李魯 張春陽 崔陽 (包頭醫(yī)學院; 包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科, 內蒙古 包頭 04000)

未發(fā)育成熟顱骨缺損后不同時期骨痂組織中骨橋蛋白的表達變化

李魯1張春陽2*崔陽1
(1包頭醫(yī)學院;2包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經外科, 內蒙古 包頭 014000)

顱骨缺損; 骨橋蛋白

骨橋蛋白(osteopontin, OPN)是一種分泌型酸化糖蛋白，帶負電荷，具有親水性，富含唾液酸。人的OPN基因由7個外顯子和6個內含子組成，定位于4q13上[1]。不同物種的OPN具有不同的結構序列，但是不同物種的OPN均含有相同的高度保守序列，該序列是促進細胞粘附的蛋白質中的特有結構。OPN是重要的細胞外基質蛋白，也是重要的細胞因子，在介導細胞擴散、轉移，與基質間的黏附、骨組織礦化和重建、血管形成、抑制凋亡、免疫調節(jié)、信號轉導等過程中發(fā)揮著重要作用[2]。在未發(fā)育成熟顱骨缺損的愈合過程中，骨橋蛋白可能通過促進骨基質的形成而促進顱骨缺損的愈合。本實驗通過研究以未發(fā)育成熟山羊(3個月齡)為研究對象，通過實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, q-RT-PCR)方法觀察骨橋蛋白信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)在顱骨缺損創(chuàng)緣愈合的不同時期基因表達情況，進而尋找骨橋蛋白在未發(fā)育成熟顱骨缺損愈合過程中發(fā)揮重要作用的證據，為進一步研究骨橋蛋白促進未發(fā)育成熟顱骨缺損愈合的作用機制打下基礎。

一、材料與方法

1.動物模型的建立：3個月齡的母山羊12只，體重(24.6±2.1)kg ，隨機分實驗組與對照組，各組6只。實驗組頭頂部皮膚脫毛，安爾碘消毒3遍。2%利多卡因5 ml頭皮局部浸潤麻醉。取中線向左側旁2 cm直切口，切口長約5 cm。依次切開皮膚、皮下組織、骨膜，嚴密止血，鈍性推開骨膜。骨鉆鉆孔，并擴大骨窗至3 cm×3 cm，保留硬腦膜完整(圖1)。生理鹽水沖洗術腔至沖洗水清亮。逐層縫合皮下組織、皮膚，包扎固定。對照組顱骨不予特殊處理。分別于術后3 d、7 d、14 d、21 d、30 d對實驗組與對照組顱骨取材。

2.組織處理：脫毛、消毒。切口頭皮。實驗組：咬骨鉗咬取骨緣新生骨痂組織。對照組：咬骨鉗咬取相同部位顱骨組織。每次咬取骨痂部位無重復。所得骨痂組織、骨組織液氮中保存。

3.提取實驗組骨痂組織與對照組骨組織總核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)：取出保存的骨痂組織、骨組織，稱重。置于液氮預冷后的研缽中研磨成粉末狀。收集骨粉于離心管中，加入1 ml Trizol，搖晃振蕩2 min，室溫靜置5 min。加入氯仿200 μl，搖晃振蕩1 min，靜置5 min。4℃、12 000 r/min，離心15 min。經離心管中上層水相移至另一離心管中，加入異丙醇0.5 ml。室溫靜置10 min。4℃、12 000 r/min，離心10 min。棄上清，加入75%的乙醇1 ml，振蕩混勻，20℃靜置15 min。4℃、7 500 r/min，離心5 min，棄上清。自然干燥RNA沉淀30 min。加入200 μl焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate, DEPC)水溶解RNA沉淀，振蕩混勻，65℃加熱15 min。所得RNA保存于-20℃冰箱。

4.RNA濃度及純度測定：分別取骨痂組織、骨組織RNA樣品2 μl，加入98 μl體積分數0.1%DEPC水，稀釋50倍后用紫外分光光度計測量其濃度、A260/A280 值、A260/A230 值。

5.逆轉錄生成單鏈脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid, cDNA)：依據第一鏈cDNA合成試劑盒(美國賽默飛)操作，依次加入：總RNA 3.024 μg、多聚胸腺嘧啶T重復寡核苷酸2 μl、脫氧核糖核苷三磷酸(2.5 mM) 2 μl，加入無酶水至14.5 μl，混勻后冰上靜置5 min，依次加入5×反轉錄緩沖液4 μl、核糖核酸酶抑制劑0.5 μl、莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶1 μl，加入無酶水至20 μl。42℃、60 min，90℃、5 min終止反應。

6.q-RT-PCR：依據q-RT-PCR試劑盒(美國賽默飛)操作。配制 20 μl q-RT-PCR反應體系：2×濃縮的聚合酶鏈式反應擴增預混液l0 μl，正向引物l ul，反向引物l ul，模板脫氧核糖核酸100 ng，無酶水加至20l μl。q-RT-PCR反應程序：95℃預變性l0 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

7.統(tǒng)計分析：各時間點顱骨標本q-RT-PCR重復3次，每時間點每組3個樣本。應用2-ΔΔCt法對q-RT-PCR數據進行轉換。所有數據均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用雙因素方差分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。利用GraphPad Prism 5繪制圖表(圖2)。

圖1 山羊顱骨缺損模型，大小約3 cm×3 cm(箭頭所示)

圖2 不同時間點實驗組與對照組OPN mRNA表達水平比較

aP<0.001,vs對照組3 d及7 d;bP<0.05,vs對照組 7 d;cP<0.001,vs對照組7 d

Note: C: 對照組; T: 實驗組

二、結果

山羊顱骨缺損形成14 d后OPN在創(chuàng)緣新生骨痂組織中的mRNA表達高于正常骨組織(圖2,aP<0.001)。顱骨缺損形成后14 d時創(chuàng)緣處新生骨痂組織內OPN mRNA表達明顯高于7 d時(圖2,bP<0.05)，至21 d時達最高峰(圖2,aP<0.001)，30 d時OPN mRNA的表達較前有所下降，但仍維持在較高水平(圖2,aP<0.001)。

三、討論

OPN是一種骨特異性的分泌型蛋白，帶有負電荷，在各種組織中均有表達，生理情況下，主要表達于骨和上皮細胞表面[3]。在成骨細胞的增值、分化和骨的重建及礦化過程中發(fā)揮重要作用。顱蓋骨主要為膜形成骨。有原位雜交和免疫組化實驗表明，OPN在鼠顱蓋骨中代表骨形成活動活躍的骨外膜立方形成骨細胞中有表達，并且在代表骨重建活躍的骨內膜扁平形成骨細胞中也有表達[4]。在骨折愈合過程中，表達OPN的成骨細胞逐漸增多，骨橋蛋白的表達與成骨細胞成熟程度相一致[5]。研究發(fā)現，敲除OPN基因的小鼠骨抵抗損傷的能力明顯下降[6]。不僅如此OPN在骨折的礦化過程中仍發(fā)揮重要作用。OPN含有的RGD序列和多元氨基酸結構域被認為與羥基磷灰石的晶核化有關[7]。在體外實驗表明OPN磷酸化后可抑制羥基磷灰石晶體形成[8]，而體內的實驗表明OPN在骨基質的礦化過程中，主要通過影響骨基質的礦化的速率實現，而并不影響羥基磷灰石的結晶生長成核[9]。本實驗通過對山羊顱骨缺損不同時期顱骨創(chuàng)緣骨痂組織OPN的表達變化研究，證實了在顱骨創(chuàng)緣愈合期，創(chuàng)緣新生骨痂組織中OPN的表達高于正常骨組織。證實OPN參與了顱骨缺損的自身修復過程，而對于其作用機理仍需要進一步研究。明確OPN在顱骨缺損創(chuàng)緣骨形成過程中的作用，探明這一過程中OPN的作用機制，有助于豐富神經外科臨床中顱骨缺損修復的理論，為解決兒童顱骨缺損的修復提供更多的途徑。

1茅文斌, 邵增務. 骨橋蛋白與骨質疏松癥研究進展 [J]. 中國骨質疏松雜志, 2007, 13(3): 204-207.

3Yokosaki Y, Higashikawa F. Osteopontin receptors and signal transduction [J]. Nihon Rinsho, 2005, 63 (Suppl 10): 613-617.

4Yokosaki Y, Tanaka K, Higashikawa F, et al. Distinct structural requirements for binding of the integrins alphavbeta6, alphavbeta3, alphavbeta5, alpha5beta1 and alpha9beta1 to osteopontin [J]. Matrix Biol, 2005, 24(6): 418-427.

5張偉國, 王英. 鼠顱面部礦化組織發(fā)育中非膠原蛋白的表達 [J]. 口腔頜面外科雜志, 1998, 8(3): 190-194.

6Thurner PJ, Chen CG, Ionova-Martin S, et al. Osteopontin de-ficiency increases bone fragility but preserves bone mass [J]. Bone, 2010, 46(6): 1564-1573.

7Zhang B, Sun Y, Chen L, et al. Expression and distribution of SIBLING proteins in the predentin/dentin and mandible of hyp mice [J]. Oral Dis, 2010, 16(5): 453-464.

8Huang W, Carlsen B, Rudkin G, et al. Osteopontin is a negative regulator of proliferation and differentiation in MC3T3-E1 pre-osteoblastic cells [J]. Bone, 2004, 34(5): 799-808.

9Chiang TI, Chang IC, Lee HS, et al. Osteopontin regulates anabolic effect in human menopausal osteoporosis with intermittent parathyroid hormone treatment [J]. Osteoporos Int, 2011, 22(2): 577-585.

1671-2897(2016)15-171-02

·簡報·

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李魯，碩士研究生，主治醫(yī)師，E-mail: swdalu@163.com

*通訊作者：張春陽，教授、主任醫(yī)師，碩士生導師，E-mail: 445843578@qq.com

10.7666/d.y1709707.

2015-11-03；

2015-12-26)