王 丹，曹思碩，康 樺，杜 軍，匡 榮*，李敏杰*

(1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004；2.安利(中國)研發(fā)中心有限公司，上海 201203)

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銀杏蓯蓉配方急性毒性和亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)研究

王 丹1，曹思碩2，康 樺1，杜 軍2，匡 榮1*，李敏杰2*

(1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004；2.安利(中國)研發(fā)中心有限公司，上海 201203)

目的 觀察銀杏蓯蓉配方的毒性。方法 按照《保健食品檢驗(yàn)與評價(jià)技術(shù)規(guī)范》2003年版中的相關(guān)規(guī)定，進(jìn)行銀杏蓯蓉片的急性毒性實(shí)驗(yàn)和90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 銀杏蓯蓉配方的大鼠最大耐受劑量(MTD)大于15g·kg-1·bw-1，屬無毒級；將受試物摻入飼料中，自由攝取連續(xù)90d，大鼠體質(zhì)量和食物利用率均無異常改變，各項(xiàng)血常規(guī)和生化指標(biāo)均在本實(shí)驗(yàn)室正常指標(biāo)值范圍內(nèi)，高劑量組和對照組動物各臟器的病理組織檢查亦未見明顯病變，未觀察到有害作用(NOAEL)，劑量為0.7g·kg-1·bw-1。結(jié)論 可以判斷銀杏蓯蓉配方為無毒物，未見急性毒性和亞慢性毒性。

銀杏蓯蓉配方；急性毒性實(shí)驗(yàn)；喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

銀杏葉有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘和化濁降脂的功效，常用于淤血阻絡(luò)、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、肺虛咳喘及高脂血癥的治療[1-2]。肉蓯蓉具有補(bǔ)腎陽、益精血和潤腸通便的功效，常用于治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力及腸燥便秘等癥[1，3]。由上述兩味中藥提取物制成的銀杏蓯蓉配方是輔助改善記憶的功能性保健食品。通過前一階段的實(shí)驗(yàn)對管花肉蓯蓉提取物急性毒性、遺傳毒性和亞慢性毒性進(jìn)行了研究，為其開發(fā)成為新資源食品和功能性食品所需的安全性評價(jià)提供了依據(jù)[4]。本研究旨在評價(jià)銀杏蓯蓉配方產(chǎn)品的綜合安全性，為該品種的上市銷售提供安全性保障。

1 儀器與材料

1.1 儀器TD12001A型電子天平(上海華耀電子衡器有限公司)；ADVIA120血液分析儀(德國拜爾公司)；7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.2 樣品 銀杏蓯蓉配方供試樣品為棕色粉末，主要成分為肉蓯蓉提取物和銀杏葉提取物。標(biāo)志性成分含量：每100g樣品含松果菊苷 7.55g和總黃酮醇苷 2.85g。

1.3 動物SD大鼠及飼料均由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，等級為清潔級。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2008-0033；使用許可證號為SYXK(浙)2008-0117。動物體質(zhì)量依照各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)要求而定。動物飼養(yǎng)溫度為21～25 ℃，相對濕度為50%～70%。

2 方法

2.1 大鼠最大耐受量實(shí)驗(yàn)結(jié)果 選用SD大鼠20只，雌雄各10只，雌性體質(zhì)量為182.7～200.2g，雄性體質(zhì)量為189.4～220.0g，灌胃前16h禁食不禁水。配制好的最大受試物質(zhì)量濃度為750mg·mL-1，實(shí)驗(yàn)第1天以10mL·kg-1給大鼠灌胃2次，2次總劑量為15g·kg-1·bw-1。在首次給予受試物前、給予受試物后7和14d測定體質(zhì)量，灌胃當(dāng)天進(jìn)行觀察并連續(xù)觀察14d，每天記錄動物的一般癥狀、中毒癥狀及死亡數(shù)，并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行病理學(xué)檢查。

2.2 大鼠90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 選SD大鼠80只，雌雄各40只，體質(zhì)量70～90g，隨機(jī)分為4組，即對照組以及低、中、高3個(gè)劑量組，每組雌雄各10只。按照人體日推薦劑量(420mg·d-1)分別擴(kuò)大25，50和100倍設(shè)置0.175，0.35和0.70g·kg-1·bw-13個(gè)劑量組和1個(gè)陰性對照組。各組大鼠連續(xù)灌胃90d，實(shí)驗(yàn)期間所有動物單籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。大鼠連續(xù)觀察90d，每天觀察記錄動物的活動和生長情況等，每周記錄體質(zhì)量和進(jìn)食質(zhì)量并計(jì)算食物利用率，在實(shí)驗(yàn)中期(45d)和結(jié)束(90d)時(shí)對雌雄大鼠分別禁食，腹主動脈取血進(jìn)行血液生化檢查，對每只大鼠進(jìn)行臟器大體觀察，同時(shí)取肝、腎、脾、睪丸/卵巢稱定質(zhì)量并計(jì)算臟器體質(zhì)量比，并取肝、腎、脾、胃、腸、睪丸/卵巢進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，如石蠟切片，H-E染色和光鏡檢查。

2.3 統(tǒng)計(jì)處理方法 大鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)不進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算處理，只列出方案中觀察項(xiàng)目的觀察數(shù)據(jù)和測定數(shù)據(jù)的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。大鼠90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，對于體質(zhì)量、攝食量、血液學(xué)檢查指標(biāo)、血清生化檢查指標(biāo)、臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)的統(tǒng)計(jì)，用DASver1.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析時(shí)，先對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用Dunnett法進(jìn)行多個(gè)劑量組與一個(gè)對照組均數(shù)間的兩兩比較；若方差不齊，則對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗(yàn)后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)總體比較有差異，則采用不要求方差齊性的Tamhane′sT2 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 大鼠最大耐受量實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在14d觀察期內(nèi)，大鼠全部存活，無異常反應(yīng)，活動、飲食、糞便均正常，體質(zhì)量均增加，肉眼未見毒性反應(yīng)，也無動物死亡。處死動物后進(jìn)行解剖，尸檢肉眼觀察組織器官均未發(fā)現(xiàn)異常。MTD值大于15g·kg-1·bw-1，按照急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)，銀杏蓯蓉配方屬無毒級。

3.2 大鼠90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 動物一般情況 實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠均未見異常癥狀和體征，也無死亡。

3.2.2 銀杏蓯蓉配方對大鼠體質(zhì)量總增質(zhì)量、總攝食量和總食物利用率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，3個(gè)劑量組大鼠體質(zhì)量總增質(zhì)量、總攝食量和總食物利用率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 銀杏蓯蓉配方對總食物利用率的影響

Tab.1 Total food utilization influenced by Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=10)

3.2.3 銀杏蓯蓉配方對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 實(shí)驗(yàn)中期雌性大鼠中劑量組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、低劑量組血紅蛋白(Hgb)與陰性對照組比較有所增加(P<0.05)。其余各劑量組與對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表2。雄性大鼠高劑量組及低劑量組嗜中性細(xì)胞比率(%)與陰性對照組比較有所增加(P<0.05)；3個(gè)劑量組淋巴細(xì)胞比率(%)與陰性對照組比較均有所降低(P<0.05)；中劑量組與低劑量組單核細(xì)胞比率(%)與陰性對照組比較均有所增加(P<0.05)；中劑量組嗜酸性細(xì)胞比率(%)與陰性對照組比較均有所降低(P<0.05)；其余各劑量組與對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表3。

表2 銀杏蓯蓉配方對雌性大鼠血常規(guī)的影響

Tab.2 Hematological data in female rats treated with Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束,雌性大鼠各劑量組與對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，雄性大鼠低劑量組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)與陰性對照組比較有所增加(P<0.01)。其余各劑量組與對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表3。

表3 銀杏蓯蓉配方對雄性大鼠血常規(guī)的影響

Tab.3 Hematological data in male rats treated with Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.2.4 對大鼠血液生化指標(biāo)的影響 實(shí)驗(yàn)中期，雌性大鼠高劑量組與中劑量組的總蛋白高于對照組(P<0.05)；低劑量組總膽固醇低于對照組(P<0.05)；其余各劑量組與對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表4。雄性大鼠低劑量組的肌酐低于對照組(P<0.05)；3個(gè)劑量組的谷草轉(zhuǎn)氨酶均高于對照組(P<0.05)；其余各劑量組與對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表5。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，雌性大鼠高劑量組與低劑量組的三酰甘油均高于對照組(P<0.05)；高劑量組的肌酐低于對照組(P<0.05)；其余各劑量組與對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表4。雄性大鼠各劑量組與對照組比較，各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表5。

表4 銀杏蓯蓉配方對雌性大鼠血清生化指標(biāo)的影響

Tab.4 Serum biochemical data in female rats treated with Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.2.5 銀杏蓯蓉配方對大鼠臟器體質(zhì)量比的影響 實(shí)驗(yàn)中期，雄性大鼠高劑量組肝臟體質(zhì)量比大于對照組(P<0.05)；中劑量組睪丸體質(zhì)量比小于對照組(P<0.05)；其余各組各臟器體質(zhì)量比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，雌性大鼠高劑量組與中劑量組肝臟體質(zhì)量比均明顯大于對照組(P<0.05)；其余各組各臟器體質(zhì)量比與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表6。

表5 銀杏蓯蓉配方對雄性大鼠血清生化指標(biāo)的影響

Tab.5 Serum biochemical data in male rats treated with Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05。

表6 銀杏蓯蓉配方對大鼠臟器體質(zhì)量比的影響

Tab.6 Relative organ weights influenced by Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula±s，n=5)

注：與陰性對照組比較*P<0.05。

3.2.6 病理組織學(xué)檢查結(jié)果 各組動物的肝、脾、腎、睪丸、卵巢、胃和腸道等臟器，肉眼觀察均未見明顯異常。肝、脾、腎、胃、腸、睪丸和卵巢的病理組織學(xué)切片鏡下檢查結(jié)果表明，各劑量組與對照組上述臟器均未見明顯病變。

4 討論

由于在預(yù)實(shí)驗(yàn)中未觀察到銀杏蓯蓉配方的LD50，所以采用最大給藥劑量實(shí)驗(yàn)來考察動物的急性毒性情況。用15g·kg-1·bw-1的劑量(相當(dāng)于推薦人日攝入量的2 143倍)灌胃SD大鼠，首次給藥后觀察14d，期間未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后尸檢各臟器均未見明顯異常。故銀杏蓯蓉配方大鼠MTD>15g·kg-1·bw-1，按照急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評價(jià)，本產(chǎn)品屬無毒級。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前管花肉蓯蓉提取物急性毒性研究數(shù)據(jù)(MTD>15g·kg-1·bw-1)吻合[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，肉蓯蓉提取物小鼠灌胃最大耐受劑量為40g·kg-1[6]，而銀杏提取物小鼠灌胃的LD50為7.7g·kg-1·bw-1[7]。綜上所述，無論從文獻(xiàn)數(shù)據(jù)還是研究結(jié)果來看，銀杏蓯蓉配方都不會產(chǎn)生急性毒性。

管花肉蓯蓉提取物對大鼠90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的NOAEL值為4.5g·kg-1·bw-1[4]。銀杏提取物的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)表明，將100～1 600g·kg-1·bw-1銀杏提取物連續(xù)灌胃小鼠或大鼠27周，未發(fā)現(xiàn)任何不良反應(yīng)[8]。故本研究按照人臨床用量的25，50和100倍喂養(yǎng)大鼠90d，雖然各劑量組均有個(gè)別的血常規(guī)和血液生化指標(biāo)與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其值均在本實(shí)驗(yàn)室正常指標(biāo)值范圍內(nèi)，不具有生物學(xué)意義。發(fā)現(xiàn)有部分給藥劑量組的臟器體質(zhì)量比與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但相關(guān)血液學(xué)及病理切片觀察均未發(fā)現(xiàn)病理改變，因此不認(rèn)為該變化與毒性作用相關(guān)。病理組織學(xué)檢查結(jié)果表明，高劑量組與對照組各臟器均未見明顯病變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下，3個(gè)劑量組各項(xiàng)指標(biāo)均未見明顯毒性反應(yīng)，NOAEL值>700g·kg-1·bw-1。另外有多項(xiàng)評價(jià)肉蓯蓉毒性的文章也同樣證實(shí)了肉蓯蓉的安全性，小鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，肉蓯蓉劑量為 0.650，0.975和1.300g·kg-1時(shí)，即相當(dāng)于人體接觸劑量的50，75和100倍時(shí)，無毒性反應(yīng)[6]。文獻(xiàn)報(bào)道的慢性毒性實(shí)驗(yàn)也表明肉蓯蓉是安全的[9]。生殖與發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)表明，肉蓯蓉安全(50g·kg-1)，遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究表明20g·kg-1肉蓯蓉?zé)o遺傳毒性[10]。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，肉蓯蓉相關(guān)制劑安全有效[11-13]。銀杏葉提取物在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用及研究。1 225g·kg-1·bw-1銀杏提取物對小鼠無生殖發(fā)育毒性[14]。240mg·d-1銀杏提取物在治療眩暈病人12周的臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的耐受性[15]。經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及歷史文獻(xiàn)的比對，可證實(shí)銀杏蓯蓉配方產(chǎn)品安全可靠。參考文獻(xiàn)：

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Acute and sub-chronic toxicity of Ginkgo biloba and Cistanche tubulosa formula on rats

WANGDan1，CAOSishuo2，KANGHua1，DUJun2，KUANGRong1*，LIMinjie2*

(1.ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl，Hangzhou310004，China；2.Amway(China)R&DCenterCompanyLimited，Shanghai201203，China)

ObjectiveTostudythetoxicityofGinkgo bilobaandCistanche tubulosaformula.MethodsTheacutetestand90dfeedingtestwereappliedandanalyzedinratsinaccordancewithProceduresandMethodsforToxicologicalAssessmentofFoodSafety.ResultsItsacutetoxicitytestshowedthatthemaximumtolerateddose(MTD)wasgreaterthan15g·kg-1·bw-1.The90dfeedingtestshowedthatbodyweightandfoodutilizationrateweresimilarineachgroup；theparametersofbloodroutineexaminationandbiochemicalindexwereinnormalrange；theformuladidnotcausesignificantpathologicalchangesintheorgansofhighdosagegroupandcontrolgroup.Thenoobservedadverseeffectlevel(NOAEL)wasestimatedas0.7g·kg-1·bw-1.ConclusionGinkgo bilobaandCistanche tubulosaformulaisanon-toxicproductandhasnosub-chronictoxicityaswell.

Ginkgo bilobaandCistanche tubulosaformula；acutetoxicitytest；feedingtest

王丹，女，副主任藥師

*通信作者：匡榮，男，主任藥師;李敏杰，女，博士

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.015

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2016-02-10)