嚴(yán)婉榮, 肖 敏, 趙志祥, 陳 圓, 符尚嬌, 肖彤斌

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 海南省植物病蟲害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 海口 571100)

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辣椒細(xì)菌性葉斑病病原鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

嚴(yán)婉榮, 肖 敏, 趙志祥, 陳 圓, 符尚嬌, 肖彤斌*

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 海南省植物病蟲害防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, ?？?571100)

2012-2015年,在海南省辣椒主產(chǎn)區(qū)發(fā)生了一種嚴(yán)重危害辣椒的葉斑病,從發(fā)病葉片中分離到一種細(xì)菌,通過致病性測(cè)定、柯赫氏法則驗(yàn)證及分子生物學(xué)鑒定,將引起該病害的病原鑒定為野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria)。選用8種殺菌劑通過平板對(duì)峙法對(duì)該病原進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定,結(jié)果表明:其中6種藥劑對(duì)該病原有抑菌效果,效果最好的為72%農(nóng)用硫酸鏈霉素可濕性粉劑,47%春雷·王銅可濕性粉劑次之,2%春雷霉素水劑和20%噻菌銅懸浮劑沒有抑菌效果,不同藥劑之間或同一種藥劑不同劑型之間抑菌效果差異較大。病原鑒定和藥劑篩選可為該病害的診斷和防治提供科學(xué)依據(jù)。

辣椒細(xì)菌性葉斑??； 病原菌; 殺菌劑; 藥劑篩選

海南是我國(guó)冬季北運(yùn)蔬菜的重要生產(chǎn)基地,辣椒的種植面積達(dá)2萬hm2左右。2012年開始,在海南省海口、澄邁、文昌、瓊海等市縣普遍發(fā)生了一種細(xì)菌性葉斑病,該病害在辣椒苗期到成株期均可發(fā)生，其癥狀與已報(bào)道的辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病癥狀相似[1]。病原菌主要危害葉片,發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)黃綠色小斑點(diǎn),逐漸發(fā)展擴(kuò)大后病斑邊緣暗褐色,中央稍凹陷,濕度較大時(shí),相互連接形成不規(guī)則大型斑。發(fā)病嚴(yán)重時(shí)葉片大量脫落,落花、落果甚至猝倒,成片死亡。病原菌一旦侵染成功,便可迅速擴(kuò)展,給農(nóng)戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。2015年初在海南省靈山鎮(zhèn)調(diào)查發(fā)現(xiàn),田間辣椒發(fā)病率平均達(dá)80%,至少造成30%的減產(chǎn)。為明確其病原,本研究對(duì)該病害的病原進(jìn)行了組織分離、致病性測(cè)定及分子生物學(xué)鑒定。同時(shí),本文選取了8種主要?dú)⒕鷦┻M(jìn)行了抑菌試驗(yàn),以期篩選出較好的殺菌劑,為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離及鑒定

1.1.1 病原菌分離

2014年3月,在海南省靈山鎮(zhèn)采集到辣椒細(xì)菌性葉斑病病株。將病健交界處葉片組織剪成0.3 cm×0.3 cm左右的方塊,用75%乙醇表面消毒2 min,無菌水沖洗3次,放入點(diǎn)滴板內(nèi)加入50 μL無菌水研磨,用移液槍吸取20 μL研磨液于LB平板(胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、NaCl 10 g、瓊脂 17 g,加水定容至1 000 mL,調(diào)至pH 7.0,121℃滅菌20 min)上,采用接種環(huán)進(jìn)行畫線,28℃倒置培養(yǎng)48 h,挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.1.2 柯赫氏法則驗(yàn)證

在采集病株的同時(shí),將健康植株連根拔起帶回實(shí)驗(yàn)室栽種,用于回接試驗(yàn)。將分離純化的菌株接種到液體LB培養(yǎng)基中,置于搖床中28℃、180 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,細(xì)菌濃度達(dá)到108cfu/mL左右時(shí)用噴霧法接種辣椒,3次重復(fù),無菌水做對(duì)照。接種株置于自然條件下培養(yǎng),日平均氣溫28℃左右,每天進(jìn)行噴霧保濕，觀察發(fā)病情況,對(duì)發(fā)病葉片進(jìn)行病原菌的再分離。

1.1.3 分子鑒定

將病原菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,提取其基因組DNA,采用通用引物27F/1492R[2](5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)和L1/L2(5′-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3′/5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′)進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行平端化反應(yīng),連接到含有致死基因的pLB vector上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α菌株。在含有氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB平板上直接挑取陽性克隆,送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。試驗(yàn)所用的試劑盒均購自天根生化科技有限公司。

1.2 8種殺菌劑對(duì)病原的抑菌試驗(yàn)

8種殺菌劑包括46%氫氧化銅干懸浮劑和53.8%氫氧化銅水分散粒劑(美國(guó)杜邦公司),72%農(nóng)用硫酸鏈霉素可濕性粉劑(華北制藥河北華諾有限公司),47%春雷·王銅可濕性粉劑和2%春雷霉素水劑(日本北興化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社),2%春雷霉素可濕性粉劑(海利爾藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司),30%壬菌銅微乳劑(西安近代科技實(shí)業(yè)有限公司),20%噻菌銅懸浮劑(浙江龍灣化工有限公司)。

按照8種藥劑的使用說明書及預(yù)備試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果,將每種藥劑稀釋成5個(gè)濃度梯度(表1)。取5 mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的病原菌加入到200 mL 45℃左右液化的LB固體培養(yǎng)基中,混勻后倒平板(皿直徑為9 cm),平板晾干后,用直徑為4 mm的滅菌打孔器在平板上打出呈等邊三角形的3個(gè)孔,吹干孔內(nèi)水分[3]。取各個(gè)不同濃度的藥劑加入到LB培養(yǎng)基孔中,每個(gè)濃度重復(fù)3次,無菌水做對(duì)照,28℃恒溫培養(yǎng)72 h后十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑[4],計(jì)算不同濃度的藥劑產(chǎn)生的抑菌圈平均值。

1.3 抑菌數(shù)據(jù)處理

根據(jù)抑菌圈直徑計(jì)算相對(duì)抑菌率,相對(duì)抑菌率(%)=(處理抑菌圈直徑-對(duì)照抑菌圈直徑)/處理抑菌圈直徑×100。以藥劑有效成分濃度對(duì)數(shù)值為自變量(x),相對(duì)抑菌率的幾率值為因變量(y), 建立毒力回歸方程,計(jì)算決定系數(shù)R2和EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離及鑒定

常規(guī)組織分離法得到的辣椒細(xì)菌性葉斑病菌菌落形態(tài)見圖1。利用噴霧法回接,7 d后發(fā)病情況如圖2所示,約25 d后葉片全部脫落。接種辣椒表現(xiàn)癥狀與初次分離時(shí)的癥狀一致。分子鑒定結(jié)果表明,采用27F /1492R引物擴(kuò)增后得到1 505 bp大小的片段,登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST,發(fā)現(xiàn)該片段與菌株Xanthomonasfuscanssubsp.fuscans(GenBank: FO681494.1)、Xanthomonasaxonopodispv.citrumelo(GenBank: CP002914.1)和Xanthomonascampestrispv.vesicatoria(GenBank: AM03995 2.1)的16S rRNA相似性均為100%,與Xanthomonascitrisubsp.citri(GenBank: CP008989.1)的16S rRNA相似性為99%。采用L1/L2引物擴(kuò)增后得到578 bp大小的片段,通過比對(duì)后發(fā)現(xiàn),該片段與Xanthomonascampestrispv.vesicatoria的ITS區(qū)相似性為99.83%,與Xanthomonasfuscanssubsp.fuscansITS序列的相似性為98.97%。通過2對(duì)引物的對(duì)比,最終將該菌株鑒定為野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria,XCV)。

2.2 8種殺菌劑抑菌結(jié)果及分析

根據(jù)抑菌圈直徑平均值,建立8種藥劑的毒力回歸方程,從表1可以看出,8種藥劑中,2%春雷霉素水劑和20%噻菌銅懸浮劑基本沒有抑菌效果,其他6種藥劑均有一定的抑菌效果,但不同藥劑之間或同一種藥劑不同劑型之間差異較大。其中72%農(nóng)用硫酸鏈霉素可濕性粉劑和47%春雷·王銅可濕性粉劑EC50較低,分別為406.44 mg/L和597.04 mg/L,抑菌效果較好。46%氫氧化銅干懸浮劑、53.8%氫氧化銅水分散粒劑和2%春雷霉素可濕性粉劑EC50分別為1 083.93 mg/L、1 462.18 mg/L和1 660.73 mg/L,抑菌效果一般。30%壬菌銅微乳劑EC50為2 004.47 mg/L,抑菌效果較差。2%春雷霉素的不同劑型抑菌效果差異較大。

圖1 病原在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of the pathogen on LB medium

圖2 辣椒細(xì)菌性葉斑病致病性測(cè)定Fig.2 Pathogenicity test of pepper bacterial leaf spot

藥劑名稱Bactericide稀釋倍數(shù)Dilutiontimes有效成分含量/mg·L-1Contentofactivecomponents抑菌圈直徑/cmDiameterofinhibitionzone毒力回歸方程Toxicityregressionequation決定系數(shù)(R2)DeterminationcoefficientEC50/mg·L-146%氫氧化銅DF46%CopperhydroxideDF5001000150020002500200010006675004001.240.850.640.530.45y=2.2713x-1.89330.92211083.9353.8%氫氧化銅WG53.8%CopperhydroxideWG500700900110013002000142911119097690.960.810.730.600.52y=2.1364x-1.76140.93721462.1872%農(nóng)用硫酸鏈霉素WP72%StreptomycinWP5001000150020002500200010006675004002.011.751.200.920.69y=1.4340x+1.25890.8532406.4447%春雷·王銅WP47%Kasugamycin·copperoxychlorideWP500700900110013002000142911119097692.301.961.431.150.86y=1.9554x-0.42870.9420597.04

續(xù)表1 Table 1(Continued)

藥劑名稱Bactericide稀釋倍數(shù)Dilutiontimes有效成分含量/mg·L-1Contentofactivecomponents抑菌圈直徑/cmDiameterofinhibitionzone毒力回歸方程Toxicityregressionequation決定系數(shù)(R2)DeterminationcoefficientEC50/mg·L-12%春雷霉素AS2%KasugamycinAS300500700900110033332000142911119090.500.460.420.400.40---2%春雷霉素WP2%KasugamycinWP300400500600700333325002000166714291.891.621.030.750.69y=2.9825x-4.60460.94461660.7330%壬菌銅ME30%CuppricnonylphenolsulfonateME500600700800900200016671429125011110.750.600.450.430.41y=7.5662x-19.97800.97712004.4720%噻菌銅SC20%Thiodiazole-copperSC400500600700800250020001667142912500.470.410.400.400.40---

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明,分離自靈山鎮(zhèn)的辣椒細(xì)菌性葉斑病病原為野油菜黃單胞菌辣椒斑點(diǎn)病致病變種,與辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病為同一種病原,最早由Young等[5]命名。據(jù)報(bào)道,該病原主要侵染辣椒和番茄[6-7],也可侵染曼陀羅、枸杞、馬鈴薯等,可種子帶菌,也可隨病殘?bào)w在土壤中越冬[8],在我國(guó)北京、內(nèi)蒙古、新疆、云南[9]、湖南、陜西[10]等地區(qū)普遍發(fā)生。辣椒細(xì)菌性斑點(diǎn)病病原在分類上比較復(fù)雜,由于16S rDNA的高度保守性,無法區(qū)分近緣種,因此研究近緣種的生物學(xué)特性及差異基因尤為重要。多年來陸續(xù)報(bào)道了該菌的多種分類方法,根據(jù)病原菌是否具有解淀粉和果膠活性,將其分為A和B組,A組菌沒有水解淀粉和果膠活性,B組菌可以水解淀粉和果膠[11]。根據(jù)病原菌對(duì)碳基質(zhì)的利用、酶活性及脈沖場(chǎng)凝膠電泳多態(tài)性,又添加了C組和D組菌株[12],2004年,Jones等[13]將A、B、C、D 4個(gè)表型組依次重新命名為4個(gè)種:X.euvesicatoria、X.vesicatoria、X.perforans和X.gardneri。陳新[10]等通過REA-PCR的方法研究發(fā)現(xiàn)這4種表型在國(guó)內(nèi)均存在。

8種殺菌劑室內(nèi)抑菌結(jié)果顯示:72%農(nóng)用硫酸鏈霉素可濕性粉劑抑菌效果最好,目前仍是防治辣椒細(xì)菌性葉斑病的首選藥劑,47%春雷·王銅可濕性粉劑次之，而2%春雷霉素水劑和20%噻菌銅懸浮劑沒有抑菌效果。2%春雷霉素兩種劑型的抑菌效果差異較大,可濕性粉劑比水劑效果好。雖然72%農(nóng)用硫酸鏈霉素可濕性粉劑的防效最好,但國(guó)內(nèi)外也均報(bào)道了對(duì)該藥劑產(chǎn)生抗藥性的菌株[14-15]。病原菌對(duì)藥劑的抗性問題已成為田間防治病害的主要問題,因此要定期檢測(cè)田間病原對(duì)殺菌劑的抗藥性,及時(shí)更換有效藥劑,延緩抗藥性的產(chǎn)生。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Pathogen identification and bactericide screening of pepper bacterial leaf spot

Yan Wanrong, Xiao Min, Zhao Zhixiang, Chen Yuan, Fu Shangjiao, Xiao Tongbin

(Institute of Plant Protection, Hainan Academy of Agricultural Sciences, Hainan Key Laboratory for Prevention and Control of Plant Diseases and Insect Pests, Haikou 571100, China)

In 2012-2015, a serious pepper bacterial leaf spot disease occurred in the main producing areas of Hainan Province. A bacterial strain was isolated from the diseased pepper leaves, and identified asXanthomonascampestrispv.vesicatoriaby pathogenicity test, Koch’s postulates and molecular identification. Toxicities of 8 kinds of bactericide were tested by plate confrontation method. The results showed that 6 agents have antibacterial effects, and 72% streptomycin WP was most effective, and followed by 47% kasugamycin· copper oxychloride WP,while 2% kasugamycin AS and 20% thiodiazole copper SC have no inhibitory action. Antibacterial activity differed significantly between the different agents, and the same agents with different formulation also had different antibacterial effects.

pepper bacterial leaf spot; pathogenic bacteria; bactericide; bactericide screening

2015-09-17

2015-12-15

海南省科學(xué)事業(yè)費(fèi)項(xiàng)目(KYYS-2014-36)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD19B06)

S 436.418

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.036

* 通信作者 E-mail:xiaotbin@sina.com