繩金房，楊曉莉，李 輝

(陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710065)

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陜西省12種中藥飲片微生物污染調(diào)查及風(fēng)險評估

繩金房，楊曉莉，李 輝

(陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，西安 710065)

目的 調(diào)查陜西省12種常見中藥飲片的微生物污染狀況，并評估其潛在風(fēng)險。方法 按照《中國藥典》2015年版和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》方法對金銀花等12種中藥飲片進(jìn)行需氧菌總數(shù)(TAMC)、霉菌和酵母菌總數(shù)(TYMC)、耐熱菌數(shù)及控制菌檢查。結(jié)果 中藥飲片TAMC>104cfu·g-1的為70%(84/120)，TYMC>102cfu·g-1的為65%(78/120)，耐熱菌數(shù)>102cfu·g-1的為49.2%(59/120)，預(yù)培養(yǎng)處理有助于耐膽鹽革蘭陰性菌的檢出，為75.0%(90/120)，大腸埃希菌的檢出率為3.33%，銅綠假單胞菌的檢出率為7.5%。結(jié)論 中藥飲片微生物污染情況比較嚴(yán)重，衛(wèi)生質(zhì)量亟待提高，應(yīng)建立合理的微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

中藥飲片；微生物污染；大腸埃希菌；銅綠假單胞菌；風(fēng)險評估

中藥飲片是中醫(yī)藥的重要特色和優(yōu)勢之一，目前其質(zhì)量控制是中藥質(zhì)量控制的薄弱環(huán)節(jié)[1]，中藥飲片既是生產(chǎn)中成藥的原料，也可以經(jīng)過煎煮等簡單處理直接用于患者。如何在中藥的發(fā)展過程中形成獨(dú)特的微生物限度質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，既能有效地保證藥品的安全性，又可以避免企業(yè)采用過度輻射滅菌的方法使其符合質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，是目前面臨的最大挑戰(zhàn)[2]。目前美國藥典(USP38)、歐洲藥典(EP8.0)和日本藥局方(JP16)均收載了中藥飲片的微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[3-5]，《中國藥典》2015年版四部通則1 107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)亦首次收載了中藥飲片的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)[6]，但僅對研粉口服用貴細(xì)飲片、直接口服及泡服飲片要求不得檢出沙門菌(10g)，耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)少于104(1g)，而對其他中藥飲片及指標(biāo)未作規(guī)定。

本文對陜西省不同區(qū)域、不同炮制方式、不同品種和不同來源的金銀花、百合、龍骨、合歡皮、白術(shù)、煅牡蠣、夏枯草、鴉膽子、重樓、姜黃、穿心蓮和海螵蛸等12個品種共120批中藥飲片進(jìn)行污染微生物的調(diào)查研究，以上品種均為常用口服兼外用中藥飲片，除龍骨因中藥資源保護(hù)未收載外，其余品種均收載于《中國藥典》2015年版一部。按照《中國藥典》2015年版及食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)要求對需氧菌總數(shù)(TAMC)、霉菌和酵母菌總數(shù)(TYMC)、耐熱菌和控制菌進(jìn)行檢驗(yàn)[7-8]，基本掌握了12種常用中藥飲片的微生物污染現(xiàn)狀，了解中藥飲片潛在的微生物安全風(fēng)險，為中藥飲片的微生物污染風(fēng)險評估和微生物質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器HFsafe-1200LC型生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；SHA-C型水浴恒溫振蕩器(北京中興偉興儀器有限公司)；LRH-250F生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；LRH-250F霉菌培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；LRH-150B生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)；DK-98-1恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器公司)；VITEK2全自動微生物鑒定系統(tǒng)(法國梅里埃有限公司)；OLYMPUS.CH型三目顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；渦旋混合器(常州國華電器有限公司)。

1.2 試藥 樣品覆蓋西安、榆林、商洛、銅川和漢中，涉及生產(chǎn)企業(yè)、零售藥店、醫(yī)院藥房和藥材批發(fā)市場，見表1。

表1 中藥飲片采集信息

Tab.1SamplinginformationofChineseherbalmedicines

序號品種性狀數(shù)量/批炮制方式包裝1金銀花花10凈制袋裝/散裝2合歡皮皮10切制袋裝/散裝3海螵鞘動物10掰塊袋裝/散裝4夏枯草全草10凈制袋裝/散裝5姜黃根10切制袋裝/散裝6百合花10切絲袋裝/散裝7重樓根10切制袋裝/散裝8白術(shù)根10切制袋裝/散裝9穿心蓮莖葉10切制袋裝/散裝10鴉膽子果實(shí)種子10凈制袋裝/散裝11龍骨動物10打碎袋裝/散裝12牡蠣動物10煅制袋裝/散裝

1.3 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)等培養(yǎng)基適用性檢查均符合《中國藥典》2015年版和食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB4789.28-2013的規(guī)定。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液的制備 稱取25g樣品，加入pH值為7.0的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液225mL，振蕩10min，制成1/10供試品溶液。

2.2TAMC、TYMC和耐熱菌的測定方法 取1/10供試品溶液及5個連續(xù)10倍稀釋級，以TSA傾注法(1mL/皿)測定TAMC；取1/10供試品溶液及3個連續(xù)10倍稀釋級以SDA(培養(yǎng)基中含慶大霉素活性成分最終質(zhì)量濃度0.1g·L-1)傾注法(1mL/皿)測定TYMC，另取1/10供試品溶液經(jīng)100 ℃水浴處理30min后，按照上述TAMC計數(shù)方法測定耐熱菌數(shù)。

2.3 控制菌檢查 按照《中國藥典》2015年版四部通則1106要求，分別檢查耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌和白色假絲酵母菌。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行志賀氏菌和溶血性鏈球菌檢查。耐膽鹽革蘭陰性菌定性實(shí)驗(yàn)陽性結(jié)果的樣品，重新取供試品，剪碎，加TSB，浸泡，振搖，制成1/10的供試品溶液，按照定量實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確定量，并平行比較TSB預(yù)培養(yǎng)2h和不預(yù)培養(yǎng)直接測定耐膽鹽革蘭陰性菌定量結(jié)果的差異。

2.4 菌落鑒定 對實(shí)驗(yàn)中分離得到的疑似菌落進(jìn)行分離純化和顯微鑒別，并進(jìn)行VITEK2全自動微生物系統(tǒng)的分析、鑒定，以確證污染菌的種類及名稱。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)對數(shù)轉(zhuǎn)換，規(guī)定計數(shù)實(shí)驗(yàn)中TAMC或TYMC>107cfu·g-1，對數(shù)值計為7.0；TYMC或耐熱菌數(shù)<10cfu·g-1，對數(shù)值計為0.5；耐膽鹽革蘭陰性菌N>105，對數(shù)值計為5.0；N<10，對數(shù)值計為0.5。定量結(jié)果采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，對定性結(jié)果歸納分析。

3.1 微生物計數(shù)結(jié)果 見表2。

表2 12種中藥飲片平均染菌量對數(shù)轉(zhuǎn)換結(jié)果

Tab.2Theaveragemicrobialcontaminationlogarithmconversionresultsof12kindsofChineseherbalmedicines

名稱TAMCTYMC耐熱菌耐膽鹽革蘭陰性菌未預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)2h金銀花3.521.771.201.551.70合歡皮5.772.851.863.603.55海螵鞘6.213.793.062.103.35夏枯草6.323.552.224.754.70姜黃4.472.452.160.802.15百合3.772.161.550.701.20重樓5.253.171.863.303.45白術(shù)3.341.711.400.600.80穿心蓮5.573.313.013.554.00鴉膽子6.464.083.914.304.40牡蠣5.292.092.963.153.75龍骨3.061.841.831.402.35

3.1.1TAMC結(jié)果TAMC>108cfu·g-1的樣本為12.5%(15/120)，TAMC>104cfu·g-1的樣本為70%(84/120)，TAMC平均染菌量鴉膽子最高，龍骨最低。通過對典型菌落的分離和鑒定分析，陰溝腸桿菌、藤黃微球菌、松鼠葡萄球菌和放射根瘤菌等微生物污染飲片情況較為普遍。

3.1.2TYMC結(jié)果TYMC>105cfu·g-1的樣本為4.2%(5/120)，TYMC>102cfu·g-1的樣本為65%(78/120)，TYMC平均染菌量鴉膽子最高，白術(shù)最低。霉菌和酵母菌總數(shù)主要表現(xiàn)為品種差異，鴉膽子、夏枯草和海螵蛸污染嚴(yán)重，而金銀花、白術(shù)和龍骨相對較少。

3.1.3 耐熱菌數(shù)結(jié)果 耐熱菌數(shù)>105cfu·g-1的樣本為6.7%(8/120)，耐熱菌>102cfu·g-1的樣本為49.2%(59/120)，耐熱菌平均染菌量中，鴉膽子最高，金銀花最低。對耐熱菌落分離、純化和鑒定多為緩慢葡萄球菌和變異庫克菌等。

3.1.4 耐膽鹽革蘭陰性菌結(jié)果 未預(yù)培養(yǎng)處理的耐膽鹽革蘭陰性菌檢出為61.7%(74/120)，預(yù)培養(yǎng)2h處理的耐膽鹽革蘭陰性菌檢出為75.0%(90/120)，見表3。

表3 耐膽鹽革蘭陰性菌結(jié)果頻數(shù)分布

Tab.3ThefrequencydistributiontableofbilesaltresistantGram-negativebacteriadetection

結(jié)果范圍未預(yù)培養(yǎng)批數(shù)百分率/%預(yù)培養(yǎng)2h批數(shù)百分率/%101053428.34033.3N<104638.33025.0合計120100.0120100.0

3.2 計數(shù)結(jié)果分析

3.2.1 預(yù)培養(yǎng)對耐膽鹽革蘭陰性菌結(jié)果影響分析 耐膽鹽革蘭陰性菌，預(yù)培養(yǎng)2h后檢出率提高13.3%，采用轉(zhuǎn)換后的對數(shù)值，進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，預(yù)培養(yǎng)2h可以提高耐膽鹽革蘭陰性菌的檢出率。

3.2.2 聚類結(jié)果分析TAMC、TYMC、耐熱菌及耐膽鹽革蘭陰性菌的聚類分析結(jié)果表明，花類的金銀花、百合等，根莖類的白術(shù)、姜黃等因其抑菌作用[9-12]，微生物負(fù)荷相對較低，而其他根莖類、全草類、種子類及動物藥的微生物負(fù)荷較高。

3.3 控制菌檢查結(jié)果 對樣本中的疑似菌落進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，銅綠假單胞菌的檢出率最高，檢出9批，為7.5%；其次是大腸埃希菌，檢出4批，為3.33%；其余控制菌均未檢出。12種中藥飲片普遍存在的其他污染菌中，以肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和緩慢葡萄球菌較為常見，從中藥飲片中分離鑒定確認(rèn)肺炎克雷伯菌和肺炎亞種菌等26種不同污染微生物。

表4 12種中藥飲片控制菌檢查結(jié)果

Tab.4 12kindsofChineseherbalmedicinescontrolbacteriatestresults

名稱大腸埃希菌銅綠假單胞菌沙門菌金黃色葡萄球菌梭菌志賀氏菌白色假絲酵母菌溶血性鏈球菌其他污染菌金銀花10000000陰溝腸桿菌合歡皮10000000緩慢葡萄球菌,肺炎克雷伯菌,陰溝腸桿菌,巴斯德菌屬海螵鞘01000000產(chǎn)氣腸桿菌,溶血葡萄球菌夏枯草00000000肺炎克雷伯菌,光滑假絲酵母菌,假單胞菌姜黃01000000陰溝腸桿菌,嗜熱鏈球菌,緩慢葡萄球菌,耐久腸球菌,假單胞菌百合01000000沒有或未分離出其他污染菌重樓10000000施氏假單胞菌,變異庫克菌白術(shù)01000000鉛黃腸球菌,緩慢葡萄球菌,陰溝腸桿菌,溶血葡萄球菌穿心蓮11000000放射根瘤菌鴉膽子01000000肺炎克雷伯菌,產(chǎn)氣腸桿菌,陰溝腸桿菌牡蠣00000000陰溝腸桿菌,托爾蒙特鏈球菌,郝氏埃希菌,松鼠葡萄球菌龍骨03000000產(chǎn)氣腸桿菌,溶血葡萄球菌,里拉微球菌,變異庫克菌,狗鏈球菌共計49000000沒有或未分離出其他污染菌

3.4 風(fēng)險評估結(jié)果 按照USP38判定不合格率最高，而EP8.0不合格率最低。中藥飲片微生物污染品種差異大，合歡皮、夏枯草、重樓、鴉膽子和穿心蓮需氧菌總數(shù)污染較嚴(yán)重，而金銀花、百合相對較好；植物藥易于霉變，動物藥如龍骨、牡蠣相對較好。污染微生物的種類方面，腸桿菌科微生物占首位，包括大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌等。用藥途徑方面，外用的中藥飲片應(yīng)重視銅綠假單胞菌的控制，口服中藥飲片應(yīng)重視大腸埃希菌的控制。見表5。

表5 不同標(biāo)準(zhǔn)對12種中藥飲片微生物指標(biāo)的風(fēng)險評估結(jié)果

Tab.5Theriskassessmentresultsof12kindsofChineseherbalmedicinesbydifferentstandards

標(biāo)準(zhǔn)名稱分類限度標(biāo)準(zhǔn)不合格批數(shù)不合格率/%涉及不合格品種EP8.0A類TAMC≤107cfu·g-11512.5合歡皮、夏枯草、重樓、鴉膽子、穿心蓮TYMC≤105cfu·g-154.2夏枯草、鴉膽子沙門菌不得檢出(10g)00-大腸埃希菌≤103MPN/g4--JP16Ⅰ類TAMC≤107cfu·g-11512.5合歡皮、夏枯草、重樓、鴉膽子、穿心蓮TYMC≤104cfu·g-13025.0除白術(shù)、牡蠣、龍骨外,全部涉及沙門菌不得檢出(10g)0--大腸埃希菌≤102MPN/g4--USP38使用前經(jīng)沸水處理的植物藥TAMC≤106cfu·g-13327.5除金銀花、姜黃、白術(shù)、百合、龍骨外,全部涉及TYMC≤104cfu·g-13025.0除白術(shù)、牡蠣、龍骨外,全部涉及耐膽鹽革蘭陰性菌≤102cfu7764.2全部涉及大腸埃希菌和沙門菌不得檢出(10g)4--Ch.P2015研粉口服用貴細(xì)飲片、直接口服及泡服飲片沙門菌不得檢出(10g)---耐膽鹽革蘭陰性菌<104cfu(1g)4638.3除白術(shù)外,全部涉及

注：-表示檢驗(yàn)取樣量與標(biāo)準(zhǔn)要求不一致，不作判定。

4 討論

中藥抗菌成分主要有黃酮類、生物堿類、有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、糖類、皂苷類、蒽醌類和萜類等[13]，采用pH值為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液可緩沖有機(jī)酸和生物堿，減小抑菌作用,有利于微生物的檢出。有文獻(xiàn)報道[14-17]，夏枯草、鴉膽子、金銀花、穿心蓮、白術(shù)和重樓對細(xì)菌有不同程度的抑制作用，夏枯草、姜黃、重樓和白術(shù)對霉菌和酵母菌有抑菌作用。從調(diào)查結(jié)果看，即使有抑菌作用的中藥飲片，對污染微生物數(shù)量和種類的抑制也較微弱?？赡艿脑蛞环矫媸俏⑸镓?fù)荷較大，掩蓋了其抑菌作用；另一方面是中藥飲片抑菌成分提取方法差異較大，主要為水煎劑，生理鹽水、醋和酒等浸出劑，提取的極性范圍較窄，可能導(dǎo)致有效成分未能完全提取[18]，影響了活性成分的種類、數(shù)量以及中藥飲片的抑菌效果。此外，不同產(chǎn)地的中藥飲片其抑菌作用差異也較大[19]。

中藥飲片的質(zhì)量控制備受關(guān)注[20]。調(diào)查顯示，中藥飲片微生物污染情況比較嚴(yán)重，衛(wèi)生質(zhì)量亟待提高。有文獻(xiàn)報道，藥品經(jīng)營企業(yè)和使用單位均為不合格中藥材的高發(fā)單位[21]。建議應(yīng)盡快制定適合我國國情的中藥飲片微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，即：以易污染的致病菌為主，以反映整體衛(wèi)生狀況需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)為輔的中藥飲片微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)。加強(qiáng)過程控制，逐步規(guī)范中藥飲片生產(chǎn)的各環(huán)節(jié)，降低微生物負(fù)荷，減少不合理輻照，降低中藥飲片的安全風(fēng)險，促進(jìn)中藥飲片產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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Investigation and risk assessment of 12 kinds of Chinese herbal medicines microbial contamination in Shaanxi province

SHENGJinfang,YANGXiaoli,LIHui

(ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl,Xi′an710065，China)

ObjectiveToinvestigate12kindsofChineseherbalmedicinesmicrobialcontaminationandassesspotentialrisk.MethodsAccordingtothemethodsofChinesePharmacopoeia2015editionandnationalfoodsafetystandard.12kindsofChineseherbalmedicineswereevaluatedforthedeterminationoftotalaerobicmicrobialcount(TAMC),totalcombinedyeastsandmoldscount(TYMC),totalheatresistantbacteriacountandthecontrolbacteria.ResultsChineseherbalmedicineTAMC>104cfu·g-1was70%(84/120),TYMC>102cfu·g-1was65%(78/120),heatresistantbacterianumber>102cfu·g-1was49.2%(59/120).PreprocessingbenefitedbilesaltresistantGram-negativebacteriadetection,whichwas75.0%(90/120). E.colidetectionratewas3.33%,Pseudomonas aeruginosadetectionratewas7.5%.ConclusionMicrobialcontaminationsituationofChineseherbalmedicineswasserious,itisnecessarytoimprovethesanitaryconditions,andestablishreasonablemicrobialqualitycontrolstandards.Keywords：Chineseherbalmedicine;microbialcontamination;E.coli.; Pseudomonas aeruginosa;riskassessment

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃項(xiàng)目(編號：S2013SF3711)

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.017

R

A

2016-02-26)