謝江濤 蘇永永 吳鵬昌 向毅 王世峰 武興興 姜海濤

(1咸陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 咸陽(yáng) 712000; 2西安交通大學(xué)一附院神經(jīng)外科，陜西 西安 710061)

·論著·

NAC調(diào)控HIF-1α抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用研究

謝江濤1*蘇永永1吳鵬昌1向毅1王世峰1武興興1姜海濤2

(1咸陽(yáng)市中心醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 咸陽(yáng) 712000;2西安交通大學(xué)一附院神經(jīng)外科，陜西 西安 710061)

目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)通過(guò)抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)表達(dá)，進(jìn)而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用研究。方法對(duì)照組為常規(guī)培養(yǎng)的SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞，NAC組為常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上加入N-乙酰半胱氨酸，兩組培養(yǎng)48 h后實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)HIF-1αmRNA的表達(dá)，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)檢測(cè)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果NAC組HIF-1α mRNA的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。MTT檢測(cè)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況，NAC組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。NAC組早期凋亡率、晚期凋亡及壞死率均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。結(jié)論N-乙酰半胱氨酸具有下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)，進(jìn)而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，加速凋亡的作用。

N-乙酰半胱氨酸; 膠質(zhì)瘤; 低氧誘導(dǎo)因子-1α

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，膠質(zhì)瘤預(yù)后較差及高復(fù)發(fā)率至今仍是困擾神經(jīng)外科的難題，因此積極探索針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)具有重要的理論及實(shí)際意義。膠質(zhì)瘤瘤體的快速增殖使其處于一種相對(duì)低氧的狀態(tài)，在這種條件下低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)表達(dá)增高，從目前的研究得知HIF-1α可誘導(dǎo)激活多種靶基因表達(dá)相應(yīng)的下游產(chǎn)物從而使膠質(zhì)瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧應(yīng)激反應(yīng)[1,2]。因此抑制HIF-1α的表達(dá)降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞適應(yīng)微環(huán)境從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有可能成為輔助治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)是一種典型的外源性抗氧化劑，NAC的作用機(jī)制主要是通過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后進(jìn)行乙酰化反應(yīng)，具有拮抗氧化應(yīng)激的作用，且研究指出NAC可下調(diào)HIF-1α的表達(dá)[3]。本次試驗(yàn)擬研究NAC通過(guò)抑制HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，為研究膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為及治療靶點(diǎn)提供新的思路和理論依據(jù)。

材料與方法

一、主要材料與儀器

膠質(zhì)瘤SHG-44瘤株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞研究所，N-乙酰半胱氨酸購(gòu)于SIGMA公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于健康元生物醫(yī)藥有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)試劑盒購(gòu)于Fermentas公司。流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD FACSCalibur，型號(hào)：DICKIN SON)，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：Bio-Rad iQTM5)等。

二、細(xì)胞系的培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞株采用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液在 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞。NAC組：常規(guī)培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞+N-乙酰半胱氨酸(濃度為10 mmol/L，培養(yǎng)48 h)。

三、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶聯(lián)反應(yīng)(real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)HIF-1α的mRNA表達(dá)

兩組到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間后，RNA提取試劑盒(RNAfast200)快速抽提RNA。設(shè)定反應(yīng)條件后置于多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)中止后采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(實(shí)時(shí)PCR iQTM5專用軟件)，擴(kuò)增曲線及溶解曲線分析。

四、四甲基偶氮唑鹽比色法(4-dimethylthiahiazo,MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖

兩組到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間后，接種于96孔板，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h，使MTT還原為藍(lán)色結(jié)晶物Formazan，吸棄上清加入二甲亞楓(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μl，產(chǎn)物完全溶解，MK3酶標(biāo)儀(波長(zhǎng)：492 nm)檢測(cè)每孔吸光度(optical density,OD值)并計(jì)算各組相對(duì)抑制率。

五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

兩組到達(dá)培養(yǎng)時(shí)間后，轉(zhuǎn)入10 ml離心管中離心，棄上清后再離心一次并棄上清，每孔加入500 μl的BindingBuffer，加入5 μl細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑(Annexin V-FITC)，再加入10 μl Propidium lodide，輕輕混勻后轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，室溫下避光反應(yīng)15 min。隨后使用流式細(xì)胞儀(488 nm激發(fā)波長(zhǎng)530 nm發(fā)射波長(zhǎng))檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

六、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

結(jié) 果

一、RT-PCR檢測(cè)HIF-1α的mRNA表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)采用比較Ct法2-△△CT(2-△△CT=2-(實(shí)驗(yàn)組目的基因-實(shí)驗(yàn)組參照基因)-(對(duì)照組目的基因-對(duì)照組參照基因))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析NAC組1.07±0.36與對(duì)照組0.22±0.06，HIF-1a及β-actin的溶解曲線和擴(kuò)增曲線(圖1)。對(duì)照組及NAC之間進(jìn)行t檢驗(yàn)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。NAC組HIF-1a的mRNA表達(dá)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

二、MTT法檢測(cè)SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況

數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法分析，Plt;0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NAC組較對(duì)照組細(xì)胞的吸光度(OD值)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。NAC組較對(duì)照組相對(duì)抑制率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)(表1)。

三、流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

數(shù)據(jù)采用流式軟件分析后的原始數(shù)據(jù)表示，數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法分析，Plt;0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)照組及NAC組早期凋亡率、晚期凋亡及壞死率如下表示(表2、圖2)，對(duì)照組早期凋亡率、晚期凋亡及壞死率均低于NAC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。

GroupOpticaldensity(mmol/L)Relativeinhibitionrate Controlgroup1．09±0．20?0．14 NACgroup0．89±0．08b0．18c

bPlt;0.05,vscontrol group;cPlt;0.05,vscontrol group.

表2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組及NAC組細(xì)胞凋亡率
Tab 2 Apoptosis rate between the control group and NAC group detected by flow cytometry

GroupEarlyapoptosisrate(%)Apoptosisandnecrosisrate(%) Controlgroup3．22d16．00e NACgroup9．6618．72

dPlt;0.05,vsNAC group;ePlt;0.05,vsNAC group.

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的溶解曲線和擴(kuò)增曲線
Fig 1 Dissolution curve and amplification curve of RT-PCR
A:Amplification curve of HIF-1α; B:Dissolution curve of HIF-1α; C:Amplification curve of β-actin; D:Dissolution curve of β-actin.

圖2 對(duì)照組及NAC組的早期凋亡、晚期凋亡及壞死率
Fig 2 The early apoptosis rate,apoptosis and necrosis rate in control group and NAC group
A:Control group; B:NAC group.

討 論

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，盡管對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療采取了積極的手術(shù)切除及術(shù)后放療和化療等綜合治療方法，但膠質(zhì)瘤預(yù)后較差及高復(fù)發(fā)率仍是困擾神經(jīng)外科的難題，因此積極探索針對(duì)膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)具有重要的理論及實(shí)際意義。

膠質(zhì)瘤與其他實(shí)體性腫瘤相類似，瘤細(xì)胞因生長(zhǎng)失控使其增殖、代謝異常旺盛，其內(nèi)部瘤細(xì)胞總是處于一種相對(duì)低氧的狀態(tài)，在這種低氧條件下低氧誘導(dǎo)性因子-1α(HIF-1α)表達(dá)明顯增高。HIF-1α在應(yīng)對(duì)低氧微環(huán)境時(shí)，能調(diào)節(jié)多種涉及低氧應(yīng)激下細(xì)胞適應(yīng)和存活的靶基因，增加其轉(zhuǎn)錄活性并表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)物以適應(yīng)低氧應(yīng)激反應(yīng)，從而維持腫瘤的生長(zhǎng)、代謝及其侵襲性，使其適應(yīng)缺氧微環(huán)境，因此對(duì)HIF-1α的調(diào)控必然成為膠質(zhì)瘤適應(yīng)低氧微環(huán)境的核心點(diǎn)[4]。

腫瘤組織因生長(zhǎng)失控，局部的血管系統(tǒng)已經(jīng)不能為快速生長(zhǎng)的腫瘤組織提供足夠的氧氣，其內(nèi)部組織細(xì)胞總是處于一種相對(duì)低氧的狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞在低氧情況下以糖酵解的代謝方式為主，通過(guò)抑制線粒體呼吸鏈、降低線粒體的膜電位，因此線粒體有氧呼吸電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈有可能因受阻而產(chǎn)生活性氧[5]。

活性氧[6]是線粒體的電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈在運(yùn)氧過(guò)程中電子遺漏，基態(tài)氧通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)鏈時(shí)接受漏出的電子轉(zhuǎn)變的一種氧化應(yīng)激物。腫瘤細(xì)胞在低氧情況下以糖酵解的代謝方式為主，因此線粒體有氧呼吸電子轉(zhuǎn)運(yùn)鏈有可能因受阻而產(chǎn)生活性氧，已有研究證實(shí)NAC可顯著拮抗活性氧氧化應(yīng)激的作用[7]。

NAC是一種典型的外源性抗氧化劑[8]，其作用機(jī)制主要是通過(guò)N-乙酰半胱氨酸中的巰基基團(tuán)， 穿過(guò)細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后進(jìn)行乙?；磻?yīng)并由N-乙酰半胱氨酸轉(zhuǎn)變成半胱氨酸，而半胱氨酸上的巰基基團(tuán)是NAC抗氧化作用的活性基團(tuán)，巰基基團(tuán)到達(dá)作用位點(diǎn)后可結(jié)合活性氧中的超氧陰離子自由基(O2·-)，進(jìn)而拮抗活性氧氧化應(yīng)激的作用。有研究認(rèn)為NAC可通過(guò)拮抗活性氧進(jìn)而調(diào)控HIF-1α[9,10]。本次實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)NAC作用后HIF-1α mRNA的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，進(jìn)一步驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究明確NAC具有下調(diào)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而抑制SHG-44膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，加速凋亡的作用。提示抑制HIF-1α的表達(dá)降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞適應(yīng)微環(huán)境從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有可能成為輔助治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為抗氧化劑NAC輔助治療膠質(zhì)瘤提供了新的思路和理論依據(jù)，為進(jìn)一步研究抗氧化劑在膠質(zhì)瘤的輔助治療中的應(yīng)用打下了一定的基礎(chǔ)。

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NACregulatingHIF-1αinhibitsthegrowthofgliomacells

XIEJiangtao1,SUYongyong1,WUPengchang1,XIANGYi1,WANGShifeng1,WUXingxing1,JIANGHaitao2

1DepartmentofNeurosurgery,XianyangCentralHospital,Xianyang712000;2DepartmentofNeurosurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,Xi'an710061,China

ObjectiveThe N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibits the expression hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) and further inhibits the growth of SHG-44 glioma cells.MethodsSHG-44 glioma cells for conventional culture was control group. N-acetyl-L-cysteine was added in NAC group. The mRNA expressions of HIF-1α was detected by RT-PCR after 48 h; 4-dimethylthiahiazo (MTT) detection was used to test the proliferation of SHG-44 glioma cells and the apoptosis of SHG-44 glioma cells was detected by flow cytometry method.ResultsThe expression of HIF-1α mRNA in NAC group was significantly lower than that in the control group (Plt;0.05). The proliferation of SHG-44 glioma cells was detected by MTT assay,and the proliferation in the NAC group was significantly lower than that of the control group (Plt;0.05). The early apoptosis rate,apoptosis and necrosis rate in NAC group were significantly higher than those in control group (Plt;0.05).ConclusionNAC could down-regulate the expression of HIF-1α,which could accordingly inhibit the growth of SHG-44 glioma cells and accelerate the apoptosis.

N-acetyl-L-cysteine; Glioma; Hypoxia-inducible factor-1α

1671-2897(2016)15-321-04

R 739.41

A

謝江濤，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：Jack.198376@163.com

*通訊作者：謝江濤，碩士，主治醫(yī)師，E-mail：Jack.198376@163.com

2015-07-20；

2016-01-10)