高 波, 王容燕, 馬 娟, 李秀花, 陳書龍

(河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 保定 071000)

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甘薯爪哇黑腐病的病原鑒定

高 波, 王容燕, 馬 娟, 李秀花, 陳書龍*

(河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 保定 071000)

甘薯爪哇黑腐病是甘薯貯藏期的一種真菌性病害,是全球熱帶和亞熱帶地區(qū)甘薯貯藏期的重要病害之一。2013年我們從廣東湛江采集的甘薯中,發(fā)現(xiàn)病薯薯塊由兩端向中間變黑變硬,切開發(fā)病薯塊,在傷口處會(huì)逐漸長(zhǎng)出黑色或灰色的菌絲。發(fā)病薯塊室內(nèi)放置30 d后表面龜裂,裂口處有大量的黑色粉末溢出,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量褐色有隔膜孢子。經(jīng)對(duì)病原菌進(jìn)行分離,采用柯赫氏法則回接驗(yàn)證,依據(jù)病原菌的形態(tài)特征和rDNA-ITS及β-tubulin基因序列,確定該病害為甘薯爪哇黑腐病,病原菌為可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)。致病性測(cè)定發(fā)現(xiàn)該病具有較強(qiáng)致病性,對(duì)于貯藏期甘薯具有較大威脅。這是國(guó)內(nèi)首次對(duì)該病進(jìn)行的報(bào)道。

甘薯; 爪哇黑腐病; 可可毛色二孢; 分子鑒定

我國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó),年均種植面積460萬(wàn)hm2左右,年均總產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的75%左右[1]。但由于甘薯的體積大、水分多、表皮薄易破損、擦傷,而使得其安全貯藏成為我國(guó)甘薯生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)。影響甘薯安全貯藏的因素主要是貯藏環(huán)境以及貯藏期病害,其中又以貯藏期病害對(duì)甘薯的威脅最大。

甘薯爪哇黑腐病(Java black rot)是由可可毛色二孢[Lasiodiplodiatheobromae(Pat.) Griffon & Maubl.]引起的一種貯藏期真菌病害[2],于1896年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道,是美國(guó)南部地區(qū)甘薯貯藏期最具破壞性的病害之一,也是全球熱帶和亞熱帶地區(qū)甘薯貯藏期的重要病害之一[3]。該病原菌寄主范圍廣泛,可以侵染58科的138種植物并導(dǎo)致很多作物發(fā)生貯藏期腐爛病[3]。我國(guó)目前為止鮮有對(duì)甘薯爪哇黑腐病的研究報(bào)道。由于其致病菌可可毛色二孢具有寄主范圍廣,分布廣的特點(diǎn),目前已經(jīng)在我國(guó)的多種作物上有報(bào)道,例如花生莖腐病、沙田柚果腐病、香蕉黑腐病、芒果蒂腐病等[4-7]。

2013年6月從廣東湛江采集的甘薯薯塊中發(fā)現(xiàn)大量病薯,其癥狀與甘薯爪哇黑腐病癥狀極為相似,通過(guò)對(duì)疑似病原菌進(jìn)行分離純化、形態(tài)觀察、致病性測(cè)定以及基因序列分析,最終確定其病原種類,進(jìn)而為該病的防控及其深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種:甘薯樣本于2013年6月采自廣東湛江;用于回接鑒定的品種為‘煙薯25’;用于致病性測(cè)定的品種為:‘冀薯6-8’、‘煙薯25’、‘商薯19’、‘冀薯98’、‘冀紫薯1號(hào)’、‘冀薯4號(hào)’、‘徐薯25’。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA):馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L和瓊脂20 g/L。LB培養(yǎng)液:胰蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L和NaCl 10 g/L。LB固體培養(yǎng)基含瓊脂20 g/L。所有培養(yǎng)基經(jīng)121℃,濕熱滅菌15～20 min后使用。

試劑:Fungal gDNA Kit購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司;2×EsTaqMasterMix、DM2000 plus marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;pMD18-T載體、T4連接酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;感受態(tài)大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室自制;EB、氨芐青霉素購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器:梯度PCR儀,美國(guó)ABI公司;DYY-6C型電泳儀,北京六一儀器廠;凝膠成像儀,伯樂(lè)公司;光照培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠;振蕩培養(yǎng)箱,上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;尼康Eclipse 80i顯微鏡,尼康映像儀器銷售(中國(guó))有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離純化

切取發(fā)病薯塊的病健交界處組織,75%乙醇消毒1 min,無(wú)菌水沖洗3遍后移入10%次氯酸鈉消毒2 min,然后再用無(wú)菌水沖洗3次,最后用滅菌濾紙吸干組織表面水分。消毒后的組織移入PDA培養(yǎng)基上(含50 mg/L鏈霉素),在25℃,光周期L∥D=14 h∥10 h下培養(yǎng)3 d。將初次培養(yǎng)獲得的各菌株分別接種到新鮮PDA培養(yǎng)基上同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)至新生菌絲長(zhǎng)出,以此為第一代，通過(guò)在顯微鏡下挑取單條新生菌絲的方法連續(xù)繼代培養(yǎng)3代后獲得純化的病原菌。

1.2.2 柯赫氏法則驗(yàn)證

選取健康、表面無(wú)破損的‘煙薯25’薯塊,用70%乙醇表面消毒,無(wú)菌水沖洗3次后用于回接試驗(yàn)。在薯塊靠近兩端處分別打取5 mm孔,用于接種受測(cè)菌株和空白對(duì)照(PDA瓊脂塊),具體方法為:從分離獲得的各菌株平板上打取5 mm菌盤,將菌盤菌絲面朝下置于薯塊一端的一個(gè)接種點(diǎn)處,另一個(gè)接種點(diǎn)以同樣的方法接種PDA瓊脂塊,每個(gè)菌株接種3個(gè)薯塊。將接種好的薯塊置于濕潤(rùn)無(wú)菌沙土中于25℃、光周期L∥D=14 h∥10 h下保濕培養(yǎng),分別于3、6、10和15 d時(shí)調(diào)查發(fā)病情況,再次分離致病菌,并進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定。

1.2.3 病原菌形態(tài)鑒定

將直徑為5 mm的菌盤接種到PDA平板中央,置于25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h下培養(yǎng),觀察其菌落的培養(yǎng)特征;從發(fā)病薯塊切取一小塊干腐變黑的組織,置于無(wú)菌水中搗碎,吸取上層液體于尼康80i顯微鏡下觀察孢子的形態(tài),并利用顯微鏡附帶軟件NIS-Elements F 3.2對(duì)孢子進(jìn)行拍照并測(cè)量其大小。

1.2.4 病原菌的分子鑒定

利用Fungal gDNA Kit提取病原菌的基因組DNA。用兩對(duì)通用引物ITS1/ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和Bt2a/ Bt2b(5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′/5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′)分別對(duì)病原菌的rDNA-ITS以及β-tubulin基因進(jìn)行擴(kuò)增,PCR體系為:2×EsTaqMasterMix 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,DNA模板1 μL,加ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94℃,3 min;94℃ 30 s,55℃/58℃ 30 s,72℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán);72℃充分延伸10 min。PCR 產(chǎn)物在濃度為1%的瓊脂糖凝膠中電泳,EB染色,用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。將回收純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體4℃過(guò)夜連接,連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,并于含氨芐青霉素(50 mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～14 h，篩選陽(yáng)性克隆。挑取單菌落于4 mL含氨芐青霉素(50 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),將獲得的菌液利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR驗(yàn)證。最后將經(jīng)PCR驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆(至少3個(gè))送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。利用DNAStar軟件包的SeqMan進(jìn)行序列拼接比對(duì)。所得序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。采用MEGA 5.2軟件包中的neighbor-joining(NJ)聚類分析法對(duì)所測(cè)定的序列進(jìn)行聚類分析。

1.2.5 致病性測(cè)定

在PDA培養(yǎng)基上接種已純化菌株,25℃,光周期L∥D=14 h∥10 h下培養(yǎng)5 d用于致病性測(cè)定。7個(gè)受試甘薯品種為:‘冀薯6-8’、‘煙薯25’、‘冀薯98’、‘商薯19’、‘徐薯25’、‘冀薯4號(hào)’以及‘冀紫薯1號(hào)’。每個(gè)品種選取3個(gè)薯塊作為試驗(yàn)組接種致病菌,1塊作為對(duì)照組接種PDA瓊脂塊,方法：將所有薯塊經(jīng)70%乙醇表面消毒,無(wú)菌水沖洗3次后,每個(gè)薯塊分別設(shè)置針刺與不處理兩個(gè)接種點(diǎn),兩接種點(diǎn)均接種5 mm菌盤(對(duì)照組接種5 mm PDA瓊脂塊),菌絲面朝下置于接種點(diǎn)上。接種好的薯塊置于濕潤(rùn)無(wú)菌沙土上25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h保濕培養(yǎng)10 d后調(diào)查發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀和病原菌形態(tài)特征

采自廣東湛江的甘薯,在實(shí)驗(yàn)室放置1個(gè)月左右大量薯塊發(fā)生干腐,發(fā)病率達(dá)80%(n=20)。癥狀主要表現(xiàn)為薯塊干腐變硬,表面龜裂,變褐,裂口部分可見亮黑色物質(zhì)(圖1a),挑取部分該組織于顯微鏡

下觀察可見大量孢子,共分為兩種:一種為無(wú)色透明無(wú)隔膜的橢圓形孢子,另一種為深褐色中間有隔膜的橢圓形或紡錘形孢子(圖1b),孢子大小為(20.5～28.7)μm×(12.2～16.6)μm。與甘薯爪哇黑腐病的癥狀相似。

圖1 甘薯爪哇黑腐病發(fā)病癥狀及其病原菌的孢子形態(tài)Fig.1 Symptoms of Java black rot on sweet potato and spore morphology of the pathogen

分離獲得的5個(gè)疑似病原菌在PDA 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀基本一致,因此,選取菌株1306ZJ作為代表菌株進(jìn)行研究。疑似病原菌菌落呈圓形或近圓形,質(zhì)地疏松；菌絲絮狀、淺白色,沿平面輻射狀生長(zhǎng)(圖2a)。48 h 長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿后有旺盛的氣生菌絲生長(zhǎng),在培養(yǎng)皿中央聚集成絮狀,后逐漸變?yōu)榛揖G色(圖2b),最后整個(gè)菌落變?yōu)榛液谏?圖2c),培養(yǎng)基背面呈黑色。10 d 后,開始產(chǎn)生暗灰色、小蘑菇狀、近圓形的菌絲團(tuán)。切開菌絲團(tuán)可見有透明的無(wú)隔膜的未成熟孢子,與可可毛色二孢的形態(tài)特征基本一致。

圖2 甘薯爪哇黑腐病菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)不同時(shí)間菌落的形態(tài)Fig.2 Colony morphology of the pathogen isolated from sweet potato in different culture periods on PDA medium

2.2 柯赫氏法則回接驗(yàn)證

經(jīng)純化的疑似病原菌回接薯塊3 d后(圖3),接種菌盤處周圍表皮顏色變褐,組織變軟,而接種瓊脂塊處未發(fā)病,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),接種菌盤處周圍表皮顏色開始變深最終變成黑色,同時(shí)薯塊表皮逐漸變皺,干腐,伴有黑色穹頂狀或墊狀子實(shí)體突破表皮生成,切開薯塊可見表皮以下組織已變成褐色或黑色。以上癥狀與甘薯爪哇黑腐病的特征基本一致[2]。從發(fā)病組織分離純化病原菌,經(jīng)形態(tài)和分子鑒定與之前獲得菌株一致。

圖3 病原菌回接薯塊發(fā)病癥狀Fig.3 Symptoms of the inoculated sweet potato tuber

2.3 病原菌的分子鑒定

用真菌通用引物ITS1/ITS4和Bt2a/ Bt2b分別對(duì)病原菌的rDNA-ITS及β-tubulin基因的擴(kuò)增結(jié)果顯示其rDNA-ITS目的條帶大小約為540 bp,而β-tubulin目的條帶大小約為460 bp(圖4),與預(yù)期大小一致。經(jīng)測(cè)序獲得其rDNA-ITS區(qū)序列長(zhǎng)為542 bp(GenBank登錄號(hào):KJ866153),β-tubulin基因區(qū)序列長(zhǎng)為459 bp(KJ866154)。分別將獲得的兩條序列提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,結(jié)果顯示其ITS序列與登錄號(hào)為KC964547、JX982240以及HM466959的Lasiodiplodiatheobromae菌株同源性為100%,而β-tubulin基因序列與登錄號(hào)為EU673110、KC960992、JX462265的菌株同源性為99%～100%,說(shuō)明該病原菌為L(zhǎng).theobromae?；谶@兩個(gè)基因的聚類分析結(jié)果顯示(圖5),該病原菌均與L.theobromae聚為一組,進(jìn)化距離最近,進(jìn)一步證明了以上結(jié)論。

圖4 病原菌rDNA-ITS及β-tubulin基因 PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis results of the PCR products of rDNA-ITS and β-tubulin gene

圖5 利用鄰接法基于rDNA-ITS(a)和β-tubulin(b) 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining tree calculated from the sequences of rDNA-ITS (a) and β-tubulin (b)

2.4 致病性測(cè)定

對(duì)病原菌進(jìn)行的致病性測(cè)定顯示,接種10 d后

受試的7個(gè)品種的對(duì)照組薯塊兩個(gè)接種點(diǎn)均未見異常,而試驗(yàn)組中‘冀6-8’,‘煙薯25’,‘商薯19’,‘冀薯98’,‘冀紫薯1號(hào)’等5個(gè)品種針刺接種點(diǎn)周圍組織受到不同程度的侵染,而不經(jīng)處理的接種點(diǎn)周圍組織未受到明顯侵染,另兩個(gè)品種‘冀薯4號(hào)’和‘徐薯25’的兩個(gè)接種點(diǎn)均未受到侵染(圖6)。在發(fā)病的品種中‘煙薯25’的薯塊整個(gè)表面均散布穹頂狀或墊狀病原菌, ‘冀薯98’和‘冀紫1號(hào)’只在針刺接種點(diǎn)周圍組織發(fā)生凹陷變軟,顏色褐化變深,并有墊狀病原菌生成,而‘冀6-8’,‘商薯19’針刺接種點(diǎn)周圍只見組織凹陷變軟,并無(wú)墊狀病原菌生成。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)采自廣東湛江的甘薯發(fā)病薯塊的病原菌進(jìn)行分離純化、致病性測(cè)定和形態(tài)學(xué)觀察,并結(jié)合分子鑒定,最終確定該病害為由可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)引致的甘薯爪哇黑腐病(Java black rot)。這是我國(guó)首次通過(guò)形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)的方法對(duì)甘薯爪哇黑腐病進(jìn)行鑒定。對(duì)7個(gè)甘薯品種進(jìn)行的致病性測(cè)定顯示該病原菌具有較強(qiáng)致病性,可以通過(guò)薯塊的傷口侵染,最終導(dǎo)致甘薯爪哇黑腐病。

圖6 甘薯爪哇黑腐病病原接種7個(gè)甘薯品種的發(fā)病情況Fig.6 Incidence of the seven tested sweet potato varieties

可可毛色二孢廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū),寄主范圍目前已知達(dá)500種之多[8],可以導(dǎo)致寄主的發(fā)病癥狀包括:梢枯、根腐、果腐、枯萎、流膠、葉斑、叢枝等[9]。我國(guó)對(duì)該菌報(bào)道最多的是在熱帶、亞熱帶地區(qū)水果上引起的病害,至今研究最深入的是由可可毛色二孢引起的肉桂枯枝病[10-13]、芒果蒂腐病[14-15]、龍眼焦腐病[16-17]等。近年來(lái),在北方地區(qū)也不斷有該病原的報(bào)道,例如:北京的板栗黑斑病[18],山東的花生莖腐病[7],黑龍江的黑木耳“黑皮病”[19]等,說(shuō)明該病原也能適應(yīng)溫帶氣候,對(duì)我國(guó)北方薯區(qū)也存在著威脅。

綜上所述,無(wú)論北方還是南方薯區(qū)都存在受甘薯爪哇黑腐病危害的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)該引起足夠的重視,甘薯收獲期采取精耕細(xì)挖,最大限度避免薯塊受傷以及結(jié)合化學(xué)防治等措施對(duì)于該病的防治將具有積極的作用。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Pathogen identification of Java black rot disease on sweet potato

Gao Bo, Wang Rongyan, Ma Juan, Li Xiuhua, Chen Shulong

(Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences;IPM Centre of Hebei Province; Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture, Baoding 071000, China)

Sweet potato Java black rot is an important fungus-caused storage disease on sweet potato in the world’s tropical and subtropical areas. In 2013, lots of sweet potato tubers collected from Zhanjiang of Guangdong Province turned black and solid from both ends during storage. Gray to black mycelium developed on the cut ends of diseased sweet potato tubers. The periderm of the diseased tubers would be wrinkled and cracked, and the black stromatic masses would erupt through the tuber surface after 30 days’ storage, and a large number of brown and diaphragm spores would be observed under the microscope. Through the pathogen isolation and purification, pathogenicity test, microscopic observation and molecular identification based on the rDNA-ITS andβ-tubulingenes analysis, the disease was finally diagnosed as sweet potato Java black rot that caused byLasiodiplodiatheobromae. Pathogenicity test revealed that the disease had strong pathogenicity and a great threat to the storage of sweet potato. This is the first report about the disease on sweet potato in China.

sweet potato; Java black rot;Lasiodiplodiatheobromae; molecular identification

2015-11-10

2016-01-05

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(甘薯)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-11-B-08)；河北省財(cái)政基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(494-0401-JBN-6440)

S 432.44

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.035

* 通信作者 E-mail: chenshulong65@163.com