郭 冬，王洪波，杜 霞，張 紅，李彤暉

(陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003)

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祛瘀生新膠囊揮發(fā)性部位研究

郭 冬，王洪波，杜 霞，張 紅，李彤暉

(陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 710003)

目的 篩選祛瘀生新膠囊揮發(fā)油部位提取工藝并建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 以L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，考察揮發(fā)油提取及包合條件，以HPLC定量及TLC定性控制揮發(fā)油包合物質(zhì)量。結(jié)果 提取工藝為：加9倍量水，浸泡1 h，提取9 h；包合工藝為：揮發(fā)油∶β-環(huán)糊精=1∶11，包合時(shí)間3 h，包合溫度40 ℃；建立了揮發(fā)油包合物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)論 優(yōu)化后工藝可操作性強(qiáng)、穩(wěn)定、合理，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)專一、全面、可行。

祛瘀生新膠囊；揮發(fā)性部位；正交實(shí)驗(yàn)；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

A.stract:Objective To screen the extract procedure and establish the quality standard of the volatile oil for Quyushengxin Capsules. Methods The orthogonal test L9(34) was used to investigate the degree of extraction and inclusion for the volatile oil. The quality of the inclusion compound for the volatile was controlled by HPLC and TLC. Results The extraction procedure:9 times water，soak for 1 h， extraction 9 h. The inclusion procedure, volatile oil∶β-cyclodextrin=1∶11，inclusion time 3 h， and the package junction temperature 40 ℃. Conclusion The optimized process is feasible，stable and reasonable. The quality control standard is specific， comprehensive and feasible.

祛瘀生新膠囊是我院臨床常用經(jīng)驗(yàn)方，主要由桂枝、三棱、莪術(shù)等7味中藥組成；具有破氣行血、散結(jié)止痛之功效；用于治療風(fēng)、寒、濕、邪等多種原因引起的髖部疼痛、腫脹、屈伸活動(dòng)受限、行走困難等功能障礙性疾病，主治股骨頭環(huán)死。臨床常用為湯劑，但其具有服用劑量大、攜帶不方便等缺點(diǎn)，因此改為膠囊劑。其揮發(fā)性部位是該制劑工藝研究的一部分。桂枝中的活性成分主要為揮發(fā)油，含量為0.12%～0.19%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1]，三棱、莪術(shù)混合提取揮發(fā)油可提高彼此揮發(fā)油的提取率，因此將含揮發(fā)性成分的桂枝、三棱和莪術(shù)混合提揮發(fā)油，并用β-環(huán)糊精包合，可有效保存其活性成分，提高療效，增加制劑的穩(wěn)定性，同時(shí)建立桂皮醛的含量測(cè)定方法，以控制揮發(fā)油包合物的質(zhì)量，為開發(fā)治療股骨頭壞死的新型中藥奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 98-1-B型電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)；HJ-6多頭磁力加熱攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；KH-300D型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HCTP11B10托盤藥物天平(北京市宣武區(qū)天平廠)；BP211D型電子分析天平(德國(guó)賽多利斯天平有限公司)；2010A-UV型高效液相色譜儀，CLASS-VP色譜工作站(日本島津公司)。

1.2 試藥 三棱、莪術(shù)和桂枝購(gòu)自盛興中藥飲片廠，經(jīng)檢驗(yàn)均符合《中國(guó)藥典》2010年版一部的規(guī)定。β-環(huán)糊精(淄博千匯生物科技有限公司)；乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純；桂皮醛為對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)110725-200512)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)性部位提取研究

2.1.1 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 據(jù)查新[2]及預(yù)試，藥材粒度、浸泡時(shí)間、加水量和提取時(shí)間是影響提取的主要因素，而大生產(chǎn)為了避免顆粒小造成糊化，常以藥材飲片投料，因此僅考慮提取時(shí)間(A)、浸泡時(shí)間(B)和加水量(C)3項(xiàng)因素，每個(gè)因素制定3個(gè)水平，見表1。

2.1.2 揮發(fā)油提取 以處方量稱取桂枝、三棱、莪術(shù)各9份，分別提取揮發(fā)油，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2～3。

表1 提取揮發(fā)油因素水平表

Tab.1 The factor and level of extraction of the volatile oil

水平因素A,提取時(shí)間/hB,浸泡時(shí)間/hC,加水量/倍空白150.571271.092391.5113

表2 提取揮發(fā)油正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 The results of the orthogonal test of the volatile oil

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD(空白)揮發(fā)油含量/%111111.36212221.44313331.40421231.57522311.47623121.38731321.60832131.88933211.68K14.204.534.624.51K24.424.794.694.42K35.164.464.474.85R0.170.020.010.03

表3 提取揮發(fā)油方差分析結(jié)果

Tab.3 The results of analysis of variance of the volatile oil

方差來(lái)源離差平方和自由度均值F值顯著性SSA0.168620.084320.02*SSB0.020220.01012.39SSC0.034320.01714.07SSD0.008420.0042

注：F0.1(2，2)=9.0，F(xiàn)0.05(2，2)=19.0，F(xiàn)0.01(2，2)=99.0;*有顯著性差異。

由表3可知，A因素有顯著性差異；B因素與C因素?zé)o顯著性差異，且B2>B1>B3，C2>C1>C3；結(jié)果為A3B2C2，即加9倍量水，浸泡1 h，提取9 h。

2.2 揮發(fā)性部位包合研究

2.2.1 揮發(fā)油包合正交實(shí)驗(yàn) 通常揮發(fā)油包合[3]有飽和水溶液法、超聲波法、研磨法等，因飽和水溶液法易操作，適合大生產(chǎn)，所以選用此法，以包油率為指標(biāo)，篩選β-環(huán)糊精量、包合時(shí)間、包合溫度[4]。結(jié)果見表4～6。

表4 揮發(fā)油包合因素與水平

Tab.4 The factor and level of inclusion of the volatile oil

水平因素A,揮發(fā)油∶β-CD(v/w)B,包合溫度/℃C,包合時(shí)間/h空白11∶7403121∶9604231∶118053

表5 揮發(fā)油包合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.5 The results of the orthogonal test for the inclusion of the volatile oil

實(shí)驗(yàn)號(hào)ABCD(空白)包油率/%1111168.562122271.983133363.384212372.505223176.256231266.197313282.408321389.209332185.30K1203.92223.46223.95230.11K2214.94237.43229.78220.57K3256.90214.87222.03225.08Sj521.0086.4310.8615.18

表6 揮發(fā)油包合方差分析結(jié)果

Tab.6 The results of variance analysis of the volatile oil

方差來(lái)源離差平方和自由度方差F值顯著性SSA520.99582260.497934.3130*SSB86.4336243.21685.6926SSC10.859825.42990.7152SSD15.183627.5918

注：F0.1(2，2)=9.0，F(xiàn)0.05(2，2)=19.0，F(xiàn)0.01(2，2)=99.0；*有顯著性差異。

由表5～6可知，因素A差異性最大，因素B、C無(wú)差異性，結(jié)合大生產(chǎn)現(xiàn)狀，選A3B1C1即：揮發(fā)油∶β-環(huán)糊精=1∶11，包合3 h，包合溫度40 ℃。以此條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，得平均包油率(包封率)為85%，即10 g包合物中載揮發(fā)油為0.83 mL。

2.3 揮發(fā)油包合物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.3.1 薄層鑒別 取揮發(fā)油包合物1 g，加乙醚30 mL，超聲30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取三棱對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照揮發(fā)油包合物制備方法及供試品處理方法制備缺三棱的陰性對(duì)照液。依次吸取上述3種溶液各15，10和15 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8∶4∶1)溶劑系統(tǒng)展開，取出，晾干，噴以0.01 g·L-1香草醛-硫酸溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，有相同顏色的斑點(diǎn)。而陰性對(duì)照無(wú)此斑點(diǎn)。

2.3.2 揮發(fā)油包合物含量測(cè)定 以君藥桂枝中活性成分桂皮醛(cinnamaldehyde)為指標(biāo)，采用HPLC法[5]，建立揮發(fā)油包合物含量測(cè)定方法。

2.3.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱Welchrom C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，月旭科技(上海)股份有限公司；流動(dòng)相為乙腈-水(32∶68)；檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm；流速為1 mL·min-1；柱溫：室溫。在此條件下供試品中的桂皮醛得到良好分離，理論板數(shù)以桂皮醛峰計(jì)算為4 543，陰性對(duì)照在此處無(wú)干擾，見圖1。

2.3.2.2 溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h的桂皮醛對(duì)照品適量，加甲醇制成9.687 μg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。另取揮發(fā)油包合物5 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，浸泡1 h，超聲30 min，取出，放至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。同法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液1，2，3，4和5 μL，按照2.3.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，桂皮醛在10.208 8～50.088 μg之間呈良好的線性關(guān)系?；貧w方程為：A=1 101 800C-12 400，相關(guān)系數(shù)r=1。

圖1 HPLC圖

A. 桂皮醛對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照品；1.桂皮醛

Fig.1 HPLC chromatograms

2.3.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)得RSD值為0.16%。

2.3.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取揮發(fā)油包合物6份，按供試品制備方法制備樣品，按照2.3.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。平均含量為5.25 μg ·g-1，RSD值為0.68%。2.3.2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中的2號(hào)樣品，分別于0，2，4，6，8，10和12 h進(jìn)樣，記錄峰面積，RSD值為0.19%，表明此樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品5份，分別加入對(duì)照品溶液(9.687 μg·mL-1)1.5 mL，依照供試品溶液處理方法及2.3.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。平均回收率為103.14%，RSD值為1.05%，見表7。

表7 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.7 Test results of the recovery rate

序號(hào)取樣量/g相當(dāng)于桂皮醛的量/μg加對(duì)照品量/μg 測(cè)得總量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%12.500713.1314.5327.90101.65103.141.0522.507413.1614.5328.20103.5132.506413.1614.5328.30104.2042.500513.1314.5328.01102.4152.505313.1514.5328.25103.92

2.3.2.8 供試品測(cè)定 取揮發(fā)油包合物3批，按照供試品制備方法和2.3.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果桂皮醛的含量分別為5.21，5.36和5.18 μg·g-1。

3 討論

桂枝為祛瘀生新膠囊中的君藥，所含揮發(fā)性活性成分桂皮醛可隨水蒸汽蒸餾，具有明顯的鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎作用[6]。而莪術(shù)為氣中血藥，善破氣中之血，以破氣消積；三棱為血中氣藥，善破血中之氣，以破血通經(jīng)。二藥配伍，氣血兼顧，活血祛瘀，行氣止痛，化積消癥之力增強(qiáng)[7-8]，兩者的有效部位均為揮發(fā)油。揮發(fā)油具有易揮發(fā)、強(qiáng)烈刺激性氣味的缺點(diǎn)，因此用β-環(huán)糊精包合，掩蓋其不良?xì)馕叮乐褂行С煞值难趸?、分解，以增加其穩(wěn)定性，從而保證藥品質(zhì)量和臨床療效。

由揮發(fā)油包合物中桂皮醛含量測(cè)定結(jié)果(含量較高)可知，祛瘀生新膠囊揮發(fā)性部位提取、包合工藝科學(xué)、合理，可操作性強(qiáng)，能很好地保留揮發(fā)性成分，特別是桂皮醛包合量高，損失較少，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全面、科學(xué)。

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Research of the volatile part for Quyushengxin Capsules

GUO Dong，WANG Hongbo，DU Xia，ZHANG Hong，LI Tonghui

(Shaanxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Xi′an 710003，China)

Quyushengxin Capsules；volatile site；orthogonal test；quality standard

ence substance of cinnamic aldehyde； B.the test sample； C.the negative

ubstance；1.cinnamic aldehyde

陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2011k12-03-05 )

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.005

R284

A

1004-2407(2016)06-0568-04

2016-05-13)