周興，周青，賴永金

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；2.萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院，江西萍鄉(xiāng)337000）

·基礎研究·

腎虛肝郁證遲發(fā)性性腺功能減退癥大鼠模型的建立與評價

周興1，周青1，賴永金2

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007；2.萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院，江西萍鄉(xiāng)337000）

目的建立“腎虛肝郁證”遲發(fā)性性腺功能減退癥（Late onset hypogonadism，LOH）動物模型，并對其進行評價。方法以中醫(yī)理論“房勞過度傷腎”、“郁久傷肝”為指導，采用“退役種鼠（40周齡）+復合情志刺激+孤養(yǎng)”方法，建立“腎虛肝郁證”LOH動物模型，與正常組（8周齡）比較，以血清總睪酮、懸尾實驗、睪丸間質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)、睪酮合成相關酶以及Caspase-3 mRNA和蛋白表達為指標。結(jié)果模型組大鼠出現(xiàn)一系列典型的LOH精神、心理、體能改變，與正常組比較，模型組大鼠血清總睪酮水平明顯降低，懸尾不動時間顯著延長，睪丸組織Caspase-3 mRNA和蛋白表達增強，睪酮合成相關酶類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）[13]、細胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶（Cytochrome P450 side-chain cleavage，P450scc）[14]、3β-羥甾脫氫酶（3beta-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）mRNA和蛋白表達下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；模型組睪丸間質(zhì)變少，睪丸間質(zhì)細胞線粒體數(shù)量減少，出現(xiàn)水腫，線粒體嵴消失。結(jié)論“退役種鼠+復合情志刺激+孤養(yǎng)”方法復制“腎虛肝郁證”LOH模型切實可行，有較高的實用價值。

遲發(fā)性性腺功能減退癥；動物模型；腎虛肝郁證

遲發(fā)性性腺功能減退癥（Late onset hypogonadism，LOH），普遍存在于中老年男性，患者出現(xiàn)體能下降、神經(jīng)精神異常、性功能減退等一系列臨床癥狀，嚴重影響了中老年男性的日常生活工作。其發(fā)

病主要是增齡導致的雄激素水平下降[1]，其他諸多因素，如內(nèi)分泌改變、慢性應激、肥胖、不良生活方式、惡劣生活環(huán)境、生理-心理-社會改變等，也參與其中。因此，在LOH動物模型復制中，老齡、低睪酮水平應作為關鍵性觀察因素。中醫(yī)歷代文獻無“LOH”之名，可歸屬于“郁證”、“臟躁”、“陽痿”、“不寐”“腎虛”等范疇，《素問·上古天真論》云：“六八，陽氣衰竭于上，面焦，發(fā)鬢斑白；七八，肝氣衰，筋不能動；八八，天癸竭，精少，腎臟衰”?！澳I虛肝郁”證候貫穿于LOH的整個發(fā)展過程[2]。因此，在LOH動物模型復制中，本研究又以中醫(yī)理論“郁久傷肝”、“房勞過度傷腎”為指導，選擇退役種鼠（房勞過度），采用孤養(yǎng)、慢性應激等情志刺激（久郁），試圖模擬LOH的中醫(yī)發(fā)病過程，構(gòu)建“腎虛肝郁證”LOH動物模型，并對其進行評價，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物（1）造模組大鼠：SPF級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠（退役種鼠），40周齡，體質(zhì)量（400±50）g，40只。購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001；（2）正常對照組大鼠：SPF級SD雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量230～250 g，15只。購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004。均飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心，SPF級動物專用飼料飼養(yǎng)，恒定溫度（21±3）℃、濕度（75±5）%，光-暗周期、動物攝食及飲水條件按造模需要設定。適應性喂養(yǎng)1周后進行試驗。

1.1.2 主要試劑大鼠血清睪酮檢測用ELISA試劑盒（上海巧伊生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：JEN-03），TRIZOL試劑（美國BIOMIGA公司），SYBR Green qRCR Mix（美國GeneCopoeia公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國GeneCopoeia公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：P0010），羊抗鼠二抗（北京康為世紀生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：CW0102），羊抗兔二抗（北京康為世紀生物科技有限公司，產(chǎn)品編號：CW0103）。

1.1.3 主要儀器5424R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf），PCR儀（德國Eppendorf），Tannon1600R型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能），定量PCR儀（美國Life Technologies），VE 186轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能），SIMSV0000超純水儀（美國Millipore），Tanon 5500全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法以中醫(yī)“房勞過度傷腎”為理論基礎，選擇雄性SD退役種鼠（40周齡，40只），復制腎精虧虛證；同時參考金光亮[3-4]、周力[5]、于琦[6]等用于復制肝郁證的復合情志刺激造模法，每籠一只孤養(yǎng)，每日隨機給予以下不良刺激中的一種：（1）禁水（24 h）；（2）晝夜顛倒（8∶00-18∶00將動物房門關上、拉下窗簾，置于黑暗環(huán)境；18∶00-8∶00打開日光燈，并使房間內(nèi)照度保持在300 Lux）；（3）禁食（24 h）；（4）夾尾（用25 mm長尾票夾在距尾端1 cm處夾住鼠尾，30 min）；（5）噪音（70分貝，持續(xù)2 h）。每日1種，每種刺激不連續(xù)使用，每周隨機休息2 d，連續(xù)4周。正常對照組大鼠正常條件飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。

1.2.2 動物分組造模完成后，斷尾采血0.8～1.2 mL，離心管分裝，3 000 r/min，離心10 min，分離出血清，-80℃冰箱冷凍保藏，ELISA法檢測血清睪酮濃度。參照何清湖[7]、周興[8]等的方法，統(tǒng)計得出15只8周齡SD雄性大鼠血清睪酮10%位數(shù)，以此為切點值，凡是經(jīng)復合情志刺激造模后，大鼠血清睪酮水平均低于該切點值的作為LOH大鼠模型。

經(jīng)統(tǒng)計分析，15只8周齡SD雄性大鼠血清睪酮10%位數(shù)為1.91 ng/mL，以TT 1.91 ng/mL為切點值，40周齡SD雄性退役種鼠中，共有34只復合納入標準，隨機選取6只，設為模型組；隨機選取8周齡SD雄性大鼠6只，設為正常對照組。

1.2.3 樣本取材造模及分組完成后，正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)4周，于末次給藥24 h后處死動物，進行各項指標檢測。20%烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，靜置并離心后取上清液分裝，-80℃凍存待檢。取一側(cè)睪丸置4%多聚甲醛固定，另一側(cè)睪丸取出適量組織置于凍存管，-80℃保存?zhèn)溆?，另取適量睪丸組織置2.5%戊二酸PE管內(nèi)固定。

1.2.4 大鼠一般情況觀察造模及實驗期間密切觀察大鼠毛色、精神狀態(tài)、體質(zhì)量、活動、飲水、飲食等情況變化。

1.2.5 大鼠懸尾試驗（Tail suspension test）[9]本實驗于造模前1 d、造模完成后第1天、第28天進行。將大鼠尾端2 cm的部位固定在一水平木板上（木板離地1 m左右），使動物呈倒掛狀。懸掛兩側(cè)用板隔開動物視線，動物為克服不正常的體位而掙扎活動，但活動一定時間后，出現(xiàn)間斷性“不動”，顯示“失望”狀態(tài)。計算6 min內(nèi)的不動時間，并同時觀察大鼠掙扎幅度及抑郁狀態(tài)。此實驗能一定程度地反映動物的肌力及抑郁程度。

1.2.6 大鼠睪丸系數(shù)睪丸系數(shù)=雙側(cè)睪丸質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.7 睪丸組織形態(tài)學觀察采用HE染色，光鏡下觀察各組織形態(tài)學改變，在湖南中醫(yī)藥大學病理教研室完成。

1.2.8 睪丸組織超微結(jié)構(gòu)觀察電鏡下觀察睪丸間質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)改變，在中南大學湘雅醫(yī)院電鏡室完成。

1.2.9 血清睪酮測定采用ELISA法，根據(jù)睪酮ELISA試劑盒說明書操作，在湖南師范大學生命科學院完成。

1.2.10 睪丸組織睪酮合成相關酶、Caspase-3 mRNA表達采用Real-time PCR法。根據(jù)Trizol RNA提取試劑盒說明書方法提取睪丸組織總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，確定Real-time PCR的反應體系及反應條件參數(shù)如下：見表1-2。

表1 Real-time PCR反應體系

表2 Real-time PCR反應條件參數(shù)

在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找基因序列，設計Real-time PCR引物序列如下：StAR上游引物5’-G C A A A A G G C C T T G G G C A T A C-3’，StAR下游引物5’–T C T G T C C A T G G G C T G G T C T A-3’；P450 scc上游引物5’–T C A G C G A T G A C C T A T T C C G C-3’，P450 scc下游引物5’–A G T C T G G A G G C A T G T T G A G C-3’；3β-HSD上游引物5’–T G T C A T T G A T G T C T C A C A T G T C C-3’，3β-HSD下游引物5’-A G T A G A T G A A G G C T G G C A C A C-3’；Caspase-3上游引物5’-T C T A C C G C A C C C G G T T A C T A-3’，Caspase-3下游引物5’-C G T A C A G T T T C A G C A T G G C G-3’；ACTIN上游引物5’–A C T A T C G G C A A T G A G C G G T T-3’，ACTIN下游引物5’–A A T G C C T G G G T A C A T G G T G G-3’。

使用Life Technologies公司的實時熒光定量PCR儀對樣品進行檢測，每個樣品重復3次。實驗結(jié)果采用2-ΔCt法，計算目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.2.11 睪丸組織睪酮合成相關酶、Caspase-3蛋白表達采用Western blot法。取大鼠睪丸組織，按20 mg：150～250 μL比例，加入RIPA裂解液，用玻璃勻漿器于冰上裂解勻漿，BCA工作液測定樣品蛋白濃度，SDS-PAGE電泳2～3 h，至溴酚蘭剛跑出即終止，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜2 h，室溫下脫色搖床上搖動封閉1～2 h，加入用TBST稀釋的一抗（4℃孵育過夜），再加入用TBST稀釋的HRP標記二抗（室溫孵育1 h），孵育結(jié)束后，ECL發(fā)光顯色液顯色，在全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)中拍照，曝光30、60、90 s，保存圖片，并用Lab-Works軟件對圖像進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

正常組：大鼠一般情況良好，運動活潑有力，反應敏捷，眼睛明亮有神，食欲健旺，鼠毛柔順濃密，潔凈有光澤，肌肉發(fā)達，脂肪豐滿，體質(zhì)量均勻增長。模型組：經(jīng)4周的造模周期，大鼠出現(xiàn)精神萎靡，倦臥少動，甚者蜷縮至墊料下面，眼睛暗淡少神，進食減少，鼠毛枯干蓬亂萎黃，污濁無光澤，體質(zhì)量無明顯增長。

2.2 造模組大鼠體質(zhì)量、懸尾試驗、血清睪酮情況及與正常組比較

造模組大鼠造模前、后體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示雄性退役種鼠經(jīng)復合情志刺激

造模后，體質(zhì)量變化不明顯。

造模組大鼠造模前、后以及與正常對照組比較，大鼠懸尾不動時間均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），提示老齡大鼠的行為能力較青年大鼠已經(jīng)出現(xiàn)下降，表現(xiàn)出肌力降低、一定程度的抑郁等，經(jīng)復合情志刺激造模后，其行為能力出現(xiàn)進一步下降。

造模后，造模組大鼠血清睪酮水平與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示老齡大鼠血清睪酮水平明顯低于青年大鼠，符合LOH動物模型要求。見表3。

表3 兩組大鼠造模前后情況比較（±s）

表3 兩組大鼠造模前后情況比較（±s）

注：與本組造模前比較▲P＜0.01；與正常對照組比較△P＜0.01。

組別造模組正常對照組t P n 40 15體質(zhì)量（g）造模前造模后613.65±54.66602.97±54.48△-222.19±19.52 38.152 0.000懸尾試驗（s）造模前造模后睪酮（ng/mL）造模后258.43±4.30289.60±4.94▲△1.43±0.60△-186.47±6.443.95±1.33 63.372-9.728 0.0000.000

2.3 造模后兩組大鼠情況比較

造模完成后，正常條件下繼續(xù)飼養(yǎng)4周，比較兩組大鼠造模后第1天、第28天情況變化。

2.3.1 睪丸組織形態(tài)學觀察病理切片顯示，正常對照組大鼠各級生精細胞發(fā)育正常，層次清晰，睪丸間質(zhì)正常。模型組大鼠初級精母細胞數(shù)量減少，精子細胞壞死紊亂，大量吞噬細胞產(chǎn)生，精子大量減少，睪丸間質(zhì)變少，細胞與細胞間分界不清。見圖1。

圖1 睪丸組織HE染色圖（×400）

2.3.2 睪丸組織超微結(jié)構(gòu)觀察電鏡結(jié)果顯示，正常對照組大鼠睪丸間質(zhì)細胞線粒體多，線粒體聚集，形成線粒體鞘，線粒體體積大，線粒體嵴清晰，線粒體無水腫。模型組大鼠睪丸間質(zhì)細胞中線粒體數(shù)量明顯減少，線粒體體積小，部分線粒體水腫，線粒體嵴不清晰，嵴水腫。見圖2。

2.3.3 兩組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)、懸尾試驗、睪酮濃度變化造模后第1天、第28天比較，模型組在體質(zhì)量、懸尾不動時間、睪酮濃度方面無明顯改變，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；正常對照組體質(zhì)量增加明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組懸尾不動時間、睪丸指數(shù)、睪酮濃度與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表4。

圖2 睪丸間質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)圖

2.3.4 兩組大鼠睪酮合成相關酶、Caspase-3 mRNA表達（RT-PCR）兩組造模后第28天比較，模型組Caspase-3 mRNA表達明顯升高，StAR、P450scc、3β-HSD mRNA表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表5。

2.3.5 兩組大鼠睪酮合成相關酶、Caspase-3蛋白表達（Western Blot）兩組造模后第28天比較，模型組Caspase-3蛋白表達明顯升高，StAR、P450scc、3β-HSD蛋白表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表6、圖3。

3 討論

目前，國內(nèi)外對于LOH動物模型的復制，主要有以下方法：（1）自然老化造模[10]；（2）化學藥物誘導

造模，藥物如環(huán)磷酰胺[7]。自然老化造模一般用18-20月齡的大鼠，該模型與LOH的生物學特性較為接近，但造模周期太長，國內(nèi)大多數(shù)的實驗動物中心都不生產(chǎn)，因此來源稀少，價格昂貴。利用環(huán)磷酰胺的生殖毒性，造成睪丸間質(zhì)細胞受損、睪酮合成酶活性降低，睪酮水平下降，能在一定程度模擬LOH特征，但需要使用外源性藥物干預，同時對于LOH存在的自主神經(jīng)紊亂等癥狀難于復制。同時，國內(nèi)針對LOH的中醫(yī)證候模型的復制還幾乎是空白。

表4 造模后兩組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)、懸尾試驗、睪酮濃度情況比較（±s，n=6）

表4 造模后兩組大鼠體質(zhì)量、睪丸指數(shù)、懸尾試驗、睪酮濃度情況比較（±s，n=6）

注：與本組第1 d比較▲P＜0.05；與正常對照組比較△P＜0.01。

組別睪丸指數(shù)（%）正常對照組模型組體質(zhì)量（g）1 d28 d 217.03±18.68295.63±23.07▲605.15±92.27598.55±88.94懸尾試驗（s）1 d28 d 190.17±5.53182.67±3.27 287.00±4.56280.33±6.47△睪酮（ng/mL）1 d28 d 3.48±1.424.41±0.94 1.29±0.451.35±0.29△1.15±0.10 0.55±0.06△t -10.098-8.076-33.095-33.0073.6037.65212.626 P 0.0000.0000.0000.0000.0050.0000.000

表5 兩組大鼠睪丸組織睪酮合成相關酶（2-ΔCt×10-3）、Caspase-3 mRNA（2-ΔCt×10-4）表達（±s，n=5）

表5 兩組大鼠睪丸組織睪酮合成相關酶（2-ΔCt×10-3）、Caspase-3 mRNA（2-ΔCt×10-4）表達（±s，n=5）

注：與正常對照組比較▲P＜0.01。

組別正常對照組模型組Caspase-3 3.18±0.54 14.66±4.46▲StAR 29.62±12.25 5.53±3.47▲P450scc 22.88±14.51 2.75±0.90▲3β-HSD 30.96±17.38 6.59±3.78▲t -8.4946.0094.5484.410 P 0.0000.0000.0010.001

表6 兩組大鼠睪丸組織睪酮合成相關酶、Caspase-3蛋白表達（±s，n=5，Caspase-3、StAR、P450scc、3β-HSD/Actin）

表6 兩組大鼠睪丸組織睪酮合成相關酶、Caspase-3蛋白表達（±s，n=5，Caspase-3、StAR、P450scc、3β-HSD/Actin）

注：與正常對照組比較▲P＜0.01。

組別正常對照組模型組Caspase-3 0.16±0.02 0.39±0.09▲StAR 0.38±0.01 0.16±0.08▲P450scc 0.70±0.22 0.49±0.17▲3β-HSD 0.45±0.03 0.27±0.03▲t -4.6465.6221.5029.679 P 0.0040.0010.0040.000

圖3 大鼠睪丸組織Caspase-3，睪酮合成相關酶StAR、P450scc、3β-HSD蛋白的表達電泳圖

基于現(xiàn)階段中西醫(yī)對LOH發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)的認識，本研究團隊在以往研究的基礎上，結(jié)合上述造模方法，選用“退役種鼠+復合情志刺激+孤養(yǎng)”方法，構(gòu)建“腎虛肝郁證”LOH動物模型。40周齡雄性退役種鼠，價格低廉，易于購買，相比較于18-20月齡的大鼠，其飼養(yǎng)周期明顯縮短；同時，種鼠由于反復配種需要，其老化速度明顯快于普通的成年大鼠；中醫(yī)學理論認為，腎藏精，主生殖，房室過度，暗耗腎精，可出現(xiàn)“腎精虧損”的證候；此外，模擬LOH發(fā)病的慢性應激、環(huán)境、心理等因素，采用復合情志刺激結(jié)合孤養(yǎng)方法，中醫(yī)理論認為，肝主疏泄，長期不良情志刺激、孤養(yǎng)可引發(fā)“肝郁證”的出現(xiàn)，從而復制出“腎虛肝郁”證候類型的LOH動物模型。本模型的優(yōu)勢在于，一方面運用的是自然老化大鼠，無需藥物干預，能最大程度復制LOH的發(fā)病過程，種鼠的運用能加速其老化進程，節(jié)約了時間和經(jīng)濟成本；另一方面結(jié)合孤養(yǎng)、復合情志刺激等方法，復制出“腎虛肝郁”證候類型，為研究LOH提供了很好的中醫(yī)證候動物模型，應該是一種比較可靠且操作性較強的造模方法。

造模結(jié)束后，模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、蜷臥少動、進食減少，懸尾不動時間明顯延長（P＜0.01）等一系列典型的LOH精神心理、體能改變，同時模型組大鼠血清總睪酮水平明顯低于正常對照組大鼠（P＜0.01），均符合LOH動物模型要求。

關于增齡影響睪酮合成，進而可能影響LOH發(fā)病，其機制之一是睪丸間質(zhì)細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。李維仁[11]等研究證實，老年人睪丸間質(zhì)細胞胞漿中，細胞器較少，可見大量腫脹的線粒體，線粒體嵴消失，少見有脂滴，這與睪酮合成功能降低密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠睪丸間質(zhì)變少，睪丸間質(zhì)細胞線粒體數(shù)量明顯減少，體積小，水腫明顯，線粒體嵴消失。引發(fā)這一現(xiàn)象的重要原因可能與睪丸間質(zhì)細胞過度凋亡有關，蔡崇岳[12]等研究顯示，衰老大鼠睪丸組織中Caspase-3表達明顯增強。而作為誘導細胞

凋亡關鍵分子的Caspase家族，其Caspase-3是處于最核心位置，它的高水平表達可誘導睪丸間質(zhì)細胞凋亡的增加。本研究也證實，模型組大鼠睪丸組織中Caspase-3 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高。

關于增齡影響睪酮合成的另一可能機制是，增齡對睪酮合成酶活性與表達的影響。在睪酮合成過程中，類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，StAR）[13]、細胞色素膽固醇側(cè)鏈裂解酶（Cytochrome P450 side-chain cleavage，P450scc）[14]、3β-羥甾脫氫酶（3beta-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD）[15]均是睪酮合成的關鍵酶。靳會卿[16]等研究顯示，自然衰老大鼠（18月齡）睪丸組織中StAR、P450scc、3β-HSD蛋白表達水平顯著低于青年組大鼠（4月齡）；李維仁[11]等研究也證實，老年人組（70～90歲）睪丸組織中StAR、P450scc蛋白表達水平顯著低于青年組（20～30歲）（P＜0.05）。本研究顯示，模型組大鼠睪丸組織中StAR、P450scc、3β-HSD mRNA及蛋白表達水平均顯著低于正常對照組，與靳會卿[16]等的研究一致。

綜上所述，本實驗以中醫(yī)理論“房勞過度傷腎”、“郁久傷肝”為指導，選擇退役種鼠（房勞過度），采用孤養(yǎng)、慢性應激等情志刺激（久郁）方法，模擬LOH的中醫(yī)發(fā)病過程，構(gòu)建“腎虛肝郁證”LOH動物模型，出現(xiàn)有臨床典型的LOH癥狀?；诔⒔Y(jié)構(gòu)、基因組學、蛋白組學研究證實，模型組大鼠睪丸間質(zhì)細胞線粒體結(jié)構(gòu)改變、Caspase-3表達增強以及StAR、P450scc、3β-HSD表達下降，均符合LOH發(fā)病機制的現(xiàn)代研究。因此，可以認為“退役種鼠+復合情志刺激+孤養(yǎng)”方法構(gòu)建的“腎虛肝郁證”LOH動物模型是成功的，符合中醫(yī)理論特色。

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（本文編輯賀慧娥）

Establishment and Evaluation of Rat Model of Late Onset Hypogonadism of Liver Constraint and Deficiency of Kidney-type

ZHOU Xing1，ZHOU Qing1，LAI Yongjin2
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha Hunan 410007,China；2.Pingxiang Chinese Medicine Hospital,Pingxiang,Jiangxi 337000,China)

Objective To establish late onset hypogonadism（LOH）rat models with kidney-asthenia and liver depression syndrome and evaluate their value in research.Methods The rat models with kidney-asthenia and liver depression syndrome were established by using retired mated rat（40 weeks）+various emotional stimulation+social isolation methods，which is guided by TCM theory”sexual excess injury kidney essence”and”depressed anger damaging the liver”.Compared with the control group（8 weeks），the serum testosterone，tail suspension test，Leydig cells ultrastructure，the expression of testosterone synthetase and mRNA and protein of Caspase-3 were observed.Results A series of spirit，psychological health and physical fitness on LOH were observed.Compared with the normal group，serum testosterone levels in the model rats were decreased significantly，TST times increased significantly，the expressions of Caspase-3 were increased，the related testosterone synthetase StAR，P450scc，3β-HSD were decreased，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Also the testis interstitium was less，thequantityofLeydigcellsmitochondrionwasreducedandthemitochondrialcristaeinthemodelgroup was disappeared.ConclusionThe LOH rat models with kidney-asthenia and liver depression syndrome can be established by using retired mated rat（40 weeks）+various emotional stimulation+social isolation methods，which are with high practical values.

late onset hypogonadism；models；animals；kidney-asthenia and liver depression syndrome

R256.5；R285.5

A

doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2016.03.009

2015-12-02

國家自然科學基金青年科學基金資助項目（81202706）。

周興，男，副主任醫(yī)師，博士，從事中西醫(yī)結(jié)合男科學專業(yè)。