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        維拉帕米逆轉(zhuǎn)乳頭狀甲狀腺癌對(duì)多柔比星抗性中的L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制*

        2016-11-24 06:25:28汪軍兵丁向東鄭媛媛梁瑩瑩李光明江明亮
        中國(guó)病理生理雜志 2016年10期
        關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)

        汪軍兵, 丁向東, 鄭媛媛, 梁瑩瑩, 王 浩, 李光明, 江明亮, 董 軍△

        (1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院,廣東 廣州 511400; 2廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司,廣東 廣州 510330; 3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510632)

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        維拉帕米逆轉(zhuǎn)乳頭狀甲狀腺癌對(duì)多柔比星抗性中的L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制*

        汪軍兵1, 2▲, 丁向東2▲, 鄭媛媛3, 梁瑩瑩1, 王 浩1, 李光明3, 江明亮3, 董 軍3△

        (1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院,廣東 廣州 511400;2廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司,廣東 廣州 510330;3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510632)

        目的: 探討維拉帕米逆轉(zhuǎn)乳頭狀甲狀腺癌對(duì)多柔比星抗性的L型鈣離子通道/鈣蛋白酶(L-Ca2+/calpain)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制。方法: 以培養(yǎng)2 d的人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,首先以CCK-8分析法測(cè)定細(xì)胞存活率對(duì)維拉帕米和多柔比星進(jìn)行配伍試驗(yàn),確定合適的藥物作用濃度及時(shí)間。然后將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、多柔比星組、維拉帕米組和多柔比星+維拉帕米組。以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄TPC-1細(xì)胞的L-Ca2+通道電流,以Western blot法測(cè)定蛋白calpain 1及LC3的表達(dá)水平。結(jié)果: 多柔比星組、維拉帕米組與空白對(duì)照組相比,L-Ca2+通道電流密度減小(P<0.05);多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比,L-Ca2+通道電流密度減小(P<0.01)。多柔比星組、維拉帕米組與空白對(duì)照組相比,calpain 1蛋白表達(dá)減弱(P<0.05);多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比,calpain 1蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)。多柔比星組和維拉帕米組與空白對(duì)照組相比,LC3蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05);多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比,LC3蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論: TPC-1細(xì)胞抗多柔比星可能與其自噬活性增強(qiáng)有關(guān);維拉帕米能進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性,致自噬性細(xì)胞死亡,從而對(duì)抗TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性,其機(jī)制可能與自噬的L-Ca2+/calpain 1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

        自噬; 抗性; L型鈣離子通道; 鈣蛋白酶; 乳頭狀甲狀腺癌

        全世界范圍內(nèi),甲狀腺癌在過(guò)去的幾十年間呈持續(xù)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì),乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤,占甲狀腺惡性腫瘤的85%~90%[1]。PTC生物學(xué)行為表現(xiàn)為易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā),約有20%~50%的PTC患者早期即發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,14%的PTC患者復(fù)發(fā)[2]。對(duì)于進(jìn)展型PTC轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的患者,目前手術(shù)及放療難以根治,因此找到一個(gè)好的根治方法的任務(wù)就顯得尤為迫切。

        進(jìn)展型PTC通常在放療后使用多柔比星進(jìn)行化療,不幸的是,PTC對(duì)多柔比星的化療高度抵抗[3-4]。文獻(xiàn)顯示PTC對(duì)多柔比星抗性的產(chǎn)生與PTC自噬保護(hù)作用有關(guān),自噬過(guò)度激活所致的自噬性死亡可能是PTC治療的一個(gè)有效途徑[5]。

        細(xì)胞有多條自噬通路,L型鈣離子通道(L-type calcium channel, L-Ca2+)/鈣蛋白酶(calpain)通路是其中一條重要途徑,它對(duì)自噬起負(fù)調(diào)節(jié)作用[6]。維拉帕米是臨床常用的L型Ca2+通道阻斷劑,具有降血壓的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道,維拉帕米可增強(qiáng)自噬活性[7-8]。我們猜想能否通過(guò)使用維拉帕米來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)多柔比星作用的PTC細(xì)胞的自噬活性,使PTC出現(xiàn)自噬性死亡,從而消除PTC對(duì)多柔比星的抗性,提高PTC患者的治愈率。為驗(yàn)證此假設(shè),本實(shí)驗(yàn)以人PTC細(xì)胞株TPC-1為研究對(duì)象,探討PTC對(duì)多柔比星產(chǎn)生抗性的通路機(jī)制,并探討維拉帕米是否能逆轉(zhuǎn)這種抗性及其機(jī)制,為PTC術(shù)后化療中多柔比星與維拉帕米聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        材 料 和 方 法

        1 主要試劑

        多柔比星及維拉帕米購(gòu)自Sigma;血清購(gòu)自四季青生物有限公司;胰酶購(gòu)自Gibco;RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自HyClone;抗LC3、calpain 1及GAPDH抗體購(gòu)自Abcam;TPC-1細(xì)胞購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。膜片鉗電極外液組成(mmol/L): NaCl 120, CsCl 5, TEA-Cl 10, BaCl210, HEPES 10, MgCl21, TTX 0.0005;膜片鉗電極內(nèi)液組成(mmol/L):CsCl 120, MgCl22, Na2ATP 5, HEPES 10, Glucose 11, EGTA 11。

        2 方法

        2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 TPC-1細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中,介質(zhì)中加入10%胎牛血清和1%青、鏈霉素,用細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,每天換液1次,待單層培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合以后,用0.25%胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)后,在倒置顯微鏡下觀察,當(dāng)細(xì)胞即將匯合時(shí)開(kāi)始加藥。本實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、多柔比星組、維拉帕米組和多柔比星+維拉帕米組。

        2.2 CCK-8法測(cè)定TPC-1細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞, 經(jīng)胰酶消化分散記數(shù)后, 稀釋到4×108/L,接種于96孔培養(yǎng)板中, 每孔180 μL。培養(yǎng)至單層細(xì)胞即將匯合時(shí)加藥。各孔終體積為200 μL,體積不足者以相應(yīng)培養(yǎng)基補(bǔ)足。每一組設(shè)6個(gè)平行孔,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加不同濃度藥物并培養(yǎng)不同時(shí)間后 , 棄去培養(yǎng)液; 每孔加入CCK-8試劑(臨用前以PBS 配成0.5 g/L)100 μL , 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng),足夠?qū)嶒?yàn)時(shí)間后,于30 min內(nèi)在Bio-Rad 3350型酶標(biāo)儀上讀取490 nm處的吸光度(A)值。不加藥只含CCK-8試劑孔細(xì)胞的吸光度值減去空白孔的吸光度值作為基本對(duì)照 , 實(shí)驗(yàn)孔吸光度值減去空白孔吸光度值與之相比得到各自的細(xì)胞存活率。公式為:

        細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(只含CCK-8對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100%。

        2.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流 玻璃毛坯經(jīng)P97微電極拉制儀經(jīng)3步法拉制成尖端直徑為2~3 μm的電極,沖灌電極內(nèi)液。換上電極外液,將皿置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上,20倍物鏡找到胞體光亮飽滿的TPC-1細(xì)胞,安裝好沖灌玻璃微電極并在電壓鉗模式下用微操縱器引導(dǎo)玻璃微電極靠近細(xì)胞。將微電極尖端調(diào)整至胞體正上方,然后在持續(xù)正壓的同時(shí)讓電極尖端緩慢靠近細(xì)胞,待電極尖端接觸細(xì)胞表面時(shí),輕輕給予電極內(nèi)負(fù)壓,形成高阻封接(1 GΩ),此時(shí)形成貼附式膜片,正確補(bǔ)償電容,再給予負(fù)壓吸破電極尖端的細(xì)胞膜,補(bǔ)償電容電流和串聯(lián)電阻,形成全細(xì)胞膜片鉗,穩(wěn)定3~5 min進(jìn)行記錄。電流信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo),數(shù)據(jù)經(jīng)Digtal 1320A轉(zhuǎn)換器記錄。記錄時(shí),將高阻封接的細(xì)胞電位鉗制在-50 mV持續(xù)300 ms,階躍10 mV的10個(gè)去極化電壓鉗制記錄L型Ca2﹢通道電流-電壓曲線。實(shí)驗(yàn)中鉗制電壓和電路電阻隨時(shí)被檢測(cè),只有基線、鉗制電壓和電路電阻穩(wěn)定的數(shù)據(jù)才被納入分析數(shù)據(jù)。

        2.4 Western blot法測(cè)定calpain 1及LC3的蛋白表達(dá) 收集總蛋白,按說(shuō)明書(shū)步驟提取總蛋白,用BCA法蛋白定量,蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,TBST洗膜后,分別加入抗 calpain 1、LC3和GAPDH抗體,抗體用含5%BSA稀釋?zhuān)鄳?yīng)濃度均為1∶1 000,4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后,加入HRP標(biāo)記的II抗,37 ℃孵育1 h。TBST洗膜后,ECL發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白印跡條帶,光密度掃描膠片,Image-Pro Plus 6.0軟件分析結(jié)果。以LC3-Ⅱ的灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值來(lái)表示蛋白LC3的表達(dá)活性。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析(one-way ANOVA),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 CCK-8法測(cè)定TPC-1細(xì)胞的細(xì)胞存活率

        1.1 進(jìn)行藥物配伍實(shí)驗(yàn),確定藥物的合適實(shí)驗(yàn)濃度及時(shí)間 以CCK-8測(cè)定TPC-1細(xì)胞的存活率,使用96孔板,每組設(shè)6個(gè)平行孔,對(duì)應(yīng)孔取平均值。首先以不同濃度(0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、0.75 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L)的多柔比星分別作用于TPC-1細(xì)胞不同時(shí)間(2 h、6 h、12 h、24 h)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,低濃度短時(shí)間的多柔比星對(duì)TPC-1細(xì)胞的存活率無(wú)多大影響,隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度加大,細(xì)胞存活率逐漸下降,在2 h、6 h、12 h、24 h這4個(gè)時(shí)點(diǎn)均出現(xiàn)細(xì)胞存活率先減弱后增強(qiáng)現(xiàn)象,對(duì)應(yīng)2 h、6 h、12 h的細(xì)胞存活率最低點(diǎn)的多柔比星的濃度分別為1 μmol/L、0.75 μmol/L、0.5 μmol/L。前述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星具有抗性。然后,我們以不同濃度(1 μmol/L、2 μmol/L、3 μmol/L、7 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L)的維拉帕米作用于TPC-1細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)TPC-1細(xì)胞的細(xì)胞存活率從3 μmol/L開(kāi)始下降,濃度越高下降幅度越大,這說(shuō)明高濃度的維拉帕米對(duì)細(xì)胞有損害作用。綜合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選定藥物作用時(shí)間為24 h,多柔比星的作用濃度為1 μmol/L,維拉帕米的作用濃度為3 μmol/L。

        1.2 觀察維拉帕米能否逆轉(zhuǎn)TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性 作用時(shí)間與藥物濃度同上,實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、多柔比星組、維拉帕米組和多柔比星組+維拉帕米組。各組的細(xì)胞存活率分別為(100.0±0.0)%、(89.1±4.7)%、(99.0±5.2)%和(52.3±2.6)%。多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。這說(shuō)明維拉帕米能有效對(duì)抗TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性,見(jiàn)圖1。

        Figure 1.The viability of the TPC-1 cells in different groups at 24 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsdoxorubicin group.

        圖1 24 h后不同分組TPC-1細(xì)胞存活率的變化

        2 維拉帕米對(duì)加入多柔比星后TPC-1細(xì)胞L型鈣離子通道電流峰值的影響

        由電壓步階產(chǎn)生的內(nèi)向L型鈣離子通道電流在加藥24 h后被記錄,從-50 mV~+40 mV的電壓步階產(chǎn)生的L型Ca2+通道電流在空白對(duì)照組、多柔比星組、維拉帕米組和多柔比星+維拉帕米組經(jīng)膜電容標(biāo)化后峰值電流密度(pA/pF)分別為-20.76±0.98、-15.18±0.74、-4.58±0.22和-3.61±0.17;多柔比星組與空白對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),說(shuō)明多柔比星可使TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流減弱;維拉帕米組與空白對(duì)照組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01),說(shuō)明維拉帕米可有效地阻斷TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流;多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01),說(shuō)明維拉帕米可有效地阻斷受多柔比星作用的TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流,見(jiàn)圖2。

        Figure 2.The effect of verapamil on peak L-type calcium channel current (ICa, L) in TPC-1 cells treated with doxorubicin. A: voltage steps of L-type calcium channel; B: average peak current amplitude in different groups; C: I-V curves of peak current density in different groups; D: the quantitative analysis of peak current density in different groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsdoxorubicin group.

        圖2 維拉帕米對(duì)加入多柔比星后TPC-1細(xì)胞L型鈣離子通道電流峰值的影響

        3 不同分組中TPC-1細(xì)胞calpain 1蛋白表達(dá)的Western blot實(shí)驗(yàn)分析

        與空白對(duì)照組相比較,多柔比星組calpain 1的蛋白表達(dá)減弱(P<0.05),維拉帕米組calpain 1的蛋白表達(dá)減弱(P<0.05);與多柔比星組相比較,多柔比星+維拉帕米組calpain 1的蛋白表達(dá)減弱(P<0.05),見(jiàn)圖3。

        4 不同分組中TPC-1細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)活性的Western blot實(shí)驗(yàn)分析

        與空白對(duì)照組相比較,多柔比星組LC3的蛋白表達(dá)活性增強(qiáng)(P<0.05),維拉帕米組LC3的蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05);與多柔比星組相比較,多柔比星+維拉帕米組LC3的蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01),見(jiàn)圖4。

        討 論

        自噬,又稱(chēng)Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡,是細(xì)胞內(nèi)某些胞質(zhì)成分通過(guò)一系列嚴(yán)格調(diào)控的途徑,最后被溶酶體內(nèi)蛋白酶降解,釋放出大分子物質(zhì)再循環(huán)的過(guò)程。自噬具有雙重功能:當(dāng)自噬在對(duì)不同形式的細(xì)胞應(yīng)激作出反應(yīng)時(shí)自噬可被快速上調(diào),這種快速的自噬誘導(dǎo)可以通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及毒性代謝分子,并通過(guò)產(chǎn)生維持細(xì)胞重要功能所必需的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)件的方式以利于細(xì)胞的生存[9],但自噬的持續(xù)過(guò)度性激活也可導(dǎo)致細(xì)胞最終發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡[10]。

        Figure 3.Western blot analysis of calpain 1 protein expression in the TPC-1 cells with different treatments after 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdoxorubicin group.

        圖3 24 h后不同分組中TPC-1細(xì)胞calpain 1蛋白表達(dá)的Western blot實(shí)驗(yàn)分析

        Figure 4.Western blot analysis of autophagy-related protein LC3 expression in the TPC-1 cells with different treatments after 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsdoxorubicin group.

        圖4 24 h后不同分組中TPC-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)活性的Western blot實(shí)驗(yàn)分析

        自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)及非mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9],后者主要指L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Calpain是L型鈣依賴(lài)性的半胱氨酸蛋白酶,又可分為μ-calpain和m-calpain,二者均由1個(gè)80 kD左右的大片段及1個(gè)28 kD的小片段組成,對(duì)應(yīng)的80 kD大片段分別稱(chēng)為calpain 1和calpain 2,μ-calpain是L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起作用的主要蛋白酶[11]。Calpain可以特異性水解多種酶及蛋白。作為非mTOR依賴(lài)信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子,calpain可結(jié)合由細(xì)胞膜L型鈣離子通道進(jìn)入的及三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)釋放的Ca2+,進(jìn)而通過(guò)刺激型G蛋白的α亞單位(Gsα)通路激活環(huán)磷酸腺苷而抑制自噬[12];故L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)自噬起負(fù)調(diào)節(jié)作用。

        自噬相關(guān)蛋白LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母自噬蛋白ATG8的同源物,定位于前自噬泡和自噬泡膜表面,是細(xì)胞自噬泡膜的通用標(biāo)志物[13]。細(xì)胞中新合成的LC3蛋白經(jīng)過(guò)加工,成為胞漿可溶性LC3-I,后者經(jīng)泛素樣加工修飾過(guò)程,與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合,稱(chēng)為L(zhǎng)C3-II。LC3-II含量的多少在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。

        本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定TPC-1細(xì)胞的存活率,發(fā)現(xiàn)TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性與藥物濃度及藥物作用時(shí)間有關(guān), 與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[14-15]。同時(shí),也發(fā)現(xiàn)當(dāng)TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星耐受時(shí),加入不對(duì)細(xì)胞造成損害濃度的維拉帕米后導(dǎo)致TPC-1細(xì)胞的存活率降低,即能有效地對(duì)抗TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性。

        本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多柔比星組與空白對(duì)照組相比,TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流減弱,calpain 1的蛋白表達(dá)亦減弱,而LC3的自噬活性增強(qiáng),結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)中TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星耐受這個(gè)結(jié)果,可以認(rèn)為T(mén)PC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性與其自噬活性增強(qiáng)有關(guān),且可能有L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與。同時(shí),我們推測(cè)當(dāng)TPC-1細(xì)胞處在多柔比星這種毒性藥物的作用下,細(xì)胞受損,但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的適應(yīng),TPC-1細(xì)胞通過(guò)自噬活性的增強(qiáng)來(lái)保護(hù)自己,維持生存,從而產(chǎn)生了對(duì)多柔比星的抗性。

        有文獻(xiàn)報(bào)道維拉帕米本身就有增強(qiáng)自噬的作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)中,維拉帕米與空白對(duì)照組相比,TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流大幅降低,calpain 1的蛋白表達(dá)減弱,而LC3的蛋白表達(dá)增強(qiáng),結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)中TPC-1細(xì)胞的存活率未見(jiàn)明顯下降這個(gè)結(jié)果,可以得出維拉帕米可增強(qiáng)自噬,且可能有L-Ca2+/calpain 1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與的結(jié)論。這種自噬的增強(qiáng)未對(duì)細(xì)胞造成明顯損害。

        另外,多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比, TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流大幅降低,calpain 1的蛋白表達(dá)減弱,而LC3的自噬活性增強(qiáng),結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)中TPC-1細(xì)胞存活率明顯降低這個(gè)結(jié)果,可以得出結(jié)論,維拉帕米對(duì)抗TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性與自噬的進(jìn)一步增強(qiáng)有關(guān),可能有L-Ca2+/calpain 1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與。我們推測(cè),由于多柔比星與維拉帕米均能通過(guò)L-Ca2+/calpain 1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)自噬,導(dǎo)致自噬活性過(guò)度增強(qiáng),TPC-1細(xì)胞出現(xiàn)了自噬性死亡,故細(xì)胞存活率明顯下降。

        本實(shí)驗(yàn)不但找到了TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星產(chǎn)生抗性的原因及機(jī)制,還發(fā)現(xiàn)了維拉帕米對(duì)抗這種抗性的原因及機(jī)制。另外,本實(shí)驗(yàn)組還收集了PTC患者切下的大體標(biāo)本,與周?chē)=M織比較,發(fā)現(xiàn)了蛋白LC3及calpain 1表達(dá)的變化,不過(guò)將另文發(fā)表。這些結(jié)論可為PTC術(shù)后化療多柔比星與維拉帕米聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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        (責(zé)任編輯: 林白霜, 羅 森)

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        [文章編號(hào)] 1000- 4718(2016)10- 1788- 11

        Mechanism of L-Ca2+/calpain signal transduction in verapamil inversing resistance of papillary thyroid carcinoma to doxorubicin

        WANG Jun-bing1, 2, DING Xiang-dong2, ZHENG Yuan-yuan3, LIANG Ying-ying1, WANG Hao1, LI Guang-ming3, JIANG Ming-liang3, DONG Jun3

        (1PanyuCentralHospital,Guangzhou511400,China;2LimitedCorporationofGuangzhouJinyuMedicalExaminationCenter,Guangzhou510330,China;3SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:dongjunbox@163.com)

        AIM: To investigate the mechanism of L-type calcium channel (L-Ca2+)/calpain signal transduction pathway in verapamil inversing resistance of papillary thyroid carcinoma to doxorubicin. METHODS: Human papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells were cultured for 2 d. For determining the appropriate concentrations and treatment time of verapamil and doxorubicin, a compatibility test was conducted to detect the cell viability by CCK-8 assay. The cells were divided into control group, doxorubicin group, verapamil group and doxorubicin+verapamil group. The techniques of whole-cell patch-clamp was used to record L-Ca2+currents. The protein expression levels of calpain 1 and LC3 were detected by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the density of L-Ca2+current decreased in doxorubicin group and verapamil group (P<0.05). Compared with verapamil group, the density of L-Ca2+current decreased in doxorubicin+verapamil group (P<0.01). Compared with control group, the expression of calpain 1 decreased in doxorubicin group and verapamil group (P<0.05). Compared with doxorubicin group, the expression of calpain 1 decreased in doxorubicin+verapamil group (P<0.05). Compared with control group, the expression of LC3 increased in doxorubicin group and verapamil group (P<0.05). Compared with doxorubicin group, the expression of LC3 increased in doxorubicin+verapamil group (P<0.01). CONCLUSION: The drug resistance of TPC-1 cells to doxorubicin may be related to the increase in autophagic activity. Verapamil further increases autophagic activity of TPC-1 cells, resulting in autophagic death and inversing the resistance of TPC-1 cells to doxorubicin. The mechanism may be involved in L-Ca2+/calpain 1 signal transduction pathway of autophagy.

        Autophagy; Resistance; L-type calcium channel; Calpain; Papillary thyroid carcinoma

        1000- 4718(2016)10- 1782- 06

        2016- 06- 27

        2016- 09- 07

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81171134; No. 81471235);廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030313360); 廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 20141A011111); 廣州市番禺區(qū)科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2014-203-26); 高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃(No. B14036)

        △通訊作者 Tel: 020-85228289; E-mail: dongjunbox@163.com

        ▲并列第1作者

        R363.1

        A

        10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.009

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