李洪濤， 陳壯桂， 葉 進(jìn)， 劉 慧， 鄒小玲， 楊海玲， 張?zhí)焱小?/p>

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1呼吸內(nèi)科， 中山大學(xué)呼吸疾病研究所, 2兒科, 3耳鼻咽喉頭頸外科， 廣東 廣州 510630)

?

Toll樣受體9配體CpG-ODN鼻內(nèi)應(yīng)用對(duì)變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病炎性反應(yīng)的影響*

李洪濤1， 陳壯桂2， 葉 進(jìn)3， 劉 慧1， 鄒小玲1， 楊海玲1， 張?zhí)焱?△

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1呼吸內(nèi)科， 中山大學(xué)呼吸疾病研究所,2兒科,3耳鼻咽喉頭頸外科， 廣東 廣州 510630)

目的： 探討免疫刺激序列CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)鼻內(nèi)應(yīng)用與皮下注射對(duì)變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病(ACAD)模型小鼠下氣道炎性反應(yīng)的影響。方法: 30只清潔級(jí)雌性BALB/c鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(control組)、變應(yīng)性鼻炎組(AR組)、變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病組(ACAD組)、變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病CpG-ODN鼻內(nèi)滴入組(CpG i.n.組)和變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病CpG-ODN皮下注射組(CpG i.d.組)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物依次進(jìn)行腹腔卵白蛋白(OVA)和氫氧化鋁凝膠基礎(chǔ)致敏和3次鼻腔激發(fā)，此后OVA或生理鹽水(NS)霧化氣道激發(fā)，正常對(duì)照組則給予NS。CpG i.n.組和CpG i.d.組分別給予10.0 μg CpG-ODN滴鼻和皮下注射，其它組給予NS滴鼻或皮下注射。觀察CpG-ODN干預(yù)后對(duì)鼻腔及下氣道病理變化及評(píng)分，并對(duì)支氣管肺泡灌洗液(BALF)行白細(xì)胞分類及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，ELISA法測(cè)定BALF和脾臟中細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ，以及血清OVA特異性IgE。結(jié)果: 炎癥細(xì)胞浸潤評(píng)分示ACAD組小鼠肺部的病理改變程度高于control組和AR組(P<0.01)；CpG i.n.組炎癥評(píng)分較ACAD組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而CpG i.d.組炎癥評(píng)分較ACAD組略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CpG i.n.組BALF中的白細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對(duì)值計(jì)數(shù)、EOS百分比、BALF和脾臟淋巴細(xì)胞上清液中Th2細(xì)胞因子較ACAD組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。CpG i.d.組上述指標(biāo)略低于ACAD組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。CpG i.n.組血清的OVA特異性IgE較ACAD組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而CpG i.d.組與ACAD組比較有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。結(jié)論: CpG-ODN可通過抑制變應(yīng)性鼻炎而抑制變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病小鼠的下氣道炎性反應(yīng)，鼻內(nèi)應(yīng)用可能較皮下注射更有效。

支氣管哮喘； 變應(yīng)性鼻炎； CpG寡脫氧核糖核苷酸

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)和支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)流行病學(xué)密切相關(guān)，兩者同為Th1/Th2型免疫應(yīng)答失衡所導(dǎo)致的炎癥性疾病?！白儜?yīng)性聯(lián)合氣道疾病(allergic combined airway disease, ACAD)”這一概念形象體現(xiàn)了兩者的相關(guān)性及一致性[1]。多項(xiàng)研究顯示變應(yīng)性鼻炎是哮喘的高危因素，大多在哮喘前發(fā)生，可通過多種途徑影響哮喘發(fā)生、發(fā)展。對(duì)于合并變應(yīng)性鼻炎的哮喘患者，鼻用糖皮質(zhì)激素(簡(jiǎn)稱激素)不僅可以降低上氣道炎癥，控制鼻炎癥狀，同時(shí)可提高哮喘控制率并改善哮喘患者生活質(zhì)量[2]。然而，雖然激素抗炎治療被認(rèn)為是目前變應(yīng)性鼻炎和哮喘最有效的治療方法，但是仍約有5%～10%呈激素抵抗重型哮喘[3]。而新型免疫佐劑CpG寡脫氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides，CpG-ODN)能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2的比例，使Th0向Th1偏移分化，或逆轉(zhuǎn)已經(jīng)建立的Th2極化反應(yīng)向Th1方向轉(zhuǎn)變，這已經(jīng)成為治療變應(yīng)性鼻炎、哮喘等變應(yīng)性疾病的一種重要途徑[4-7]。但這些研究大多單獨(dú)局限于變應(yīng)性鼻炎或者哮喘各自專業(yè)領(lǐng)域。鑒于變應(yīng)性鼻炎為哮喘高危因素，我們推測(cè)CpG-ODN可能抑制變應(yīng)性鼻炎發(fā)生及轉(zhuǎn)歸到哮喘，從而作為變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病的免疫治療新選擇。為此，擬在本研究中應(yīng)用BALB/c小鼠復(fù)制變應(yīng)性鼻炎以及變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病模型，觀察CpG-ODN干預(yù)變應(yīng)性鼻炎后對(duì)下氣道炎性反應(yīng)的影響，并比較鼻內(nèi)滴入與皮下注射2種給藥方式的效果差異。

材 料 和 方 法

1 試劑

卵白蛋白(ovalbumin, OVA)和RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma)；CpG-ODN 包含2個(gè)CpG 基序(5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3’)購自上海生工，并經(jīng)檢測(cè)無內(nèi)毒素脂多糖污染；小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中白細(xì)胞介素4 (interleukin-4，IL-4)、IL-5、IL-13、干擾素γ(interfe-ron-gamma, IFN-γ)和血清OVA特異性IgE的ELISA試劑盒購于Elabscience。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)分組 清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重16～20 g，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組6只，分別為正常對(duì)照組(control組)、變應(yīng)性鼻炎組(AR組)、變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病組(ACAD組)、變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病CpG-ODN鼻內(nèi)滴入組(CpG i.n.組)和變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病CpG-ODN皮下注射組(CpG i.d.組)。變應(yīng)性鼻炎和變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病動(dòng)物模型參照KleinJan等[8]和我們前期的研究[9]制備，稍加改進(jìn)。BALB/c小鼠于第1、7天腹腔內(nèi)注射10 μg OVA/2 mg氫氧化鋁凝膠基礎(chǔ)致敏，10 d后致敏鼠每鼻孔滴入10 μL OVA(1 g/L)或10 μL 生理鹽水(normal saline,NS)，每周連續(xù)3 d，共激發(fā)3周。在最后1次鼻腔激發(fā)24 h后，應(yīng)用NS 5 mL氣道霧化吸入0.5 h氣道激發(fā)共7 d以制備變應(yīng)性鼻炎模型(AR組)。在上述變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型最后1次鼻腔激發(fā)24 h后，將NS替換為2%的OVA溶液(5 mL霧化吸入0.5 h)，氣道激發(fā)共7 d以制備變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病模型(ACAD組)。CpG i.n.組為10 μL OVA(1 g/L)OVA鼻腔激發(fā)1 h后應(yīng)用10.0 μg CpG-ODN鼻內(nèi)滴入，每周連續(xù)3 d共3周，余同ACAD組；CpG i.d.組為在10 μL OVA(1 g/L)鼻腔滴入并10.0 μg CpG-ODN腹部皮下注射，余同ACAD組；control組在致敏、鼻滴入及激發(fā)階段均應(yīng)用NS。

2.2 癥狀觀察 每次鼻腔或氣道激發(fā)后30 min內(nèi)，攝錄機(jī)對(duì)小鼠行為進(jìn)行記錄，然后對(duì)小鼠噴嚏和抓鼻次數(shù)進(jìn)行逐個(gè)計(jì)數(shù)。

2.3 血清OVA特異性IgE的測(cè)定 每只小鼠心臟取血約0.7 mL，4 ℃放置過夜，離心15 min，血清移至另一干凈Eppendorf管，-80 ℃保存待測(cè)。鼠血清標(biāo)本稀釋后，分別用IgE捕獲抗體和OVA抗原包被酶標(biāo)板4 ℃過夜，洗板3次，小牛血清封閉1 h，加入 I 抗室溫孵育2 h，洗板3次后加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgE II 抗室溫孵育1 h，洗板5次，加入底物工作液顯色，避光孵育30 min，加入終止液。在450 nm處測(cè)吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)指標(biāo)濃度。

2.4 BALF收集及細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子表達(dá)水平的測(cè)定 參照我們前期的研究[9-10]，每組小鼠最后1次氣道激發(fā)處死后行氣管切開插管右肺行BALF灌洗，分3次緩慢注入PBS 1.5 mL，緩慢灌注，回收BALF。BALF 1 500 r/min離心8 min，Eppendorf管收集上清液-80 ℃保存待測(cè)。收集離心后的沉淀細(xì)胞，用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，細(xì)胞沉渣用1 mL PBS液重懸，并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，取0.1 mL行嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils，EOS)絕對(duì)數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算EOS百分比(EOS占細(xì)胞總數(shù)的百分比)。在高倍鏡下分為6處，每處300～400個(gè)細(xì)胞，絕對(duì)數(shù)為其比例×細(xì)胞總數(shù)。所有細(xì)胞計(jì)數(shù)由一人專門完成。BALF中細(xì)胞因子濃度的測(cè)定按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，檢測(cè)標(biāo)本中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的含量。

2.5 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞因子測(cè)定 處死各組小鼠后，取出脾臟放入冷PBS中，將其捻碎并濾過100目無菌鋼網(wǎng)，收集脾細(xì)胞懸液，洗滌；用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。加入OVA至終濃度10 mg/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜后收集懸浮細(xì)胞，再用含青霉素G 1×105U/L和鏈霉素100 mg/L的RPMI-1640完全培養(yǎng)基接種于24孔板培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。收集培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IFN-γ的含量。

2.6 小鼠鼻及肺組織病理學(xué) 各組小鼠末次氣道激發(fā)后處死，打開胸腔，暴露兩肺，夾閉左肺門，切取左肺近肺門組織，4%多聚甲醛固定，送病理石蠟包埋切片，厚約5 μm，常規(guī)HE 染色。完整切取頭部，中性甲醛固定，取鼻部標(biāo)本石蠟包埋、切片，HE染色。光鏡下觀察各組小鼠鼻腔和肺組織的病理特點(diǎn)。參照相關(guān)文獻(xiàn)[11]，根據(jù)氣道周圍炎癥細(xì)胞的浸潤情況進(jìn)行氣道炎癥評(píng)分：正常為0分；少許炎癥細(xì)胞為1分；1層炎癥細(xì)胞環(huán)繞為2分；2～4層炎癥細(xì)胞環(huán)繞為3分；4層以上炎癥細(xì)胞環(huán)繞為4分。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用STATA 10.0(StataCorp LP)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni統(tǒng)計(jì)方法。 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物的一般情況觀察

AR組出現(xiàn)噴嚏、抓鼻次數(shù)增多和分泌物增多的表現(xiàn)。ACAD組小鼠激發(fā)后除抓鼻和噴嚏次數(shù)與control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，尚出現(xiàn)煩躁不安、易激惹、抓耳撓腮、腹部煽動(dòng)等癥狀，但無死亡。CpG i.d.組也出現(xiàn)類似表現(xiàn)，但程度較輕。CpG i.n.組抓鼻和噴嚏次數(shù)較ACAD組減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.Intranasal administration of CpG-ODN relieved nasal symptoms. Intranasal CpG-ODN significantly reduced the number of nasal rubbing (A) and sneezing (B) movements, but not in the mice that received intradermal CpG-ODN. AR: allergic rhinitis; ACAD: allergic combined airway disease; CpG i.n.: ACAD treated with CpG-ODN intranasally; CpG i.d.: ACAD treated with CpG-ODN intradermally. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsACAD group.

圖1 各組小鼠激發(fā)后抓鼻及噴嚏次數(shù)

2 鼻黏膜和肺組織的病理學(xué)檢查

AR組、ACAD組及CpG i.d.組的鼻腔黏膜組織可見炎性細(xì)胞浸潤、纖毛紊亂、黏膜下小血管擴(kuò)張，間質(zhì)水腫。CpG i.n.組上述病理改變較輕。ACAD組肺組織可見支氣管和血管周圍多量炎性細(xì)胞浸潤，基底膜輕度增厚。而control組和AR組肺組織支氣管及血管周圍少見炎癥細(xì)胞浸潤，各級(jí)支氣管管腔規(guī)則。CpG i.n.組和CpG i.d.組病理改變與ACAD組相比減輕。采用炎癥細(xì)胞浸潤情況評(píng)分，發(fā)現(xiàn)ACAD組小鼠肺部的病理改變程度高于control組和AR組(P<0.01)，CpG i.n.組炎癥評(píng)分比ACAD組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，而CpG i.d.組炎癥評(píng)分與ACAD組比較略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖2。

Figure 2.Intranasal administration of CpG-ODN reduced both upper- and lower-airway inflammation (HE staining, ×200). Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAR group;△P<0.05vsACAD group.

圖2 小鼠鼻黏膜及肺組織HE染色及氣道炎癥評(píng)分的比較

3 各組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)的比較

ACAD組BALF中的白細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對(duì)值計(jì)數(shù)和EOS百分比均高于control組和AR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。CpG i.n.組上述指標(biāo)顯著低于ACAD組(P<0.01)，白細(xì)胞總數(shù)仍高于control組和AR組(P<0.01)，但EOS絕對(duì)值計(jì)數(shù)與control組和AR組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。CpG i.d.組白細(xì)胞總數(shù)及EOS百分比略低于ACAD組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，EOS絕對(duì)值計(jì)數(shù)較ACAD組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見表1。

表1 5組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及EOS絕對(duì)值計(jì)數(shù)的變化

**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsAR group;▲▲P<0.01vsACAD group.

4 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞上清液細(xì)胞因子含量的比較

將OVA與小鼠脾臟分離的淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)后，AR組和ACAD組上清液中的IL-4和IL-5濃度較control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，CpG i.n.組的IL-4和IL-5濃度較AR組和ACAD組下降(P<0.01)，而CpG i.d.組的IL-4和IL-5濃度較AR組和ACAD組略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖3。各組均未檢出IFN-γ(均低于檢測(cè)閾值，圖未顯示)。

Figure 3.Intranasal CpG-ODN treatment altered Th2-type responses from splenocytes. IL-4 (A) and IL-5 (B) production in culture supernatants of splenocytes were determined by ELISA. Means±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsACAD group.

圖3 各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞上清液IL-4和IL-5的比較

5 各組BALF中Th1/Th2型細(xì)胞因子的比較

ACAD組BALF中的IL-4、IL-5和IL-13較control組和AR組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。Control組和AR組的IFN-γ水平低于ACAD組、CpG i.n.組和CpG i.d.組(P<0.01)，但ACAD組、CpG i.n.組和CpG i.d.組3組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。CpG i.n.組BALF中的IL-4、IL-5和IL-13水平較ACAD組降低(P<0.05)，但仍高于control組和AR組(P<0.05)。ACAD組的IFN-γ/IL-4較AR組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，CpG i.n.組的IFN-γ/IL-4高于ACAD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。CpG i.d.組上述指標(biāo)與ACAD組比較略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

6 各組OVA特異性IgE的比較

AR組和ACAD組外周血的OVA特異性IgE較control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)；CpG i.n.組的OVA特異性IgE較AR組和ACAD組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，但仍高于control組(P<0.01)；CpG i.d.組的OVA特異性IgE與AR組和ACAD組比較有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見圖4。

討 論

本研究結(jié)果表明CpG-ODN鼻內(nèi)滴入干預(yù)后，下氣道炎癥細(xì)胞浸潤情況評(píng)分較變應(yīng)性鼻炎和變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說明病理改變明顯減輕；BALF中白細(xì)胞總數(shù)、EOS絕對(duì)值計(jì)數(shù)、EOS百分比、Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13以及脾臟淋巴細(xì)胞上清液IL-4、IL-5較變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病組降低；血清OVA特異性IgE下降。IFN-γ/IL-4較ACAD組升高，表明CpG-ODN主要抑制Th2型細(xì)胞因子，從而使Th1/Th2型細(xì)胞因子恢復(fù)平衡。上述結(jié)果表明CpG-ODN可通過抑制變應(yīng)性鼻炎而抑制變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病下氣道Th2型反應(yīng)。而CpG-ODN皮下注射干預(yù)后上述指標(biāo)較變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，表明鼻內(nèi)滴入可能較皮下注射更有效。需指出的是，本實(shí)驗(yàn)沒有比較鼻內(nèi)應(yīng)用與皮下注射的劑量及作用時(shí)間不同產(chǎn)生的效果，故尚不能確認(rèn)鼻內(nèi)(局部)與皮下注射(全身)給藥方式的確切差異，有待在今后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

哮喘發(fā)病機(jī)制的研究仍很有限，故而哮喘的防治仍停留在對(duì)癥處理階段，病因治療難以突破[12]。輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)免疫失衡是變應(yīng)性鼻炎和哮喘的重要發(fā)病機(jī)制。通過調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，把以Th2為主的免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)門h1型是目前治療哮喘的途徑和思路之一。目前臨床唯一針對(duì)哮喘病因的治療方法的變應(yīng)原特異性免疫治療(specific immunotherapy，SIT)旨在促使Th細(xì)胞免疫反應(yīng)向Th1方向分化，刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，但該方法目前仍存在諸多療效及安全性問題[13]。因此，尋求新的高效、安全的哮喘氣道炎癥防治途徑，一直是該領(lǐng)域的研究課題。CpG-ODN是以CG序列為核心的非甲基化脫氧核苷酸片斷，該序列結(jié)構(gòu)廣泛存在于細(xì)菌及病毒體的DNA中[14]。CpG-ODN可通過與Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)，誘導(dǎo)DC分泌細(xì)胞因子IL-12及IFN-γ，抑制Th2細(xì)胞分泌IL-5等細(xì)胞因子，從而抑制以Th2極化為特征的變態(tài)反應(yīng)[4]。CpG-ODN因其較低成本、高效安全穩(wěn)定、易標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)、半衰期長以及可多途徑接種等優(yōu)點(diǎn)可能取代SIT的地位。鼻內(nèi)CpG-ODN免疫由于是作用于組織局部，不僅能夠降低系統(tǒng)免疫帶來的風(fēng)險(xiǎn)[4]，且避免了全身應(yīng)用中被降解的可能[15]。為此，本項(xiàng)目中我們采用鼻內(nèi)應(yīng)用CpG-ODN作為輸送方式，且提示可能較皮下注射更有效，與Suzuki等[6]研究結(jié)論一致。其原因可能由于鼻腔局部黏膜免疫系統(tǒng)比較發(fā)達(dá)，鼻黏膜相關(guān)淋巴組織富有多種抗原呈遞細(xì)胞。鼻黏膜上皮細(xì)胞也被證實(shí)有TLR9的表達(dá)[16]，這些使得CpG-ODN鼻腔局部應(yīng)用會(huì)更具有靶向激活作用。Suzuki等[6]研究也表明鼻腔黏膜給予CpG-ODN可降低鼻淋巴細(xì)胞及脾細(xì)胞中IgE水平及IL-5濃度，抑制嗜酸性細(xì)胞增多、緩解鼻腔反應(yīng)癥狀，而皮內(nèi)給藥后上述指標(biāo)無顯著改變，提示經(jīng)鼻腔黏膜給予CpG-ODN對(duì)變應(yīng)性鼻炎具有治療作用。本研究結(jié)果提示CpG-ODN鼻內(nèi)應(yīng)用干預(yù)變應(yīng)性鼻炎有利于抑制哮喘炎性反應(yīng)，而變應(yīng)性鼻炎為哮喘發(fā)病高危因素，說明CpG-ODN可在源頭上調(diào)控哮喘發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素，不同于現(xiàn)有治療僅局限于阻斷于免疫反應(yīng)發(fā)生之后引起的一系列癥狀的下游細(xì)胞機(jī)制，而沒有從根本上阻斷免疫反應(yīng)的發(fā)生。本研究為尋找早期、安全、有效的哮喘干預(yù)方式提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Figure 4.Intranasal CpG-ODN treatment altered BALF Th2-type responses and reduced serum OVA-specific IgE. Th1/Th2-associated cytokines levels (A) and IFN-γ/IL-4 ratio (B) in BALF, and OVA-specific IgE (C) in serum were measured by ELISA. Means±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsAR group;▲P<0.05，▲▲P<0.01vsACAD group.

圖4 各組BALF中Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平和血清OVA特異性IgE的比較

本研究中我們采用KleinJan等[8]經(jīng)鼻局部致敏和激發(fā)的方法，可較好地保證變應(yīng)性鼻炎模型局限于鼻炎的表現(xiàn)，研究結(jié)果也提示變應(yīng)性鼻炎組下呼吸道炎性細(xì)胞少見、BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)數(shù)與百分比、Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)等與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，說明該模型僅在鼻腔出現(xiàn)炎性反應(yīng)。以往研究應(yīng)用的變應(yīng)性鼻炎模型多采用大容量鼻腔吸入以激發(fā)致敏鼠，可能導(dǎo)致抗原沉積在肺，從而使鼻、肺炎性反應(yīng)共存[6]。為避免單純變應(yīng)性鼻炎模型肺沉積抗原，本研究中應(yīng)用小劑量10μL OVA或NS重復(fù)滴入清醒的致敏鼠。而變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病組下氣道炎性細(xì)胞明顯增多、BALF中嗜酸性粒細(xì)胞及Th2型細(xì)胞因子明顯升高，提示該模型成功制備。上述動(dòng)物模型有效地保證了CpG-ODN干預(yù)后有關(guān)炎性反應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)。然而本研究中沒有對(duì)CpG-ODN鼻內(nèi)滴入對(duì)影響變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病下氣道炎性反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討，筆者近期曾研究發(fā)現(xiàn)布地奈德通過影響TSLP-DC途徑而抑制哮喘Th2極化反應(yīng)[9]，鑒于鼻黏膜尚有TSLP表達(dá)[17]，CpG-ODN尚可通過與TLR9，誘導(dǎo)DC分泌細(xì)胞因子Th2型細(xì)胞因子[4]，我們推測(cè)CpG-ODN可能抑制TSLP-DC途徑而抑制下氣道炎性反應(yīng)，這將是筆者下一步研究中的重點(diǎn)。

總之，本研究制備了變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病動(dòng)物模型，明確了CpG-ODN可通過抑制變應(yīng)性鼻炎而抑制哮喘下氣道炎癥反應(yīng)，鼻內(nèi)滴入可能較皮下注射更行之有效。這表明CpG-ODN可在源頭上調(diào)控哮喘發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素，為尋找早期、安全、有效的哮喘干預(yù)方式提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 武大偉， 王建亭.變應(yīng)性聯(lián)合氣道疾病[J]. 國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2014, 38(5): 304-308.

[2] Scichilone N, Arrigo R, Paternò A, et al. The effect of intranasal corticosteroids on asthma control and quality of life in allergic rhinitis with mild asthma[J]. J Asthma, 2011, 48(1):41-47.

[3] Durham A, Adcock IM,Tliba O. Steroid resistance in severeasthma: current mechanisms and future treatment[J]. Curr Pharm Des, 2011, 17(7): 674-684.

[4] 朱冬冬， 朱學(xué)偉， 姜曉丹， 等.Toll樣受體9配體CpG寡脫氧核苷酸鼻內(nèi)預(yù)免疫對(duì)豚鼠鼻變態(tài)反應(yīng)抑制作用的研究[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2010, 45(6): 471-476.

[5] 方 萍， 吳曉明， 周 筠， 等.CpG-ODNs對(duì)慢性哮喘小鼠氣道重塑的影響及機(jī)制[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2013, 34(1): 58-63.

[6] Suzuki M, Matsumoto T,Ohta N, et al. Intranasal CpG DNA therapy during allergen exposure in allergic rhinitis[J]. Otolaryngol Head Neck Surg, 2007, 136(2): 246-251.

[7] 董 亮， 張 琦， 陳 明， 等. 轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3比率評(píng)價(jià)哮喘患者Th1/Th2失衡及CpG ODN干預(yù)機(jī)制的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2007, 23(9): 1776-1781.

[8] KleinJan A, Willart M, van Nimwegen M, et al. United airways: circulating Th2 effector cells in an allergic rhinitis model are responsible for promoting lower airways inflammation[J]. Clin Exp Allergy, 2010, 40(3): 494-504.

[9] 李洪濤， 張?zhí)焱校?陳壯桂， 等. 布地奈德對(duì)支氣管哮喘小鼠樹突細(xì)胞胸腺基質(zhì)淋巴生成素受體表達(dá)的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志, 2012, 35(7): 497-502.

[10]Chen ZG, Zhang TT, Li HT, et al. Neutralization of TSLP inhibits airway remodeling in a murine model of allergic asthma induced by chronic exposure to house dust mite[J]. PLoS One, 2013, 8(1):e51268.

[11]Nakagami Y, Favoreto S Jr, Zhen G, et al. The epithelial anion transporter pendrin is induced by allergy and rhinovirus infection, regulates airway surface liquid, and increases airway reactivity and inflammation in an asthma model[J]. J Immunol, 2008, 181(3): 2203-2210.

[12]胡 美， 許欣婷， 李紅梅， 等. Notch信號(hào)通路調(diào)控哮喘小鼠氣道上皮下纖維化[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(5): 781-786.

[13]Calderón MA, Casale TB, Togias A, et al. Allergen-specific immunotherapy for respiratory allergies: from meta-analysis to registration and beyond[J]. J Allergy Clin Immunol,2011,127(1):30-38.

[14]丁國富， 李 斌， 吳 翀， 等. CpG ODN核心序列改變對(duì)其生物學(xué)活性的影響[J].中國病理生理雜志, 2008, 24(10): 2025-2028.

[15]Hanagata N. Structure-dependent immunostimulatory effect of CpG oligodeoxynucleotides and their delivery system[J]. Int J Nanomed, 2012, 7: 2181-2195.

[16]朱學(xué)偉， 朱冬冬， 董 震， 等. TLR9在人鼻黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志, 2008, 22(8): 356-358.

[17]Kamekura R, Kojima T, Koizumi J, et al. Thymic stromal lymphopoietin enhances tight-junction barrier function of human nasal epithelial cells[J]. Cell Tissue Res, 2009, 338(2): 283-293.

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effect of intranasal treatment with Toll-like receptor 9 ligand CpG oligodeoxynucleotides on airway inflammation in mice with allergic combined airway disease

LI Hong-tao1, CHEN Zhuang-gui2, YE Jin3, LIU Hui1, ZOU Xiao-ling1, YANG Hai-ling1, ZHANG Tian-tuo1

(1DepartmentofPulmonaryDiseases,InstituteofRespiratoryDiseasesofSunYat-senUniversity,2DepartmentofPediatrics,3DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:zhtituli@163.com)

AIM: To investigate the therapeutic effect of intranasal administration of CpG oligodeoxynucleotides (CpG-ODN), compared with intradermal administration, on lower airway inflammation in ovalbumin (OVA)-induced allergic combined airway disease (ACAD) mouse model. METHODS: Totally 30 female BALB/c mice aged from 6 to 8 weeks were randomly divided into control group, allergic rhinitis model group (AR group), ACAD group, ACAD intranasally treated with CpG-ODN group (CpG i.n. group) and ACAD intradermally treated with CpG-ODN group (CpG i.d. group). The mice were sensitized and challenged with OVA. Treatment with CpG-ODN was also performed during challenge, either intranasally or intradermally. Immunologic variables and nasal symptom were studied. RESULTS: Compared with CpG i.d. group and ACAD group, the percentage of eosinophils from bronchoalveolar lavage fluid (BALF), the levels of Th2 cytokine production in BALF and supernatants of cultured splenic lymphocytes, OVA-specific IgE from blood, peribronchial inflammation score in the lung, and nasal symptoms were significantly reduced in CpG i.n. group. CONCLUSION: Allergic rhinitis treated by CpG-ODN has a significant improvement on lower airway inflammation in ACAD mouse model; and it may be more effective when administrated intranasally than intradermally.

Bronchial asthma; Allergic rhinitis; CpG oligodeoxynucleotides

1000- 4718(2016)10- 1830- 07

2016- 05- 06

2016- 05- 30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81470220)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. S2013010015990)

△通訊作者 Tel: 020-85252241； E-mail: zhtituli@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.015

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net