外生物催化技術(shù)的最新研究進(jìn)展和發(fā)展趨勢，包括生物催化劑的發(fā)現(xiàn)與改造、生物催化機(jī)理、生物合成反應(yīng)的設(shè)計(jì)與調(diào)控、生物催化系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建，以及生物催化技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用實(shí)例等。

BEHRENS G A, HUMMEL A, PADHI S K, et al.Discovery and protein engineering of biocatalysts for organic synthesis.Advanced Synthesis & Catalysis, 2011, 353(13): 2191-2215.

2 參考文獻(xiàn)

COELHO P S, BRUSTAD E M, KANNAN A, et al.Olefin cyclopropanation via carbene transfer catalyzed by engineered cytochrome P450 enzymes.Science, 2013, 339(6117): 307-310.

3 參考文獻(xiàn)

MCINTOSH J A, COELHO P S, FARWELL C C, et al.Enantioselective intramolecular CH amination catalyzed by engineered cytochrome P450 enzymes in vitro and in vivo.Angewandte Chemie, 2013, 125(35): 9479-9482.

4 參考文獻(xiàn)

WANG Z J, PECK N E, RENATA H, et al.Cytochrome P450-catalyzed insertion of carbenoids into N–H bonds.Chemical Science, 2014, 5(2): 598-601.

現(xiàn)代生物技術(shù)正在進(jìn)入大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化階段，全球生物經(jīng)濟(jì)快速成長，生物經(jīng)濟(jì)的發(fā)展建立在以工業(yè)生物催化為核心的生物制造產(chǎn)業(yè)基礎(chǔ)之上。生物催化技術(shù)具有過程高效（物耗低、原子經(jīng)濟(jì)性高）、反應(yīng)溫和（能耗低）、環(huán)境友好（污染?。┑忍攸c(diǎn)，是綠色化學(xué)與綠色化工發(fā)展的重要趨勢之一。然而，要將自然界普遍存在的生物催化過程轉(zhuǎn)化為高效的工業(yè)化生產(chǎn)過程，不僅取決于技術(shù)上能否發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)分子（多數(shù)為人工合成的非天然化合物）有效結(jié)合并發(fā)生催化作用的酶或者完整細(xì)胞，而且取決于經(jīng)濟(jì)上生物催化過程相對于其他工藝路線（如化學(xué)合成）的競爭優(yōu)勢。

1 生物催化技術(shù)發(fā)展迅猛

1.1 新一代DNA測序、生物信息學(xué)、定向進(jìn)化和高通量篩選等技術(shù)的進(jìn)步大幅提高了生物催化劑的發(fā)現(xiàn)與改造效率

隨著新一代測序技術(shù)的不斷發(fā)展，公共基因數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的基因序列和蛋白質(zhì)序列呈爆炸式增長，以及生物信息學(xué)、蛋白重組表達(dá)、高通量篩選、酶的定向進(jìn)化和表達(dá)平臺的建立，為高效快速開發(fā)適合目標(biāo)反應(yīng)的新酶提供了便利，并在酶催化劑的活力、選擇性、穩(wěn)定性等方面的改造獲得了巨大進(jìn)展。宏基因組文庫和基因組探礦技術(shù)的出現(xiàn)，大大促進(jìn)了從自然界的微生物中發(fā)掘新酶的進(jìn)程，人們可以獲得更多的能夠直接用于或者經(jīng)過簡單改造即可用于工業(yè)化生產(chǎn)的新酶品種。而定向進(jìn)化、半理性設(shè)計(jì)、理性設(shè)計(jì)、計(jì)算機(jī)輔助的分子改造技術(shù)的日趨成熟，使得人們已經(jīng)可以對生物催化劑的特性進(jìn)行更大程度的改造，甚至獲得催化非天然催化反應(yīng)的活力，極大地拓廣其潛在的應(yīng)用1。Frances Arnold等2通過改造細(xì)胞色素P450BM3酶輔酶結(jié)合位點(diǎn)使其獲得了非天然的催化活力，最突出的是可催 化烯烴的環(huán)丙烷化。而將細(xì)胞色素P450保守位點(diǎn)的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，則可使其進(jìn)一步獲得其他的催化活力，如C—H胺化和N—H插入3 4。隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，生物計(jì)算工具變得更加準(zhǔn)確與易用，如今，人們甚至可以利用這些工具去創(chuàng)造一個(gè)完全全新的酶，進(jìn)一步拓寬了蛋白質(zhì)催化的反應(yīng)范圍，從而對酶的生物化學(xué)性質(zhì)有全面和深入的認(rèn)識。Hilvert等5通過從頭計(jì)算設(shè)計(jì)技術(shù)（de novo computational design）以HG3（基于木聚糖酶）作為起始支架成功構(gòu)建了一個(gè)高效Kemp消除酶（Kemp eliminase），其kcat/KM值達(dá)1300M-1·s-1。

1.2 蛋白結(jié)構(gòu)分析、計(jì)算機(jī)建模、分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)的新發(fā)展為解析生物催化劑的催化機(jī)理奠定了基礎(chǔ)

通過X射線衍射晶體學(xué)、核磁共振和冷凍電鏡等技術(shù)手段能夠解析酶蛋白分子及其結(jié)合底物分子復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)酶蛋白分子的關(guān)鍵功能域，探究生物催化機(jī)理。Colton等6利用X射線測定了Candida rugosa脂肪酶（CRL）與過渡態(tài)類似物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合計(jì)算機(jī)建模，成功揭示了CRL與手性酸的分子識別機(jī)制。根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已有蛋白高級結(jié)構(gòu)模型，通過可視化分子模型擬合分析和蛋白質(zhì)工程分子改造手段，能夠有效研究酶蛋白結(jié)構(gòu)中與生理生化性質(zhì)和催化功能密切相關(guān)的功能域中關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)及其空間構(gòu)象與底物分子的識別和相互作用關(guān)系，以及進(jìn)行催化功能底物譜預(yù)測并用于高通量靶向篩選。Dubey等7通過分子動(dòng)力學(xué)模擬（MD）和QM/MM計(jì)算對細(xì)胞色素P450BM3與脂肪酸羥化酶底物結(jié)合機(jī)制，及其表現(xiàn)出區(qū)域、立體選擇性的分子機(jī)理進(jìn)行了預(yù)測，該預(yù)測結(jié)果對細(xì)胞色素P450BM3的改造具有非常重要的參考意義。

1.3 合成生物學(xué)、基因組編輯技術(shù)、計(jì)算生物學(xué)和生物反應(yīng)熱/動(dòng)力學(xué)的新成果為實(shí)現(xiàn)生物合成反應(yīng)的設(shè)計(jì)與調(diào)控提供可能

5 參考文獻(xiàn)

BLOMBERG R, KRIES H, PINKAS D M, et al.Precision is essential for efficient catalysis in an evolved Kemp eliminase.Nature, 2013, 503(7476): 418-421.

6 參考文獻(xiàn)

COLTON I J, YIN D T, GROCHULSKI P, et al.Molecular basis of chiral acid recognition by Candida rugosa lipase: X‐ray structure of transition state analog and modeling of the hydrolysis of methyl 2-methoxy-2-phenylacetate.Advanced Synthesis & Catalysis, 2011, 353(13): 2529-2544.

7 參考文獻(xiàn)

DUBEY K D, WANG B, SHAIK S.Molecular dynamics and QM/MM calculations predict the substrate-induced gating of cytochrome P450 BM3 and the regio and stereo-selctivity of fatty acid hydroxylation.Journal of the American Chemical Society, 2016,138(3): 837-845.

8 參考文獻(xiàn)

PADDON C J, KEASLING J D.Semi-synthetic artemisinin: a model for the use of synthetic biology in pharmaceutical development.Nature Reviews Microbiology, 2014, 12(5): 355-367.

9 參考文獻(xiàn)

JINEK M, CHYLINSKI K, FONFARA I, et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science, 2012, 337(6096): 816-821.

10 參考文獻(xiàn)

PETERS J M, SILVIS M R, ZHAO D, et al.Bacterial CRISPR: accomplishments and prospects.Current Opinion in Microbiology, 2015, 27:121-126.

11 參考文獻(xiàn)

RAN F A, HSU P D, WRIGHT J, et al.Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.Nature Protocols, 2013, 8(11): 2281-2308.

利用合成生物學(xué)原理在易于進(jìn)行基因操作的宿主微生物中異源表達(dá)整個(gè)或部分生物合成途徑已經(jīng)成為越來越普遍的方法，這一技術(shù)能夠有效應(yīng)用于生物合成反應(yīng)體系設(shè)計(jì)及構(gòu)建，并且所開發(fā)的生物催化劑可用作催化類似反應(yīng)的元件。Keasling關(guān)于合成抗瘧疾藥物青蒿素的研究成果是合成生物學(xué)的經(jīng)典之作。經(jīng)過不懈的努力，成功實(shí)現(xiàn)了來自細(xì)菌、酵母與青蒿（高等真核生物）多種基因及生物合成途徑的設(shè)計(jì)組裝與精密調(diào)控，使得大腸桿菌及酵母細(xì)胞合成青蒿素前體——青蒿酸的能力有幾個(gè)數(shù)量級的提高8。CRISPR/ Cas9技術(shù)是一項(xiàng)新興的基因組編輯工具，該系統(tǒng)具有操作簡單、功能多樣、便捷高效等優(yōu)點(diǎn)9 10。在該系統(tǒng)中Cas9蛋白具有核苷酸內(nèi)切酶的活性，通過gRNA的引導(dǎo)作用，能夠特異性地結(jié)合到目標(biāo)靶點(diǎn)PAM位點(diǎn)的上游互補(bǔ)序列上，并且在PAM位點(diǎn)上游堿基處產(chǎn)生雙鏈缺口，根據(jù)存在的模板DNA鏈的設(shè)計(jì)不同，可以在基因組的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行精確的基因插入或刪除，可以用于對宿主的基因組水平改造11。生物催化技術(shù)的特點(diǎn)決定了其高度依賴酶蛋白的表達(dá)，CRISPR/Cas9技術(shù)在功能上的多樣性，能夠在整個(gè)細(xì)胞宏觀的水平增強(qiáng)酶蛋白的異源表達(dá)，在未來必將會(huì)在生物催化領(lǐng)域開發(fā)出更多的應(yīng)用。

近年來，通過模擬方法已能夠了解催化過程的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，探明某一具體殘基對酶反應(yīng)的影響機(jī)制，建立外在因素對酶反應(yīng)的關(guān)聯(lián)模型 。如可通過量子力學(xué)/連續(xù)介質(zhì)力學(xué)計(jì)算典型催化三聯(lián)體Ser-His-Asp與乙醇或乙腈分子的相互作用，揭示質(zhì)子溶劑和疏質(zhì)子溶劑對過渡態(tài)穩(wěn)定性的不同影響，從而為催化介質(zhì)的選擇提供理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，人們開始應(yīng)用熱力學(xué)/動(dòng)力學(xué)計(jì)算和計(jì)算生物學(xué)等手段提高酶促反應(yīng)的效率，出現(xiàn)了一些成功的案例。Gundersen等12報(bào)道了幾個(gè)轉(zhuǎn)氨酶反應(yīng)的表觀平衡常數(shù)，他們發(fā)現(xiàn)鄰位取代的苯乙酮類分子對熱動(dòng)力平衡有很大的影響，并且脂肪六元環(huán)更適合作為氨基供體，這些發(fā)現(xiàn)對生物催化的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)具有非常重要的意義，如可以指導(dǎo)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)的氨基供體和受體的選擇。Pesci等13研究了利用2，6-二羥基苯甲酸脫羧酶（2，6-DHBA decarboxylase）催化鄰苯二酚可逆的羧化生成2,3-二羥基苯甲酸（2，3-DHBA）的動(dòng)力學(xué)與熱力學(xué)參數(shù)，并提出了一個(gè)基于可逆隨機(jī)bi–uni機(jī)制的模型。該研究深入分析了非氧化芳香族脫羧酶的催化行為并揭示了該酶應(yīng)用的主要限制性因素。這些成功的案例引起了科學(xué)家們的高度關(guān)注，也引發(fā)了酶促反應(yīng)理性調(diào)控研究的熱潮。

12 參考文獻(xiàn)

GUNDERSEN M T, ABU R, SCHüRMANN M, et al.Amine donor and acceptor influence on the thermodynamics of ω-transaminase reactions.Tetrahedron: Asymmetry, 2015, 26(10): 567-570.

13 參考文獻(xiàn)

PESCI L, GLUECK S M, GURIKOV P, et al.Biocatalytic carboxylation of phenol derivatives: kinetics and thermodynamics of the biological Kolbe-Schmitt synthesis.FEBS Journal, 2015, 282(7): 1334-1345.

14 參考文獻(xiàn)

SEHL T, HAILES H C, WARD J M, et al.Two steps in one pot: enzyme cascade for the synthesis of nor(pseudo)ephedrine from inexpensive starting materials.Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52(26): 6772-6775.

15 參考文獻(xiàn)

MARTIN DEL CAMPO J S, ROLLIN J, MYUNG S, et al.High-yield production of dihydrogen from xylose by using a synthetic enzyme cascade in a cell-free system.Angew Chem-Int Edit, 2013, 52(17): 4587-4590.

16 參考文獻(xiàn)

WANG S, FU C, ZHANG Y, et al.One-pot cascade synthetic strategy: a smart combination of chemoenzymatic transesterification and raft polymerization.ACS Macro Letters, 2012, 1(10): 1224-1227.

17 參考文獻(xiàn)

LI T, LIANG J, AMBROGELLY A, et al.Efficient, chemoenzymatic process for manufacture of the boceprevir bicyclic [3.1.0] proline intermediate based on amine oxidase-catalyzed desymmetrization.Journal of the American Chemical Society, 2012, 134(14): 6467-6472.

18 參考文獻(xiàn)

KONG X D, YUAN S G, LI L, et al.Engineering of an epoxide hydrolase for efficient bioresolution of bulky pharmaco substrates.PNAS, 2014, 111(44):15717-15722.

1.4 多酶耦合、化學(xué)-酶法協(xié)同催化以及過程工程集成、優(yōu)化與調(diào)控的新技術(shù)為設(shè)計(jì)和構(gòu)建生物催化系統(tǒng)提供借鑒

由于生物催化劑所具有的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，其在有機(jī)合成中的應(yīng)用越來越廣泛。生物催化劑所具有的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們的反應(yīng)條件（溫度、壓力、pH、溶劑）非常的類似，正是由于生物催化劑之間良好的兼容性，使得人們可以建立雙酶甚至多酶耦聯(lián)催化系統(tǒng)。Sehl等14構(gòu)建了一個(gè)含有裂合酶和（R）或（S）選擇性的ω-轉(zhuǎn)氨酶的雙酶級聯(lián)催化系統(tǒng)，用于（1R，2R）-去甲偽麻黃堿和（1R，2S）-去甲偽麻黃堿的合成，中間產(chǎn)物無需進(jìn)行分離且所得的產(chǎn)物具有較高的對映體和非對映體純度，同時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物——丙酮酸可作為第一步反應(yīng)的底物而進(jìn)行循環(huán)。通過一個(gè)包含多磷酸木酮糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、氫酶等13個(gè)酶的級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，Martin等15成功利用木糖和水實(shí)現(xiàn)H2的低成本生產(chǎn)，理論產(chǎn)率達(dá)到100%。在具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的手性化學(xué)品合成中，通過生物合成與化學(xué)合成的有機(jī)結(jié)合，充分發(fā)揮兩者各自的優(yōu)勢，由此形成了化學(xué)-酶法技術(shù)，體現(xiàn)出了極大的優(yōu)越性。Wang等16通過集成酶催化的脂基轉(zhuǎn)移和RAFT聚合反應(yīng)，開發(fā)了新聚合物的“一鍋法”合成工藝，酶催化反應(yīng)和RAFT聚合反應(yīng)的相容性非常好。整個(gè)工藝路線具有產(chǎn)率高、易于控制、酶催化劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，為新聚合物的合成和修飾提供了一種通用、簡單的方法。Li等17開發(fā)了一個(gè)高效的6，6-二甲基-3-氮雜雙環(huán)［3.1.0］己烷不對稱氧化系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含一個(gè)胺氧化酶參與的去對稱反應(yīng)和化學(xué)催化的亞硫酸加成反應(yīng)，將6，6-二甲基-3-氮雜雙環(huán)［3.1.0］己烷催化生成對應(yīng)的磺酸胺?；诖朔磻?yīng)系統(tǒng)，他們建立了一條高效、綠色的抗丙肝新藥波普瑞韋（Boceprevir）中間體合成路線。

2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀和進(jìn)展

目前，國內(nèi)研究人員圍繞生物催化的分子機(jī)制、生物催化反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制和生物催化系統(tǒng)的設(shè)計(jì)原理與方法等進(jìn)行了大量卓有成效的研究工作。在生物催化劑底物識別規(guī)律解析、生物催化劑理性設(shè)計(jì)、反應(yīng)調(diào)控、典型生物制造過程重構(gòu)等方面取得了較大進(jìn)展。

以環(huán)氧水解酶、羰基還原酶、醛縮酶等手性生物催化劑為研究重點(diǎn)，解析了大量酶/底物復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)及其相互作用，建立了可視化模型，揭示了手性識別機(jī)制及其實(shí)現(xiàn)的分子基礎(chǔ)，發(fā)展了基于分子機(jī)制的催化劑理性設(shè)計(jì)新方法，快速開發(fā)高選擇性、高活性和寬底物譜的催化用酶，解決了工業(yè)用高性能酶數(shù)量有限、研發(fā)速度慢的問題。基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子相互作用信息，發(fā)現(xiàn)底物結(jié)合口袋構(gòu)型、分子進(jìn)出通道空間位阻等顯著影響酶催化選擇性和效率的重要影響因素，認(rèn)識氧化還原酶、環(huán)氧水解酶等手性生物催化劑的分子手性識別規(guī)律、底物分子識別機(jī)理、活性通道進(jìn)出機(jī)制，建立了酶催化不對稱轉(zhuǎn)化的底物專一性、立體選擇性的分子理論基礎(chǔ)。基于結(jié)構(gòu)信息和分子催化機(jī)制，從立體選擇性調(diào)控、底物專一性擴(kuò)展、活性通道空間位阻改善等方面分別對醇脫氫酶、二氨基庚二酸脫氫酶、胺氧化酶、環(huán)氧水解酶、脂肪酶等進(jìn)行理性設(shè)計(jì)與功能強(qiáng)化，提高蛋白分子的適用性和穩(wěn)定性。通過基于結(jié)構(gòu)分析的理性設(shè)計(jì)，為手性化合物的高效合成提供了大量的高效新型手性生物催化劑18～21。

19 參考文獻(xiàn)

ZHANG D L, CHEN X, CHI J, et al.Semirational engineering a carbonyl reductase for the enantioselective reduction of β-amino ketones.ACS Catal, 2015, 5(4): 2452-2457.

20 參考文獻(xiàn)

WANG S, NIE Y, XU Y, et al.Unconserved substrate-binding sites direct the stereoselectivity of medium-chain alcohol dehydrogenase.Chem Commun, 2014, 50(58): 7770-7772.

21 參考文獻(xiàn)

HUANG L, MA H M, YU H L, et al.Altering the substrate specificity of reductase CgKR1 from Candida glabrata by protein engineering for bioreduction of aromatic α-ketoesters.Adv Synth Catal, 2014, 356(9): 1943-1948.

22 參考文獻(xiàn)

MA B D, KONG X D, YU H L, et al.Increased catalyst productivity in α-hydroxyacids resolution by esterase mutation and substrate modification.ACS Catal, 2014, 4(3): 1026-1031.

23 參考文獻(xiàn)

CHEN S Y, YANG C X, WU J P, et al.Multienzymatic biosynthesis of chiral β-hydroxy nitriles through co-expression of oxidoreductase and halohydrin dehalogenase.Adv Synth Catal, 2013, 355(355):3179-3190.

24 參考文獻(xiàn)

ZHANG C S, ZHANG Z J, LI C X, et al.Efficient production of (R)-o-chloromandelic acid by deracemization of o-chloromandelonitrile with a new nitrilase mined from Labrenzia aggregate.Appl Microbiol Biocechnol, 2012, 95(1): 91-99.

25 參考文獻(xiàn)

WANG Y J, LIU L L, WANG Y S , et al.Actinoplanes utahensis ZJB-08196 fed-batch fermentation at elevated osmolality for enhancing acarbose production.Bioresource Technology, 2012, 103(1): 337-342.

通過熱/動(dòng)力學(xué)研究深入認(rèn)識和解析了內(nèi)在/外在因素影響酶促反應(yīng)的本質(zhì)和規(guī)律，發(fā)展了增強(qiáng)酶催化反應(yīng)性能的理性調(diào)控新策略，實(shí)質(zhì)性地提高了反應(yīng)性能，充分發(fā)揮了生物催化反應(yīng)的高效性和高選擇性。構(gòu)建了基礎(chǔ)手性化合物的典型生化單元反應(yīng)體系（包括羰基還原、酯化水解、環(huán)氧水解和碳碳縮合反應(yīng)等），建立了不對稱還原反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)庫。 通過基于結(jié)構(gòu)調(diào)控和熱/動(dòng)力學(xué)研究，闡明環(huán)氧水解酶拆分反應(yīng)、羰基還原酶不對稱還原反應(yīng)、酯酶/脂肪酶拆分反應(yīng)中影響酶活性和選擇性的關(guān)鍵因素，并實(shí)現(xiàn)催化性能的人工高效調(diào)控。設(shè)計(jì)研究了多種典型多酶組合反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)了手性醇/酸/酰胺以及多手性中心化合物的多酶催化22 23。

設(shè)計(jì)和構(gòu)建了內(nèi)容豐富的手性砌塊和合成模塊庫，探明了催化體系中存在的手性傳遞、模塊組裝、優(yōu)化和調(diào)控等問題，形成了基于模塊組裝的手性化學(xué)品制造新體系，克服了目前手性催化體系研發(fā)周期過長的局限性，實(shí)現(xiàn)了阿托伐他汀、普瑞巴林、法羅培南和手性菊酯等多個(gè)手性化學(xué)品的制造過程重構(gòu)。建立了多種模塊設(shè)計(jì)和組裝新方法，闡明了節(jié)點(diǎn)對接匹配和手性傳遞機(jī)制，完成了大量高效手性合成模塊的構(gòu)建和優(yōu)化。構(gòu)建了手性醇、手性酸以及多反應(yīng)基團(tuán)化合物鹵代醇、鹵代酸等系列手性砌塊庫。在此基礎(chǔ)上，采用官能團(tuán)、手性中心、有效前體等拆分策略，基于手性化學(xué)品逆合成分析方法構(gòu)建手性化學(xué)品合成路線網(wǎng)絡(luò)，發(fā)掘關(guān)鍵合成節(jié)點(diǎn)［（S）-環(huán)氧氯丙烷、（S）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯、（R）-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯、6-氰基-（3R，5R）-二羥基己酸叔丁酯、（R）-1，3-丁二醇、（2S）-苯甲酰胺甲基-（3R）-羥基丁酸甲酯等］。運(yùn)用模塊化組裝策略，以大宗化學(xué)品為原料，以羰基還原酶、葡萄糖脫氫酶、鹵醇脫鹵酶、環(huán)氧水解酶、腈水解酶為主要元件的反應(yīng)模塊為工具，重構(gòu)阿托伐他汀鈣合成路線并建成年產(chǎn)60噸原料和2億片劑生產(chǎn)線；重構(gòu)手性農(nóng)藥（S）-丙烯菊酯生物合成路線并建成年產(chǎn)300噸生產(chǎn)線；重構(gòu)法羅培南手性生物合成路線并工業(yè)化生產(chǎn)；重構(gòu)普瑞巴林手性生物合成路線并完成中試試生產(chǎn)24 25。

3 生物催化技術(shù)的主要發(fā)展趨勢和展望

近些年，國內(nèi)外針對生物催化劑工程及生物催化過程工程中的科學(xué)問題與關(guān)鍵技術(shù)開展了大量的研發(fā)工作，并成功地對部分工業(yè)過程進(jìn)行了綠色改造，體現(xiàn)在某些大宗化學(xué)品的綠色制造以及精細(xì)化學(xué)品的生物合成。然而，就基于生物技術(shù)的“綠色化工”整體工藝而言，高效生物催化劑的開發(fā)與強(qiáng)化及其工業(yè)屬性表征效果仍然有限，適合工業(yè)過程并實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)加工工藝的過程替代為數(shù)不多。

作為一個(gè)相對新的領(lǐng)域，生物催化技術(shù)的發(fā)展仍不成熟，存在亟需探究的關(guān)鍵科學(xué)問題，今后生物催化技術(shù)研究將主要圍繞以下幾個(gè)方面開展。

（1）集中在生物催化劑工程層面，高效推進(jìn)生物催化劑的開發(fā)及工業(yè)屬性強(qiáng)化設(shè)計(jì)。生物催化劑固有的催化活性、專一性、穩(wěn)定性等局限性問題，尚難以適應(yīng)實(shí)際工業(yè)過程的要求，迫切需要進(jìn)行面向綠色化工的新型生物催化劑的開發(fā)，如何針對綠色化工系統(tǒng)，進(jìn)行目標(biāo)導(dǎo)向性的生物催化劑的高效開發(fā)和功能強(qiáng)化，針對目標(biāo)過程和底物實(shí)現(xiàn)“量體制酶”，是生物催化劑工程層面上的關(guān)鍵問題。

（2）集中在生物催化過程工程層面，生物催化劑工業(yè)屬性的高效表征與過程調(diào)控。生物催化劑的應(yīng)用過程實(shí)際就是其工業(yè)屬性的表征過程，生物催化劑的工業(yè)屬性需要與之相適應(yīng)的反應(yīng)系統(tǒng)以及相應(yīng)的微環(huán)境與過程相互調(diào)控才能得以實(shí)現(xiàn)、發(fā)揮和高效應(yīng)用，如何針對綠色化工過程，建立高效、經(jīng)濟(jì)的反應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)“酶盡其用”，是生物催化過程工程層面上的關(guān)鍵問題。同時(shí)，生物催化劑的開發(fā)與功能強(qiáng)化和生物催化劑性能表征與應(yīng)用的兩個(gè)方面又彼此互為指導(dǎo)和反饋，以螺旋遞進(jìn)的方式推動(dòng)綠色高效生物加工過程的發(fā)展，促進(jìn)生物催化的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

［本研究獲得國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（“973”計(jì)劃）資助（2011CB710800）。］

10.3969/j.issn.1674-0319.2016.04.003