莫思燕,韋明中,邱金慧,朱勛帥,劉 林,林 軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

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莫思燕,韋明中,邱金慧,朱勛帥,劉 林,林 軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

目的 基于高遷移率族蛋白B1(HMGB1)探討老鼠簕生物堿A(HBOA) 抗大鼠肝纖維化的作用機(jī)制。方法 采用四氯化碳(CCl4)橄欖油溶液灌胃12周，建立大鼠肝纖維化模型。第8周確定建模成功后，將其隨機(jī)分為模型對(duì)照組、秋水仙堿組、HBOA高劑量組、HBOA低劑量組，從第9周起，相應(yīng)藥物干預(yù)4周后，取肝組織切片行HE染色及Masson染色；測(cè)定血清中ALT、AST、T-BIL、HMGB1、IL-1β、TNF-α 的含量；免疫組化法檢測(cè)肝組織中HMGB1 蛋白的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定肝組織中HMGB1 mRNA表達(dá)量。結(jié)果 與模型對(duì)照組相比，HBOA 高、低劑量均明顯減輕CCl4所致肝組織病變程度，降低血清中ALT、AST、T-BIL、HMGB1、 IL-1β、TNF-α含量，減少肝組織中HMGB1蛋白及 mRNA 表達(dá)，且血清HMGB1水平與IL-1β、TNF-α、ALT、AST、T-BIL呈正相關(guān)。結(jié)論 HBOA對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有一定的改善，其作用機(jī)制可能與降低致炎因子HMGB1有關(guān)。

高遷移率族蛋白 B1；老鼠簕生物堿A；肝纖維化；CCl4；炎癥因子；大鼠老鼠簕(AcanthusilicifoliusL.)是爵床科老鼠簕屬的植物，為重要藥用紅樹林植物，我國(guó)民間主要用于治療急慢性肝炎、淋巴結(jié)腫脹、肝脾腫大、胃痛、咳嗽、哮喘等[1]。本課題組前期研究表明，老鼠簕藥理活性成分主要為老鼠簕生物堿，具有保肝作用[2]。其中，老鼠簕生物堿A[4-羥基苯并噁唑-2-酮，英文名4-hydroxy-2(3H)-benzoxazolone，簡(jiǎn)稱HBOA]是老鼠簕生物堿中的1個(gè)活性單體。

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝硬化發(fā)生的前奏和必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)，是慢性肝病的重要病理特征，也是臨床治療慢性肝病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究證實(shí)，慢性炎癥反應(yīng)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素[3]。近年來(lái)，人們對(duì)細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中的作用有了較深入的研究，高遷移率族蛋白 B1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種晚期致炎因子，可能參與了多種組織器官如肺、肝的纖維化進(jìn)程[4]。由于其具有作用持久的特點(diǎn)，針對(duì)HMGB1的治療比其他早期炎癥因子具有更寬泛的治療窗口期。所以，以HMGB1為靶點(diǎn)的抗炎治療引起人們的極大興趣[5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，檢測(cè)大鼠血清及肝組織中HMGB1的含量，觀察大鼠肝組織病理學(xué)及血清肝功能指標(biāo)、早期炎癥因子的變化，并探索其中的內(nèi)在聯(lián)系，初步探討老鼠簕生物堿A基于HMGB1 抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物與試劑 HBOA 由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室合成，純度為0.9937；秋水仙堿購(gòu)于西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)：140515)；CCl4、羧甲基纖維素鈉購(gòu)于西隴化工股份有限公司；ALT、AST及T-BIL試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；大鼠HMGB1、IL-1β及TNF-α ELISA 試劑盒、HMGB1兔多克隆抗體、兔IgG-免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；引物、RNAiso Plus、Prime Script RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購(gòu)于日本TaKaRa公司。

1.1.2 儀器 TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)(上海安享科學(xué)儀器廠)；電熱恒溫水浴箱(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；ND-2010 型紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀(香港分子儀器公司)；CX-41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.1.3 動(dòng)物 SD大鼠，60只，♂，180 g～220 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK桂 2015-0002，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK桂 2011-0005)。于室溫(23±2)℃、濕度(60±20)%、標(biāo)準(zhǔn)光線環(huán)境下飼以我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的專業(yè)飼料，飼養(yǎng)期間大鼠均自由攝食、飲水。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與干預(yù) 60只SD大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，其中50只大鼠灌胃予以體積分?jǐn)?shù)為0.40的CCl4橄欖油溶液3 mL·kg-1建立肝纖維化模型，首劑加倍，每周2次，共12周。剩余10只大鼠設(shè)為正常對(duì)照組，僅灌胃相應(yīng)體積生理鹽水。第8周，取10只模型對(duì)照組大鼠HE 染色病理檢測(cè)結(jié)果證實(shí)大鼠肝纖維化模型成立后，將大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(MC)、秋水仙堿組(Colchicine)、HBOA 高劑量組(HH)、HBOA 低劑量組(HL)，每組各10只，以及正常對(duì)照組(NC)10只。從第9周開始，秋水仙堿組灌胃給予秋水仙堿混懸液(0.4 mg·kg-1)；HBOA高劑量組(100 mg·kg-1)、HBOA 低劑量組(50 mg·kg-1)灌胃予以質(zhì)量濃度為6 g·L-1的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成的HBOA混懸液(溶液現(xiàn)配現(xiàn)用)；模型對(duì)照組及正常對(duì)照組灌胃給予相應(yīng)體積CMC-Na 溶液10 mL·kg-1，連續(xù)4周。

1.2.2 取材 12周后，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈抽血，經(jīng)3 000 r·min-1離心10 min后，分離血清于-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)取相同部位肝左葉約1 cm×1 cm 大小，用10%的福爾馬林固定，石蠟包埋切片，病理切片行常規(guī)HE及Masson染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。將部分肝組織用4%的多聚甲醛保存，用于制作免疫組化切片，其余肝臟置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 血清觀察指標(biāo) 肝功能指標(biāo) ALT、AST、T-BIL嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書指示方法檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中HMGB1、IL-1β、TNF-α 的水平。

1.2.4 大鼠肝組織中HMGB1蛋白及mRNA表達(dá)分析 采用免疫組化SP法測(cè)定肝組織中HMGB1蛋白的表達(dá)，脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、封閉、滴加一抗及二抗、染色均嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟操作。采用自來(lái)水浸泡10 min返藍(lán)后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。采用Image-Pro Plus軟件分析免疫組化圖片光密度(IOD)值。 根據(jù)Genbank大鼠HMGB1、GAPDH引物序列設(shè)計(jì)HMGB1及GAPDH的上、下游引物(Tab 1)。嚴(yán)格根據(jù)RNAiso Plus 試劑盒說(shuō)明書提取大鼠肝臟總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，A260/280均為1.8～2.0，純度符合要求。通過(guò)RNA 20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系，在37 ℃15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃條件下逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用兩步法：95℃ 30 s預(yù)變性；95 ℃ 5 s變性、60 ℃ 31 s退火， 共40個(gè)循環(huán)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。

Tab 1 Primer sequences of HMGB1 and GAPDH

2 結(jié)果

2.1 肝組織病理學(xué)變化 HE染色結(jié)果可見,正常對(duì)照組肝小葉的結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列整齊，肝索結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(Fig 1A)；模型對(duì)照組可見肝小葉被破壞，肝細(xì)胞結(jié)節(jié)、脂肪變性、氣球樣變性及壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索排列紊亂，伴肝纖維化(Fig 1B)；秋水仙堿組及HBOA高、低劑量組對(duì)纖維組織增生情況均有明顯的改善，肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)已恢復(fù)至正常，肝細(xì)胞變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度也明顯減少(Fig 1C、Fig 1D、Fig 1E)。Masson染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞完整，僅于匯管區(qū)及中央靜脈有少量膠原纖維存在,無(wú)纖維組織增生(Fig 2A); 模型對(duì)照組大鼠肝組織中大量膠原纖維增生，匯管區(qū)呈明顯的橋樣纖維化，并向肝小葉內(nèi)延伸，形成較粗大的纖維間隔(Fig 2B)；秋水仙堿組及 HBOA 高、低劑量組大鼠肝組織中膠原纖維增生較模型對(duì)照組明顯減少，僅分布于匯管區(qū)及血管周圍，且纖維間隔薄，不完全分割肝小葉，其中HBOA 高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)趨向正常(Fig 2C、2D、 2E)。 各組大鼠肝纖維化程度按Ishak 評(píng)分系統(tǒng)分期及計(jì)分。分期結(jié)果顯示，模型對(duì)照組主要分布在F4-F5期，秋水仙堿組主要分布在F2-F3期，HBOA高劑量組分布在F0-F1期，HBOA低劑量組主要分布在F2-F4期(Tab 2)。

2.2 HBOA降低CCl4性肝纖維化大鼠血清中的AST、ALT 及T-BIL 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清中的AST、ALT 及T-BIL含量明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，HBOA 高劑量組可降低血清中的AST、ALT 及T-BIL 水平(P<0.01)(Fig 3)。

Fig 1 Rat liver histopathological changes observed by HE staining in different groups(×100)

Fig 2 Changes of rat liver tissue collagen observed by Masson staining in different groups(×100)

GroupDose/mg·kg-1nStageofliverfibrosis0123456Scoreofliverfibrosis(x±s)Normal-10100000001.10±1.52Model-8000133113.25±3.24**Colchicine0.4901331108.11±3.44##HBOA1001043111004.80±4.05##50801322008.13±3.52##

**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel

2.3 HBOA 降低CCl4性肝纖維化大鼠血清中的炎癥因子含量 由ELISA結(jié)果可見，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清中的HMGB1、IL-1β及TNF-α含量明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，HBOA高劑量組明顯降低血清中的HMGB1、IL-1β及TNF-α水平(P<0.01)(Fig 4)。

2.4 HBOA減少CCl4性肝纖維化大鼠肝組織中HMGB1蛋白及mRNA的表達(dá) 免疫組化法結(jié)果可見(Fig 5A)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肝組織中的HMGB1 含量明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，HBOA高、低劑量組均明顯降低肝組織中的HMGB1水平(P<0.01)。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果可見(Fig 5B)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肝組織中HMGB1 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，HBOA高、低劑量組均明顯降低肝組織中的HMGB1 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)。

3 討論

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮核心作用，其活化調(diào)控被視為抗肝纖維化的治療靶標(biāo)[6]。當(dāng)肝臟受到各種急、慢性炎癥刺激后，可激活HSCs，使其變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，最終合成及分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積于肝臟內(nèi)，啟動(dòng)肝纖維化的病理過(guò)程[7]?？梢?，慢性炎癥反應(yīng)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

炎癥因子HMGB1是一種高度保守的染色體相關(guān)蛋白，具有出現(xiàn)晚、作用持久的特點(diǎn)。在正常情況下，HMGB1在細(xì)胞核內(nèi)不參與炎癥反應(yīng)。然而，當(dāng)機(jī)體受到刺激而產(chǎn)生反應(yīng)時(shí)，HMGB1不僅可由激活的巨噬細(xì)胞、成熟的樹突細(xì)胞(mDC)及自然殺傷(NK)細(xì)胞主動(dòng)分泌，還可由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放至細(xì)胞外，在胞外作為損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)成員之一，具有強(qiáng)大的致炎細(xì)胞因子活性，在細(xì)胞外參與多種病理過(guò)程[8]。在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中，HMGB1作為晚期炎癥介質(zhì)，成為慢性炎癥持續(xù)存在并持久激活HSCs的基礎(chǔ)。HMGB1可通過(guò)晚期糖基化受體(RAGE)及 Toll 樣受體(TLRs)啟動(dòng)和增強(qiáng)多個(gè)通路[9-10]，如 TLR4-MyD88-NF-κB 通路，激活內(nèi)皮細(xì)胞，促使其產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α 等，而產(chǎn)生的IL-1β、TNF-α 又可與HMGB1相互刺激、促進(jìn)，致使HMGB1 大量釋放，最終形成一個(gè)完整的回路，引起瀑布樣的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成炎癥反應(yīng)的失控遷延，增強(qiáng)肝臟損傷和炎癥[11]。

Fig 3 Effects of HBOA on serum AST,ALT and T-BIL in CCl4-induced liver fibrosis rats

A: AST; B: ALT; C: T-BIL.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsmodel control

Fig 4 Effects of HBOA on serum HMGB1,IL-1β and TNF-α in CCl4-induced liver fibrosis rats

A:HMGB1;B:IL-1β;C:TNF-α.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsmodel control

Bai等[12]發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1 能降低IL-1β、TNF-α 的表達(dá)，減輕肝臟炎性反應(yīng)，減輕肝纖維化程度。然而，僅給予早期炎癥因子例如IL-1β、TNF-α 的拮抗劑，并不能阻止肝纖維化病情進(jìn)展[13]。所以，考慮是否是HMGB1的大量釋放，導(dǎo)致HSCs持續(xù)激活，致使ECM 堆積，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。

Fig 5 Effect of HBOA on tissue expression of HMGB1 protein and mRNA in CCl4-induced liver fibrosis rats

A:HMGB1 protein; B: HMGB1 mRNA.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsmodel control

綜上所述，HBOA能夠減輕CCl4所致大鼠肝纖維化程度，其作用機(jī)制可能與抑制晚期炎癥因子HMGB1表達(dá)有關(guān)。最終通過(guò)上游通路減少其他炎癥因子IL-1β 、TNF-α 等的釋放，又通過(guò)下游通路減少細(xì)胞損傷引起的肝細(xì)胞凋亡、壞死及巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活而產(chǎn)生HMGB1，降低炎癥反應(yīng)，從而減少HSC活化，抑制ECM產(chǎn)生，最終減輕肝纖維化程度。然而，其具體的分子生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

Fig 6 Relation between serum HMGB1 level and liver function，inflammatory cytokines

A: The relation of HMGB1 to liver function index; B: The relation of HMGB1 to IL-1β and TNF-α

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成。感謝實(shí)驗(yàn)室老師們?cè)趯?shí)驗(yàn)期間的幫助。)

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Anti-hepatic fibrotic mechanism ofAcanthusilicifoliusalkaloid A involved in high mobility group box 1

MO Si-yan, WEI Ming-zhong, QIU Jin-hui, ZHU Xun-shuai, LIU Lin, LIN Jun

(DeptofPharmacology，SchoolofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Aim To investigate anti-hepatic fibrotic mechanism ofAcanthusilicifoliusalkaloid A(HBOA)involved in high mobility group box 1(HMGB1).Methods A hepatic fibrosis model of rat was established by the olive oil of CCl4for 12 weeks. Then, at the 8th week,the successful model rats were randomly divided into model control group,colchicine group, HBOA high-dose group and HBOA low-dose group. From the 9th week,the rats in each group were treated with the drugs daily for 4 weeks respectively. The changes of liver histopathology and collagen were observed by HE staining and Masson staining, and the serum indicators including aspartate aminotransferase(AST),alanine aminotransferase(ALT) , total bilirubin(T-BIL), HMGB1,interleukin-1β(IL-1β) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were determined. Moreover, the protein of HMGB1 in liver was examined by immunohistochemistry, and the expression of HMGB1 mRNA was measured by real-time fluorescence quantitative PCR.Results Compared with the model control group，HBOA high-dose and HBOA low-dose groups significantly attenuated the fibrotic degree induced by CCl4, markedly decreased the levels of ALT,AST,T-BIL, HMGB1, IL-1β,TNF-α. Moreover, the expression of HMGB1 protein and mRNA in liver was decreased. And furthermore, serum HMGB1 level had significant positive correlation with IL-1β,TNF-α,ALT,AST and T-BIL.Conclusion HBOA has beneficial effects against liver fibrosis in rat which is induced by CCl4, the mechanisms may be related to the inhibition of inflammatory response to HMGB1.

high mobility group box 1;Acanthusilicifoliusalkaloid A; hepatic fibrosis; CCl4; inflammatory factor;rat

2016-07-14，

2016-08-13

廣西高校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No 201106LX095)；廣西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2013YB054)

莫思燕(1988-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail:d-v-wade2007@163.com；

林 軍(1962-)，男，博士，教授，研究方向：中藥藥理學(xué)，通訊作者，Tel:0771-5358272,E-mail: junlin989@sina.com

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.030.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.015

A

1001-1978(2016)11-1553-06

R-332；R322.47；R392.12；R575.2；R977.6