劉 芳， 魏 巍， 冀林華， 馮婷婷， 王樹林， 施繼禹

(青海大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室， 2附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001)

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高原紅細(xì)胞增多癥模型大鼠骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2表達(dá)的相關(guān)性*

劉 芳1△， 魏 巍2， 冀林華2， 馮婷婷2， 王樹林1， 施繼禹1

(青海大學(xué)1醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，2附屬醫(yī)院血液科，青海 西寧 810001)

目的： 探討高原紅細(xì)胞增多癥(HAPC)模型大鼠骨髓CD71+細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-1和GATA-2表達(dá)的相關(guān)性。方法: 雄性SD大鼠48只，隨機(jī)分為對(duì)照組和HAPC模型組。在海拔4 300 m自然環(huán)境下復(fù)制HAPC模型并采用骨髓涂片、骨髓細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨髓CD71+細(xì)胞數(shù)量相對(duì)變化趨勢(shì)；RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達(dá)變化，低氧培養(yǎng)CD71+細(xì)胞，篩選最佳干擾序列GATA-1 shRNA1后，轉(zhuǎn)染96 h，RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: 骨髓細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、涂片及血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，HAPC大鼠模型復(fù)制成功。與對(duì)照組比較，HAPC模型組骨髓CD71+細(xì)胞明顯增多，骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1 的mRNA和蛋白表達(dá)增高，GATA-2的mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。對(duì)照組GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，HAPC模型組GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)性。GATA-1 shRNA1干擾96 h后，GATA-1的mRNA和蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，但是GATA-2的mRNA和蛋白表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)論: HAPC大鼠骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2表達(dá)異常，兩者的負(fù)相關(guān)關(guān)系改變可能是導(dǎo)致HAPC發(fā)生的機(jī)制之一。

高原紅細(xì)胞增多癥； 轉(zhuǎn)錄因子； GATA-1； GATA-2

成熟紅細(xì)胞執(zhí)行生物體內(nèi)氧氣運(yùn)輸功能。其產(chǎn)生經(jīng)歷造血干細(xì)胞至紅系祖細(xì)胞的早期分化階段和紅系祖細(xì)胞至成熟紅細(xì)胞的終末分化階段，是眾多轉(zhuǎn)錄因子參與的多步驟有序調(diào)控過程。這些轉(zhuǎn)錄因子為階段性表達(dá)，它們既相互作用又呈現(xiàn)其特異性。GATA家族是具有保守鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異地結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)的(A/T)GATA(A/G)序列[1-2]，調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與造血、神經(jīng)等不同系統(tǒng)的發(fā)育。GATA-2和GATA-1同屬于GATA家族，是紅細(xì)胞生成不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子。GATA-2表達(dá)于造血干/祖細(xì)胞，調(diào)控紅系祖細(xì)胞增殖；GATA-1在紅系細(xì)胞中高表達(dá)，調(diào)控紅系終末分化[3-4]。當(dāng)GATA-2和GATA-1自身表達(dá)異常時(shí)，會(huì)嚴(yán)重干擾乃至完全破壞紅系的正常發(fā)育和分化，導(dǎo)致一系列血液疾病的發(fā)生。

高原紅細(xì)胞增多癥(high-altitude polycythemia，HAPC)是慢性高原病最常見的一種臨床類型，該疾病以紅細(xì)胞過度積累、嚴(yán)重低氧血癥為特征，常并發(fā)心腦血管意外，肺栓塞，缺血、缺氧性腎病及胃腸病等多種致死率較高的嚴(yán)重疾病，對(duì)高原地區(qū)人群的身心健康構(gòu)成嚴(yán)重危害[5]，但迄今仍未能闡明該疾病的治病機(jī)理。因?yàn)檗D(zhuǎn)鐵蛋白受體CD71是紅系細(xì)胞表面的特異性標(biāo)志物之一，它表達(dá)于紅系祖細(xì)胞至網(wǎng)織紅細(xì)胞的各分化階段[6]，故本研究以HAPC模型大鼠骨髓CD71+細(xì)胞為材料，分析GATA-1和GATA-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平變化及其相關(guān)性，為闡釋HAPC的發(fā)病機(jī)制提供新的科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物和試劑

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，體重(200±20)g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(陜) 2012-003，合格證號(hào)為61001700000509。

大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離試劑盒購自TBD；Anti-PE MicroBeads購自Miltenyi；單克隆抗體PE-CD71和PE-IgG2a購自BD；GATA-1 shRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)，慢病毒載體構(gòu)建及包裝由上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)公司完成；StemSpanTMSFEMⅡ購自STEMCELL；小鼠抗大鼠GATA-1、β-actin單克隆抗體和兔抗大鼠GATA-2多克隆抗體購自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的 II 抗IgG購自北京中杉金橋生物有限公司；Trizol總RNA提取試劑購自Invitrogen；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 購自Fermentas；SYBR Green PCR Master Mix購自Bio-Rad；所用引物(表1)均由上海生工生物工程股份有限公司合成。其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

表1 引物序列

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及HAPC模型的建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組(海拔2 250 m)和HAPC模型組(海拔4 300 m)，每組24只。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，HAPC組模型大鼠自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部運(yùn)至海拔4 300 m的青海省玉樹州珍琴鄉(xiāng)飼養(yǎng)40 d。同期對(duì)照組在海拔2 250 m的西寧市飼養(yǎng)。經(jīng)尾靜脈采血，測(cè)定紅細(xì)胞數(shù)(erythrocyte count，RBC)、血紅蛋白量(hemoglobin，Hb)、紅細(xì)胞壓積(haematocrit，HCT)；經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血行動(dòng)脈血?dú)夥治?，檢測(cè)動(dòng)脈血氧飽和度(arterial oxygen saturation，SaO2)；骨髓涂片后進(jìn)行病理檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)2004年第六屆國(guó)際高原醫(yī)學(xué)和低氧生理學(xué)術(shù)大會(huì)制訂的慢性高原病青海診斷標(biāo)準(zhǔn)(Hb>210 g/L，HCT>65%)判斷動(dòng)物是否患有HAPC[8]。

2.2 CD71+細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)和分選 分離大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，分為4組。其中2組分別加入PE-CD71抗體和同型對(duì)照抗體4 ℃孵育30 min，檢測(cè)細(xì)胞CD71抗體的平均熒光強(qiáng)度值(mean fluorescence intensity，MFI)；另外2組分別與PE-CD71抗體和同型對(duì)照抗體4 ℃避光反應(yīng)10 min后，加入Anti-PE MicroBeads 4 ℃避光孵育15 min，上樣分選柱分選CD71+細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞CD71抗體的MFI。細(xì)胞計(jì)數(shù)10 000個(gè)以上。

2.3 RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達(dá) 提取CD71+細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以β-actin為內(nèi)參照，采用 2-ΔΔCt方法檢測(cè)GATA-1和GATA-2的mRNA表達(dá)。設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)為95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。RIPA裂解液提取CD71+細(xì)胞總蛋白，BCA法定量后進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h， I 抗GATA-1(1∶600)和GATA-2(1∶800)4 ℃過夜， II 抗(1∶80 000)室溫下孵育1 h，ECL發(fā)光壓片顯色。以β-actin 為內(nèi)參照。

2.4 CD71+細(xì)胞的低氧培養(yǎng) HAPC模型組CD71+細(xì)胞重懸于StemSpanTMSFEMⅡ中，調(diào)整6孔板細(xì)胞接種量為每孔1.5×106，置37 ℃、3% O2、92% N2、5% CO2的飽和濕度低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，進(jìn)行后續(xù)RNA干擾實(shí)驗(yàn)。

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 低氧培養(yǎng)的CD71+細(xì)胞分為5組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及GATA-1 shRNA(1、2、3)組， 每組5個(gè)復(fù)孔。干擾序列GATA-1 shRNA1為5’-GGTGCTGAACCTTCTGCATCA-3’；GATA-1 shRNA2為5’- GGGAAGAACAACAATACATTC-3’；GATA-1 shRNA3為5’-GGCCCAAGAAGCGAATGATTG-3’；陰性對(duì)照序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。按復(fù)感染指數(shù)MOI=2加入GATA-1 shRNA慢病毒液，96 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況，RT-qPCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后GATA-1的mRNA及蛋白表達(dá)，篩選出最佳干擾序列。轉(zhuǎn)染最佳干擾序列96 h后，觀察綠色熒光情況，RT-qPCR和Western blot檢測(cè)GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較，采用Bonferroni檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))[median (Q1,Q3)]表示，差異顯著性采用秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 骨髓細(xì)胞形態(tài)特征、分類計(jì)數(shù)和血液學(xué)參數(shù)的比較

骨髓涂片結(jié)果顯示HAPC模型組變形紅細(xì)胞較對(duì)照組增多，可見棘球狀、小球形、大球形等異常紅細(xì)胞(圖1)。與對(duì)照組的骨髓粒、紅細(xì)胞系分類計(jì)數(shù)結(jié)果比較，HAPC模型組的中、晚幼紅細(xì)胞明顯增加(P<0.05)；粒細(xì)胞系統(tǒng)與有核紅細(xì)胞的比值減低(P<0.05)，粒細(xì)胞系統(tǒng)兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表2、3；血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果提示RBC、Hb和HCT升高，SaO2降低(P<0.05)，見表4。

Figure 1.The morphology of bone marrow cells in 2 groups (×400). A: control group, the red arrows point to the normal RBCs; B: HAPC group, the yellow arrows point to the abnormal RBCs.

圖1 兩組骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的比較

表2 兩組骨髓粒、紅細(xì)胞系分類計(jì)數(shù)比較

Table 2.The comparison of myeloid cells differential count in both groups (n=24)

GroupGranulocyticseriesErythrocyticseriesGranulocyte/erythrocyteControl0．50(0．00，8．38)3．25(1．00，10．25)2．88±0．40HAPC0．00(0．00，5．50)9．00(0．63，20．38)?1．27±0．67?

*P<0.05vscontrol group.

表3 兩組紅細(xì)胞系統(tǒng)分類計(jì)數(shù)比較

Table 3.The comparison of erythroid cells differential count in both groups (n=24)

GroupMacroblastBasophilicnormoblastIntermediateerythroblastAcidophilicnormoblastControl0．00(0．00，0．50)1．44±0．689．69±2．409．38±3．67HAPC0．25(0．00，1．00)3．25±2．6317．38±7．15?18．94±7．82?

*P<0.05vscontrol group.

表4 血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果

Table 4.The test results of hematologic parameters (Mean±SD.n=24)

GroupRBC(×1012/L)Hb(g/L)HCT(%)SaO2(%)Control8．25±0．19187．54±7．1654．62±2．4396．23±1．15HAPC11．12±0．26?253．26±13．52?76．40±2．78?74．88±2．86?

*P<0.05vscontrol group.

2 骨髓細(xì)胞CD71的MFI

分選后兩組CD71+細(xì)胞的純度均達(dá)到90%以上；HAPC模型組MNC中CD71抗體的MFI明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表5、圖2。

3 骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2 mRNA及蛋白的表達(dá)變化

與對(duì)照組比較，HAPC模型組CD71+細(xì)胞GATA-1的mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，GATA-2的mRNA及蛋白的表達(dá)量在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3、4。

表5 CD71+細(xì)胞的分選結(jié)果

Table 5.The separation results of CD71+cells (Mean±SD.n=24)

GroupPercentageinmononuclearcells(%)Puritycoefficient Control25．05±3．3292．90±1．81 HAPC53．48±3．81?92．10±2．13

*P<0.05vscontrol group.

Figure 2.CD71 MFI in HAPC group and the corresponding FCM hisgrams. A: MFI of CD71 in HAPC group; B: the images of CD71 detected by flow cytometry. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖2 HAPC模型組CD71的MFI及流式細(xì)胞術(shù)直方圖

Figure 3.The mRNA expression of GATA-1 and GATA-2 in the CD71+cells. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖3 HAPC模型組骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2的mRNA表達(dá)

Figure 4.The protein expression of GATA-1 and GATA-2 in the CD71+cells. Mean±SD.n=24.*P<0.05vscontrol group.

圖4 HAPC模型組骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2 蛋白的表達(dá)

4 骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示HAPC模型組CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達(dá)無顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.143和0.357；對(duì)照組骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2的mRNA及蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.828和-0.931(P<0.01)。

5 GATA-1 shRNA干擾效率的驗(yàn)證

與陰性對(duì)照組相比，各GATA-1 shRNA組GATA-1的mRNA和蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。其中，GATA-1 shRNA1的干擾效果最好，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇GATA-1 shRNA1序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染，見圖5。

6 GATA-1 shRNA1對(duì)GATA-2表達(dá)的影響

熒光倒置顯微鏡下，GATA-1shRNA1組綠色熒光分布于細(xì)胞內(nèi)，與光學(xué)顯微鏡下同一視野對(duì)比，70%以上細(xì)胞顯示綠色熒光(圖6)； 在GATA-1 shRNA1干擾作用下，GATA-1的mRNA和蛋白表達(dá)量低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)，但是GATA-2的mRNA和蛋白表達(dá)量并無減低，見圖7。

Figure 5.The screening results ofGATA-1 shRNA interference sequences in CD71+cells of HAPC group. Mean±SD.n=24.*P<0.05vsnegative control group.

圖5 GATA-1 shRNA干擾序列篩選結(jié)果

Figure 6.The fluorescence observation of the CD71+cells tranfected withGATA-1 shRNA1 for 96 h (×200). A: fluorescence microscopy; B: bright field microscopy.

圖6 GATA-1 shRNA1轉(zhuǎn)染96 h后的熒光顯微鏡觀察

Figure 7.The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels after GATA-1 RNAi transfection in the CD71+cells of HAPC group. Mean±SD.n=24.*P<0.05vsnegative control group.

圖7 HAPC模型組骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2 mRNA和蛋白的表達(dá)

討 論

GATA-2和GATA-1參與紅系造血調(diào)控。GATA-2維持著造血干/祖細(xì)胞增殖和自我更新，其表達(dá)下調(diào)影響造血干/祖細(xì)胞的分化[9-10]。在紅系分化的不同時(shí)期，GATA-1的表達(dá)量和生物學(xué)功能是動(dòng)態(tài)變化的[11]。它在紅系和巨核系祖細(xì)胞時(shí)期的表達(dá)量處于較低水平，分化到紅系集落形成單位(colony-forming unit-erythroid, CFU-E)和原紅細(xì)胞時(shí)其表達(dá)量幾乎達(dá)到頂峰，此后表達(dá)量緩慢下降。GATA-1發(fā)揮著下調(diào)GATA-2等細(xì)胞增殖分裂基因[12-13]、上調(diào)眾多紅系特異性基因[14-15]等作用。隨著正常紅系分化的推進(jìn)，GATA-1表達(dá)增加且抑制GATA-2基因的表達(dá)，兩者共同作用，協(xié)同其它因子調(diào)控造血干/祖細(xì)胞向紅系終末分化轉(zhuǎn)折[12]。那么，GATA-1和GATA-2表達(dá)及作用關(guān)系異常勢(shì)必會(huì)影響紅系細(xì)胞的正常發(fā)育，終將導(dǎo)致紅細(xì)胞系統(tǒng)疾病的發(fā)生。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道復(fù)制HAPC大鼠動(dòng)物模型，應(yīng)用骨髓涂片、骨髓細(xì)胞分類計(jì)數(shù)和血液學(xué)參數(shù)檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，HAPC模型的骨髓未成熟紅細(xì)胞明顯增多，尤以變形紅細(xì)胞最為突顯；細(xì)胞分類計(jì)數(shù)后，發(fā)現(xiàn)中、晚幼紅細(xì)胞明顯增加，粒細(xì)胞系統(tǒng)與有核紅細(xì)胞的比值明顯降低；血液學(xué)參數(shù)指標(biāo)Hb和HCT明顯高于慢性高原病青海診斷標(biāo)準(zhǔn)，但是SaO2降低顯著，說明紅細(xì)胞數(shù)量明顯增多，但是其攜氧能力下降顯著，提示HAPC動(dòng)物模型復(fù)制成功。

采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD71+細(xì)胞的純度和占MNC的比例進(jìn)行檢測(cè)可見HAPC模型組的CD71抗體MFI明顯高于對(duì)照組，同時(shí)兩組CD71+細(xì)胞的純度均可達(dá)到90%以上，提示HAPC模型組骨髓髓系造血干/祖細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化明顯增加，而且細(xì)胞免疫磁珠分選法可以獲得高純度的CD71+細(xì)胞，這為下一步的RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)工作奠定了基礎(chǔ)。

RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GATA-1和GATA-2表達(dá)的結(jié)果顯示，HAPC模型組CD71+細(xì)胞GATA-1的mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，GATA-2的mRNA及蛋白的表達(dá)量未降低，提示高原低氧刺激下，GATA-2表達(dá)量保持不變，可能有益于它發(fā)揮增殖造血干/祖細(xì)胞，擴(kuò)充造血祖細(xì)胞池的作用；同時(shí)GATA-1表達(dá)增高，有利于加強(qiáng)它對(duì)眾多紅系特異性靶基因的調(diào)節(jié)，促進(jìn)紅系細(xì)胞分化。GATA-1與GATA-2間的相關(guān)性分析表明，對(duì)照組GATA-1和GATA-2呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但是HAPC模型組中上述因子間無明顯相關(guān)性。進(jìn)一步采用小RNA干擾技術(shù)抑制HAPC模型組CD71+細(xì)胞GATA-1表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)GATA- 2的表達(dá)未被抑制。提示高原低氧條件下，GATA-1與GATA-2間的相關(guān)關(guān)系發(fā)生改變，這可能促使了骨髓紅系細(xì)胞的過度增殖和大量分化，最終導(dǎo)致成熟紅細(xì)胞的過度積聚。但是高原低氧時(shí)，GATA-2的表達(dá)未被GATA-1抑制，是因?yàn)橐种谱饔脺p弱，還是有它途徑加強(qiáng)GATA-2的表達(dá)而部分抵消GATA-1對(duì)它的抑制作用，原因尚未知曉。在后繼研究中，本課題組將繼續(xù)探尋其中的因果。

綜上所述，本研究復(fù)制HAPC大鼠模型后，分析比較兩組GATA-1和GATA-2的表達(dá)情況和相關(guān)關(guān)系，提示HAPC模型骨髓CD71+細(xì)胞GATA-1和GATA-2表達(dá)異常，兩者的負(fù)相關(guān)關(guān)系削弱，這可能促進(jìn)了HAPC的發(fā)生發(fā)展。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Expression relevance of GATA-1 and GATA-2 in bone marrow CD71+cells of high-altitude polycythemia rat model

LIU Fang1, WEI Wei2, JI Lin-hua2, FENG Ting-ting2, WANG Shu-lin1, SHI Ji-yu1

(1DepartmentofBiochemistry,MedicalCollege,2DepartmentofHematology,AffiliatedHospital，QinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:qhxnlf2006@163.com)

AIM: To investigate the expression relevance of transcription factors GATA-1 and GATA-2 in the bone marrow CD71+cells of a high-altitude polycythemia (HAPC) rat model.METHODS: Male SD rats (n=48) were randomly divided into normal control group and HAPC model group. HAPC model was established at an altitude of 4 300 m in the natural environment and verified by the morphology and quantity of the bone marrow cells and hematologic parameters detection. A relative change in the trend of bone marrow CD71+cell numbers was detected by flow cytometry analysis. The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels in the CD71+cells was examined by RT-qPCR and Western blot. CD71+cells were cultured under hypoxic condition and transfected with the optimal interference sequence of GATA-1shRNA1 for 96 h. The expression of GATA-1 and GATA-2 at mRNA and protein levels was detected by RT-qPCR and Western blot.RESULTS: The establishment of the animal model with HAPC was successful as the bone marrow smears and the hematologic parameters showed compared with the control. The quantity of the bone marrow CD71+cells of HAPC rats were significantly increased and the expression of GATA-1 at mRNA and protein levels in the CD71+cells were higher than those of the control. The expression of GATA-2 at mRNA and protein levels was similar to that of the control. The correlation analysis showed that the expression of GATA-1 was negatively correlated with that of GATA-2 in the control, while no obvious correlation between them was observed in the HAPC rats. The expression of GATA-1 at mRNA and protein levels in HAPC group was lower than that in control group after interfered byGATA-1 shRNA1 for 96 h, but no obvious diversity of GATA-2 expression between the 2 groups was observed.CONCLUSION: GATA-1 and GATA-2 are abnormally expressed and their negative correlation is destroyed in HAPC, which may be one of the pathogenesis of HAPC.

High-altitude polycythemia; Transcription factors; GATA-1; GATA-2

1000- 4718(2016)10- 1863- 07

2016- 01- 21

2016- 08- 17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81441116)；青海省科技廳(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2012-Z-729)；青海大學(xué)“123高層次人才培養(yǎng)工程”中青年學(xué)術(shù)帶頭人基金；青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中青年科研基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No. 2014-KT-1)

△通訊作者 Tel: 0971-6176859; E-mail: qhxnlf2006@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.020

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