黃銀妹，劉華鋼，蘇桂玉，李英杰，王小潔，蔣 霞

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2．廣西食品藥品監(jiān)督管理局，廣西 南寧 530022；3．廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；4．暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632；5．廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)部，廣西 南寧 530021)

?

二去水衛(wèi)矛醇對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的抑制作用

黃銀妹1，劉華鋼2，蘇桂玉3，李英杰4，王小潔1，蔣 霞5

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2．廣西食品藥品監(jiān)督管理局，廣西 南寧 530022；3．廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；4．暨南大學(xué)藥學(xué)院中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632；5．廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)部，廣西 南寧 530021)

目的 評(píng)價(jià)二去水衛(wèi)矛醇(dianhydrogalactitol, DAG)在肺癌NCI-H460細(xì)胞上的抗腫瘤作用，探討其抗腫瘤作用機(jī)制。方法 采用CCK-8法、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞的增殖抑制作用。顯微拍照觀察細(xì)胞形態(tài)改變；Hoechst 33342檢測(cè)細(xì)胞核染色質(zhì)的變化。Real time PCR法檢測(cè)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(Topo Ⅱ)mRNA的表達(dá)水平。Western blot法檢測(cè)Topo Ⅱ蛋白表達(dá)水平。另外，應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)DAG與Topo Ⅱ的相互作用。

二去水衛(wèi)矛醇；肺癌；NCI-H460細(xì)胞；拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ；拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑；分子對(duì)接

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響著人類(lèi)的生命健康。在我國(guó)的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中，肺癌的發(fā)病率和死亡率均位居第一位，是癌癥死亡的主要原因。在新增癌癥患者中，肺癌的發(fā)病率逐年上升。據(jù)估計(jì)，2015年我國(guó)肺癌患者新增病例數(shù)將會(huì)達(dá)到73.33萬(wàn)人，死亡人數(shù)達(dá)到61.02萬(wàn)人[1]。Topo Ⅱ?qū)τ谡婧思?xì)胞的存活起著重要的作用，其在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組過(guò)程中，以及在形成正確的染色體結(jié)構(gòu)、染色體分離和濃縮中發(fā)揮著重要的作用[2]，是抗腫瘤藥物的重要靶標(biāo)。Topo Ⅱ抑制劑按抑制機(jī)制可以分為催化抑制劑和毒劑，Topo Ⅱ催化抑制劑作用于Topo Ⅱ催化反應(yīng)的各個(gè)不同階段，抑制Topo Ⅱ的催化活性；而Topo Ⅱ毒劑能夠捕獲并穩(wěn)定Topo Ⅱ催化過(guò)程的中間產(chǎn)物——可切割復(fù)合物，造成DNA雙鏈斷裂[3]。例如，阿克拉霉素和依托泊苷作為T(mén)opo Ⅱ抑制劑應(yīng)用于臨床，但阿克拉霉素心臟毒性大，依托泊苷骨髓抑制作用較明顯。因此，尋找新型高效低毒的Topo Ⅱ抑制劑是目前迫切需要解決的問(wèn)題。

從天然植物中提取化合物進(jìn)行篩選和發(fā)掘，是開(kāi)發(fā)高效低毒抗癌藥物的重要途徑。如從羅漢果分離出的羅漢果醇被證明具有誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549 凋亡的作用[4]。二去水衛(wèi)矛醇(1,2:5,6-dianhydrogaIactitol, DAG)也是一種新型的植物生物堿類(lèi)抗腫瘤藥，屬己糖醇類(lèi)化合物，其化學(xué)名稱(chēng)為1,2,5,6-二脫水半乳糖醇。DAG是主產(chǎn)于廣西的衛(wèi)矛科植物蜜花美登木(Meytenusconfertiflotus)中分離出的衛(wèi)矛醇(dulcitol)為原料[5]，經(jīng)溴化、消除反應(yīng)而制得的1,6-二溴衛(wèi)矛醇的雙環(huán)氧化產(chǎn)物。其具有易溶于水，抗腫瘤活性高等優(yōu)點(diǎn)[6]。DAG目前已應(yīng)用于臨床，主要用于慢性粒細(xì)胞性白血病的治療[7]。DAG對(duì)惡性膠質(zhì)瘤也有療效，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床研究[8]。此外，DAG還對(duì)復(fù)發(fā)性腦瘤、胃癌、肝癌、鼻咽癌等均有抑制作用[9-10]。值得注意的是，DAG在臨床上也應(yīng)用于肺癌的治療，且療效明顯[11]。然而，DAG抗肺癌作用機(jī)制尚不清楚。據(jù)研究報(bào)道，DAG抗腫瘤的主要機(jī)制是直接結(jié)合到DNA或RNA上，從而影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[12]。然而，國(guó)內(nèi)外關(guān)于DAG與Topo Ⅱ相互作用的機(jī)制尚未報(bào)道。為此，本研究將探討DAG對(duì)肺癌細(xì)胞DNA Topo Ⅱ表達(dá)的影響，為DAG的臨床應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 DAG由廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司提供；依托泊苷(VP16)為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清為浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品；青霉素-鏈霉素為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；0.25%胰蛋白酶為美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；CCK-8為上海尚寶生物科技有限公司產(chǎn)品；Hoechst 33342為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ抗體為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；β-actin抗體和二抗均為美國(guó)CST公司產(chǎn)品。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞NCI-H460購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，所用培養(yǎng)基含有RPMI 1640培養(yǎng)基、10%(V/V)胎牛血清與1%(V/V)青霉素-鏈霉素，在37℃、5%(V/V)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma公司)；酶標(biāo)儀(香港分子儀器公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司) ；蛋白免疫印記系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)方法 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入5.0×103個(gè)細(xì)胞。設(shè)空白組、對(duì)照組和不同濃度的給藥組，待細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的藥物。藥物作用48 h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8 10 μL，在培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率。同時(shí)，以依托泊苷做為陽(yáng)性對(duì)照。使用Graphpad軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.2 集落形成實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入300個(gè)細(xì)胞。設(shè)空白對(duì)照組和不同濃度的給藥組，待細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的藥物。同時(shí)，以依托泊苷做為陽(yáng)性對(duì)照。藥物作用24 h后吸出培養(yǎng)基，同時(shí)加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后吸出培養(yǎng)基，用甲醇在-20℃條件下固定細(xì)胞30 min，加入結(jié)晶紫染色15 min， PBS清洗2次后，記錄每孔細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入3.0×105個(gè)細(xì)胞。設(shè)空白對(duì)照組和不同濃度的給藥組，24 h后，加入不同濃度的藥物。藥物作用24 h后吸出培養(yǎng)液，PBS清洗2次。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，并隨機(jī)拍照。

1.2.4 Hoechst 33342染色 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入3.0×105個(gè)細(xì)胞。設(shè)空白對(duì)照組和不同濃度的給藥組，細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的藥物。藥物作用48 h后吸出培養(yǎng)基，用PBS清洗1次，每孔加入PBS(含1 g·L-1Hoechst 33342)，在37℃培養(yǎng)箱中避光孵育10 min。用PBS清洗2次，在激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm的熒光顯微鏡下隨機(jī)拍照。

1.2.5 Western blot 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板，每孔加入3.0×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，設(shè)置空白對(duì)照組和不同濃度的給藥組，作用48 h。收集各組細(xì)胞，采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞后，離心收集上清。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，按每孔30 μg蛋白電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%(W/W)牛奶封閉后敷上Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ抗體，以β-actin作為內(nèi)參。孵完一抗后，室溫下孵育二抗1 h，接著用ECL顯影液曝光顯影。蛋白條帶應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行光密度值定量分析。

1.2.6 Real time PCR檢測(cè)Topo Ⅱ在肺癌NCI-H460細(xì)胞的表達(dá) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶加入1.0×106個(gè)細(xì)胞。設(shè)空白對(duì)照組和不同濃度的給藥組，待細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的藥物。藥物作用48 h后，按照TRIzol裂解液說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。取2 μg RNA做逆轉(zhuǎn)錄模板，按照說(shuō)明書(shū)合成cDNA。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。Topo Ⅱα上游序列：5′-TTGCAGCCCATTGGTCAGTT-3′，下游序列：5′-AGGACCACCCAGTACCGATT-3′。Topo Ⅱβ上游序列：5′-GTGCTGAGGGCATTGGTACT-3′，下游序列：5′-AGCAGCTTCTGCTTGTGCTA-3′。β-actin上游序列：5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGCC-3′,下游序列：5′-GCGTACAGGGATAGCACAGC-3′。 Real time PCR反應(yīng)體系為20 μL。應(yīng)用SYBR Green試劑盒，在ABI7300 Real time PCR 系統(tǒng)中進(jìn)行。

1.2.7 模擬分子對(duì)接 為了研究DAG與TOP Ⅱ的分子對(duì)接方式，我們運(yùn)用了Sybyl 8.0軟件(Tripos Inc.)中的Surflex-dock模塊。人Topo Ⅱα ATPase(PDB code: 1ZXM)的晶體結(jié)構(gòu)和Topo Ⅱβ(PDB code:3QX3)的晶體結(jié)構(gòu)是從蛋白數(shù)據(jù)Protein Data Bank(PDB)中獲得[13-14]。DAG、沙爾威辛和依托泊苷3D結(jié)構(gòu)的確定是根據(jù)其平面化學(xué)結(jié)構(gòu)和手性，并對(duì)其進(jìn)行能量最小化。采用自動(dòng)搜索模式，將沙爾威辛對(duì)接進(jìn)入Topo Ⅱα，依托泊苷對(duì)接進(jìn)入Topo Ⅱβ。利用分?jǐn)?shù)最高的結(jié)合模式做為最優(yōu)結(jié)合。按上述對(duì)接方法，將DAG對(duì)接入Topo Ⅱ結(jié)構(gòu)，以研究其與Topo Ⅱ的結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞增殖活力的影響 CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度DAG作用48 h后，NCI-H460細(xì)胞的OD值與對(duì)照組相比呈下降趨勢(shì)，且具有明顯濃度依賴(lài)性關(guān)系，其IC50為(9.68±1.02) mg·L-1，而陽(yáng)性對(duì)照依托泊苷的IC50為(5.19±0.53) mg·L-1。提示DAG具有明顯的體外抗肺癌活性，但其活性稍弱于依托泊苷。見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Cell viability of NCI-H460 cells treated with DAG and VP16 respectively

2.2 DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞克隆形成的影響 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DAG在處理24 h后撤除藥物繼續(xù)培養(yǎng)，依然能明顯地抑制NCI-H460細(xì)胞克隆團(tuán)的形成，并呈劑量依賴(lài)性，與陽(yáng)性藥依托泊苷效果類(lèi)似。上述結(jié)果表明DAG能持續(xù)抑制NCI-H460細(xì)胞的增殖。見(jiàn)Fig 2。

2.3 DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察，各給藥組細(xì)胞均不同程度出現(xiàn)細(xì)胞變圓縮小、貼壁能力減弱、胞質(zhì)內(nèi)顆粒邊緣化，甚至細(xì)胞破碎等損傷現(xiàn)象，隨著濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而空白組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞形態(tài)完整。見(jiàn)Fig 3。

Fig 2 The colony numbers of NCI-H460 cells treated with DAG and VP16 respectively

**P<0.01vscontrol

Fig 3 Morphological changes of NCI-H460 cells treated with DAG(×200)

A: Control group; B: DAG 2.5 mg·L-1; C: DAG 5.0 mg·L-1; D: DAG 10.0 mg·L-1. Scale bar: 50 μm

2.4 DAG 引起NCI-H460細(xì)胞核染色質(zhì)的變化 Hoechst 33342是一種可以穿過(guò)細(xì)胞膜與染色質(zhì)結(jié)合的藍(lán)色熒光染料。細(xì)胞染色后通過(guò)熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示正常未給藥組細(xì)胞內(nèi)熒光較弱，細(xì)胞核形態(tài)正常，DAG作用48 h后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨DAG濃度的提高明顯增強(qiáng)，并出現(xiàn)胞核形態(tài)異常，凝縮現(xiàn)象，提示DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞的DNA具有損傷作用。見(jiàn)Fig 4。

Fig 4 Morphological changes of nucleus induced by DAG in NCI-H460 cells (×200，stained with Hoechst 33342)

A: Control group; B: DAG 2.5 mg·L-1; C: DAG 5.0 mg·L-1; D: DAG 10.0 mg·L-1. Scale bar: 50 μm

2.5 DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞Topo Ⅱ mRNA的影響 Topo Ⅱ在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組過(guò)程中具有重要作用，當(dāng)Topo Ⅱ受到抑制時(shí)，可以導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂。為此，我們檢測(cè)了DAG對(duì)Topo Ⅱ mRNA的影響。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，不同濃度的DAG能明顯抑制Topo Ⅱα mRNA的表達(dá)。同樣，DAG也能抑制Topo Ⅱβ mRNA的表達(dá)，與空白組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上研究結(jié)果表明DAG對(duì)Topo Ⅱ的不同亞型的表達(dá)均具有明顯的抑制作用。見(jiàn)Fig 5。

2.6 DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞TOPO Ⅱ蛋白的影響 Topo Ⅱ mRNA的表達(dá)水平直接與蛋白表達(dá)水平有關(guān)。為了驗(yàn)證Topo Ⅱ mRNA受到抑制后蛋白表達(dá)水平是否也隨之降低，我們進(jìn)一步檢測(cè)了Topo Ⅱα和Topo Ⅱβ蛋白表達(dá)水平。Fig 6結(jié)果表明，不同濃度的DAG均能明顯降低Topo Ⅱα的表達(dá)水平。另外，DAG在5 mg·L-1和10 mg·L-1兩個(gè)濃度下能明顯抑制Topo Ⅱβ的表達(dá)，與mRNA的表達(dá)水平具有一定的一致性。以上研究結(jié)果提示DAG可抑制TopoⅡα和TopoⅡβ的蛋白表達(dá)。

Fig 5 Effects of DAG on mRNA expression of TopoⅡα,TopoⅡβ in NCI-H460 cells

**P<0.01vscontrol

2.7 Docking分析 為了進(jìn)一步研究DAG對(duì)Topo Ⅱ的影響，采用計(jì)算機(jī)分子模擬對(duì)接方法探討DAG與Topo Ⅱ是否具有相互作用，以及其作用方式和結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)接模型結(jié)果顯示，DAG與Topo Ⅱα之間形成了3個(gè)氫鍵，DAG的三元環(huán)中的氧原子與Topo Ⅱα 在120和121 2個(gè)色氨酸的殘基形成具有相互作用的氫鍵，3-C上的羥基與140位上的賴(lài)氨酸殘基也形成1個(gè)氫鍵。與陽(yáng)性藥沙爾威辛相比，140位上的賴(lài)氨酸殘基同樣被沙爾威辛占據(jù)，顯示DAG結(jié)合位點(diǎn)與沙爾威辛部分重合。DAG的1,2-環(huán)氧及3-C上的羥基與Topo Ⅱβ在52位上的精氨酸殘基形成2個(gè)氫鍵，此外，3-C上的羥基與1375位的氨基酸形成共軛與單原子相互作用，而這些位點(diǎn)同樣被依托泊苷占據(jù)，顯示DAG與Topo Ⅱβ 的結(jié)合占據(jù)依托泊苷與TopoⅡβ的結(jié)合位點(diǎn)。綜上所述，計(jì)算機(jī)分子模擬對(duì)接結(jié)果顯示，DAG與TopoⅡ的結(jié)合位點(diǎn)與沙爾威辛、依托泊苷部分重疊。如Fig 7所示。

Fig 6 Effects of DAG on protein expression of TopoⅡα,TopoⅡβ in NCI-H460 cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

3 討論

TopoⅡ在生物界普遍存在，是細(xì)胞內(nèi)一種重要的核酶，為生長(zhǎng)所必需。TopoⅡ分為α和β 2個(gè)亞型，可催化DNA 拓?fù)洚悩?gòu)化即超螺旋狀態(tài)和解螺旋狀態(tài)相互的轉(zhuǎn)換反應(yīng)，其功能由ATP提供能量，Mg2+也是必須的。TopoⅡ能識(shí)別特殊的DNA序列，并將雙鏈DNA選擇性切斷[15]。在許多腫瘤細(xì)胞中，TopoⅡ的含量及活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常組織的細(xì)胞，因此，TopoⅡ已成為抗腫瘤藥物研究中的重要靶點(diǎn)。TopoⅡ抑制劑可分為T(mén)opoⅡα抑制劑和TopoⅡβ抑制劑，目前這2種抑制劑的作用區(qū)別尚未清楚。TopoⅡ抑制劑通過(guò)影響TopoⅡ作用過(guò)程的各個(gè)階段來(lái)影響雙鏈DNA的斷裂和再連接反應(yīng)。它可以作用于DNA，也可以作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶，還可以作用于TopoⅡ-DNA可切割復(fù)合物，影響DNA復(fù)制過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。

Fig 7 Molecular docking of DAG with TopoⅡα and TopoⅡβ

A: The docking prediction of DAG bound to the TopoⅡα; B: The docking prediction of salvicine bound to the TopoⅡα; C: The docking prediction of DAG bound to the TopoⅡβ; D: The docking prediction of etoposide bound to the TopoⅡβ.

DAG對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞的研究中，經(jīng)不同濃度處理48 h后，CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)均表明DAG對(duì)肺癌NCI-H460細(xì)胞有明顯的抑制作用，且具有明顯的濃度依賴(lài)關(guān)系，其活性與陽(yáng)性藥依托泊苷接近，說(shuō)明DAG抗腫瘤活性明顯。DAG在15 mg·L-1濃度下可抑制大部分腫瘤細(xì)胞的增殖，提示該濃度是DAG較為合適的治療窗。Hoechst 33342實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NCI-H460細(xì)胞胞核出現(xiàn)明顯的破碎現(xiàn)象，提示DAG可引起DNA損傷，可能引起細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，DAG能明顯降低TopoⅡα、TopoⅡβ mRNA水平，并且隨著DAG濃度的增加，抑制作用逐步增加。與此相對(duì)應(yīng)的是，DAG也能抑制細(xì)胞內(nèi)TopoⅡα和TopoⅡβ的蛋白表達(dá)。為了更進(jìn)一步探討DAG與TopoⅡ之間是否具有直接的結(jié)合作用，通過(guò)分析人TopoⅡα ATPase晶體結(jié)構(gòu)及TopoⅡβ的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)DAG主要通過(guò)極性的氫鍵結(jié)合到TopoⅡ上，且與陽(yáng)性藥結(jié)合位點(diǎn)有部分重疊，說(shuō)明其與陽(yáng)性藥的結(jié)合區(qū)域相似，可能會(huì)導(dǎo)致TopoⅡ活性受到抑制。Levin等[12]以14C標(biāo)記DAG對(duì)3種鼠類(lèi)腦腫瘤的活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)DAG均可與RNA和DNA結(jié)合，且與RNA的結(jié)合能力為DNA的6倍。因此，DAG可能是通過(guò)與TopoⅡ mRNA結(jié)合，從而影響TopoⅡ蛋白的合成，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)DNA的斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另一方面，DAG也有可能和TopoⅡ直接結(jié)合，影響TopoⅡ的活性，從而導(dǎo)致DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到影響，進(jìn)而影響TopoⅡ mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，但是DAG的具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)完成，對(duì)參與實(shí)驗(yàn)的人員表示感謝！)

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Inhibitory effect of dianhydrogalactitol on DNA TopoⅡ in NCI-H460 cells

HUANG Yin-mei1, LIU Hua-gang2, SU Gui-yu3, LI Ying-jie4, WANG Xiao-jie1, JIANG Xia5

(1.PharmacyCollege,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2.GuangxiFoodandDrugAdministration,Nanning530022,China; 3.PharmacyCollege,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530001,China;4.InstituteofTraditionalChineseMedicineandNaturalProducts,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;5.DeptofClinicalPharmacy,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Aim To evaluate the antitumor activity of dianhydrogalactitol (DAG)invitro, and further clarify its underlying mechanisms. Methods The inhibitory effect of DAG in NCI-H460 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay. The morphology of cells treated with DAG was observed under optical microscope. Nuclear morphology was captured by fluorescence microscopy after Hoechst 33342 staining. Real-time PCR was used to analyze the expression level of topoisomerase Ⅱ (Topo Ⅱ) mRNA. The protein expression level of Topo Ⅱ was detected by Western blot. Additionally, molecular docking approaches were used to predict the interaction between DAG and Topo Ⅱ. Results DAG exhibited potent antitumor activity in NCI-H460 cells, and inhibited cell proliferation persistently. DAG obviously induced nuclear morphological changes of NCI-H460 cells. Furthermore, DAG could down-regulate the mRNA and protein expression level of Topo Ⅱ detected by Real-time PCR analysis and Western blot, respectively. Molecular docking predicted that DAG could bind to Topo Ⅱ. Conclusion DAG can significantly inhibit the proliferation of NCI-H460 cells, and its underlying mechanisms may involve the down-regulation of Topo Ⅱ mRNA and direct binding to Topo Ⅱ, leading to cancer cell death.

dianhydrogalactitol; lung cancer; NCI-H460 cell; Topo Ⅱ; Topo Ⅱ inhibitor; molecular docking

2016-07-14,

2016-08-19

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(No 桂科能12237007)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2015GXNSFAA139194)

黃銀妹(1990-)，女，碩士生，研究方向：藥物抗腫瘤，E-mail:492499884@qq.com；

蔣 霞(1974-)，女，博士生，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥物抗腫瘤、臨床藥學(xué)與中藥藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:47240986@qq.com

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.046.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.023

A

1001-1978(2016)11-1601-07

R282.71；R329.24；R734.202.2；R977.3；R979.1

結(jié)果 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，DAG對(duì)NCI-H460細(xì)胞的體外抗腫瘤活性明顯。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DAG能持續(xù)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Hoechst 33342檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生明顯改變。Real time PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示Topo Ⅱ mRNA和蛋白表達(dá)量降低。計(jì)算機(jī)模擬分子對(duì)接顯示DAG與Topo Ⅱ有相互結(jié)合作用。結(jié)論 DAG能明顯抑制NCI-H460細(xì)胞的增值，作用機(jī)制研究表明DAG能降低Topo Ⅱ mRNA和蛋白水平，并與Topo Ⅱ結(jié)合，最終可能導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，引起細(xì)胞死亡。