汪軍兵， 丁向東， 鄭媛媛， 梁瑩瑩， 王 浩， 李光明， 江明亮， 董 軍△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400； 2廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司，廣東 廣州 510330； 3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

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維拉帕米逆轉(zhuǎn)乳頭狀甲狀腺癌對(duì)多柔比星抗性中的L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制*

汪軍兵1, 2▲， 丁向東2▲， 鄭媛媛3， 梁瑩瑩1， 王 浩1， 李光明3， 江明亮3， 董 軍3△

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400；2廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司，廣東 廣州 510330；3暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632)

目的： 探討維拉帕米逆轉(zhuǎn)乳頭狀甲狀腺癌對(duì)多柔比星抗性的L型鈣離子通道/鈣蛋白酶(L-Ca2+/calpain)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制。方法: 以培養(yǎng)2 d的人乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，首先以CCK-8分析法測(cè)定細(xì)胞存活率對(duì)維拉帕米和多柔比星進(jìn)行配伍試驗(yàn)，確定合適的藥物作用濃度及時(shí)間。然后將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、多柔比星組、維拉帕米組和多柔比星+維拉帕米組。以全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄TPC-1細(xì)胞的L-Ca2+通道電流，以Western blot法測(cè)定蛋白calpain 1及LC3的表達(dá)水平。結(jié)果: 多柔比星組、維拉帕米組與空白對(duì)照組相比，L-Ca2+通道電流密度減小(P<0.05)；多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比，L-Ca2+通道電流密度減小(P<0.01)。多柔比星組、維拉帕米組與空白對(duì)照組相比，calpain 1蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)；多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比，calpain 1蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)。多柔比星組和維拉帕米組與空白對(duì)照組相比，LC3蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)；多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比，LC3蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論: TPC-1細(xì)胞抗多柔比星可能與其自噬活性增強(qiáng)有關(guān)；維拉帕米能進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性，致自噬性細(xì)胞死亡，從而對(duì)抗TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性，其機(jī)制可能與自噬的L-Ca2+/calpain 1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

自噬； 抗性； L型鈣離子通道； 鈣蛋白酶； 乳頭狀甲狀腺癌

全世界范圍內(nèi)，甲狀腺癌在過(guò)去的幾十年間呈持續(xù)增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最常見(jiàn)的甲狀腺惡性腫瘤，占甲狀腺惡性腫瘤的85%～90%[1]。PTC生物學(xué)行為表現(xiàn)為易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)，約有20%～50%的PTC患者早期即發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，14%的PTC患者復(fù)發(fā)[2]。對(duì)于進(jìn)展型PTC轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的患者，目前手術(shù)及放療難以根治，因此找到一個(gè)好的根治方法的任務(wù)就顯得尤為迫切。

進(jìn)展型PTC通常在放療后使用多柔比星進(jìn)行化療，不幸的是，PTC對(duì)多柔比星的化療高度抵抗[3-4]。文獻(xiàn)顯示PTC對(duì)多柔比星抗性的產(chǎn)生與PTC自噬保護(hù)作用有關(guān)，自噬過(guò)度激活所致的自噬性死亡可能是PTC治療的一個(gè)有效途徑[5]。

細(xì)胞有多條自噬通路，L型鈣離子通道(L-type calcium channel, L-Ca2+)/鈣蛋白酶(calpain)通路是其中一條重要途徑，它對(duì)自噬起負(fù)調(diào)節(jié)作用[6]。維拉帕米是臨床常用的L型Ca2+通道阻斷劑，具有降血壓的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，維拉帕米可增強(qiáng)自噬活性[7-8]。我們猜想能否通過(guò)使用維拉帕米來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)多柔比星作用的PTC細(xì)胞的自噬活性，使PTC出現(xiàn)自噬性死亡，從而消除PTC對(duì)多柔比星的抗性，提高PTC患者的治愈率。為驗(yàn)證此假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)以人PTC細(xì)胞株TPC-1為研究對(duì)象，探討PTC對(duì)多柔比星產(chǎn)生抗性的通路機(jī)制，并探討維拉帕米是否能逆轉(zhuǎn)這種抗性及其機(jī)制，為PTC術(shù)后化療中多柔比星與維拉帕米聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

多柔比星及維拉帕米購(gòu)自Sigma；血清購(gòu)自四季青生物有限公司；胰酶購(gòu)自Gibco；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自HyClone；抗LC3、calpain 1及GAPDH抗體購(gòu)自Abcam；TPC-1細(xì)胞購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。膜片鉗電極外液組成(mmol/L)： NaCl 120, CsCl 5, TEA-Cl 10, BaCl210, HEPES 10, MgCl21, TTX 0.0005；膜片鉗電極內(nèi)液組成(mmol/L)：CsCl 120, MgCl22, Na2ATP 5, HEPES 10, Glucose 11, EGTA 11。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 TPC-1細(xì)胞生長(zhǎng)于RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液中，介質(zhì)中加入10%胎牛血清和1%青、鏈霉素，用細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每天換液1次，待單層培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)匯合以后，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)后，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞即將匯合時(shí)開(kāi)始加藥。本實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、多柔比星組、維拉帕米組和多柔比星+維拉帕米組。

2.2 CCK-8法測(cè)定TPC-1細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞, 經(jīng)胰酶消化分散記數(shù)后, 稀釋到4×108/L，接種于96孔培養(yǎng)板中, 每孔180 μL。培養(yǎng)至單層細(xì)胞即將匯合時(shí)加藥。各孔終體積為200 μL，體積不足者以相應(yīng)培養(yǎng)基補(bǔ)足。每一組設(shè)6個(gè)平行孔，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加不同濃度藥物并培養(yǎng)不同時(shí)間后 , 棄去培養(yǎng)液; 每孔加入CCK-8試劑(臨用前以PBS 配成0.5 g/L)100 μL ， 培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，足夠?qū)嶒?yàn)時(shí)間后，于30 min內(nèi)在Bio-Rad 3350型酶標(biāo)儀上讀取490 nm處的吸光度(A)值。不加藥只含CCK-8試劑孔細(xì)胞的吸光度值減去空白孔的吸光度值作為基本對(duì)照 , 實(shí)驗(yàn)孔吸光度值減去空白孔吸光度值與之相比得到各自的細(xì)胞存活率。公式為：

細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(只含CCK-8對(duì)照孔A值-空白孔A值)×100%。

2.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流 玻璃毛坯經(jīng)P97微電極拉制儀經(jīng)3步法拉制成尖端直徑為2～3 μm的電極，沖灌電極內(nèi)液。換上電極外液，將皿置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，20倍物鏡找到胞體光亮飽滿的TPC-1細(xì)胞，安裝好沖灌玻璃微電極并在電壓鉗模式下用微操縱器引導(dǎo)玻璃微電極靠近細(xì)胞。將微電極尖端調(diào)整至胞體正上方，然后在持續(xù)正壓的同時(shí)讓電極尖端緩慢靠近細(xì)胞，待電極尖端接觸細(xì)胞表面時(shí)，輕輕給予電極內(nèi)負(fù)壓，形成高阻封接(1 GΩ)，此時(shí)形成貼附式膜片，正確補(bǔ)償電容，再給予負(fù)壓吸破電極尖端的細(xì)胞膜，補(bǔ)償電容電流和串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞膜片鉗，穩(wěn)定3～5 min進(jìn)行記錄。電流信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，數(shù)據(jù)經(jīng)Digtal 1320A轉(zhuǎn)換器記錄。記錄時(shí)，將高阻封接的細(xì)胞電位鉗制在-50 mV持續(xù)300 ms，階躍10 mV的10個(gè)去極化電壓鉗制記錄L型Ca2﹢通道電流-電壓曲線。實(shí)驗(yàn)中鉗制電壓和電路電阻隨時(shí)被檢測(cè)，只有基線、鉗制電壓和電路電阻穩(wěn)定的數(shù)據(jù)才被納入分析數(shù)據(jù)。

2.4 Western blot法測(cè)定calpain 1及LC3的蛋白表達(dá) 收集總蛋白，按說(shuō)明書(shū)步驟提取總蛋白，用BCA法蛋白定量，蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜后，分別加入抗 calpain 1、LC3和GAPDH抗體，抗體用含5%BSA稀釋?zhuān)鄳?yīng)濃度均為1∶1 000，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的II抗，37 ℃孵育1 h。TBST洗膜后，ECL發(fā)光試劑檢測(cè)蛋白印跡條帶，光密度掃描膠片，Image-Pro Plus 6.0軟件分析結(jié)果。以LC3-Ⅱ的灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比值來(lái)表示蛋白LC3的表達(dá)活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCK-8法測(cè)定TPC-1細(xì)胞的細(xì)胞存活率

1.1 進(jìn)行藥物配伍實(shí)驗(yàn)，確定藥物的合適實(shí)驗(yàn)濃度及時(shí)間 以CCK-8測(cè)定TPC-1細(xì)胞的存活率，使用96孔板，每組設(shè)6個(gè)平行孔，對(duì)應(yīng)孔取平均值。首先以不同濃度(0.25 μmol/L、0.5 μmol/L、0.75 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L)的多柔比星分別作用于TPC-1細(xì)胞不同時(shí)間(2 h、6 h、12 h、24 h)。發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，低濃度短時(shí)間的多柔比星對(duì)TPC-1細(xì)胞的存活率無(wú)多大影響，隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)和藥物濃度加大，細(xì)胞存活率逐漸下降，在2 h、6 h、12 h、24 h這4個(gè)時(shí)點(diǎn)均出現(xiàn)細(xì)胞存活率先減弱后增強(qiáng)現(xiàn)象，對(duì)應(yīng)2 h、6 h、12 h的細(xì)胞存活率最低點(diǎn)的多柔比星的濃度分別為1 μmol/L、0.75 μmol/L、0.5 μmol/L。前述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星具有抗性。然后，我們以不同濃度(1 μmol/L、2 μmol/L、3 μmol/L、7 μmol/L、8 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L)的維拉帕米作用于TPC-1細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)TPC-1細(xì)胞的細(xì)胞存活率從3 μmol/L開(kāi)始下降，濃度越高下降幅度越大，這說(shuō)明高濃度的維拉帕米對(duì)細(xì)胞有損害作用。綜合前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選定藥物作用時(shí)間為24 h，多柔比星的作用濃度為1 μmol/L，維拉帕米的作用濃度為3 μmol/L。

1.2 觀察維拉帕米能否逆轉(zhuǎn)TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性 作用時(shí)間與藥物濃度同上，實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、多柔比星組、維拉帕米組和多柔比星組+維拉帕米組。各組的細(xì)胞存活率分別為(100.0±0.0)%、(89.1±4.7)%、(99.0±5.2)%和(52.3±2.6)%。多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。這說(shuō)明維拉帕米能有效對(duì)抗TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The viability of the TPC-1 cells in different groups at 24 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsdoxorubicin group.

圖1 24 h后不同分組TPC-1細(xì)胞存活率的變化

2 維拉帕米對(duì)加入多柔比星后TPC-1細(xì)胞L型鈣離子通道電流峰值的影響

由電壓步階產(chǎn)生的內(nèi)向L型鈣離子通道電流在加藥24 h后被記錄，從-50 mV～+40 mV的電壓步階產(chǎn)生的L型Ca2+通道電流在空白對(duì)照組、多柔比星組、維拉帕米組和多柔比星+維拉帕米組經(jīng)膜電容標(biāo)化后峰值電流密度(pA/pF)分別為-20.76±0.98、-15.18±0.74、-4.58±0.22和-3.61±0.17；多柔比星組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，說(shuō)明多柔比星可使TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流減弱；維拉帕米組與空白對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，說(shuō)明維拉帕米可有效地阻斷TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流；多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，說(shuō)明維拉帕米可有效地阻斷受多柔比星作用的TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The effect of verapamil on peak L-type calcium channel current (ICa, L) in TPC-1 cells treated with doxorubicin. A: voltage steps of L-type calcium channel; B: average peak current amplitude in different groups; C: I-V curves of peak current density in different groups; D: the quantitative analysis of peak current density in different groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsdoxorubicin group.

圖2 維拉帕米對(duì)加入多柔比星后TPC-1細(xì)胞L型鈣離子通道電流峰值的影響

3 不同分組中TPC-1細(xì)胞calpain 1蛋白表達(dá)的Western blot實(shí)驗(yàn)分析

與空白對(duì)照組相比較，多柔比星組calpain 1的蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)，維拉帕米組calpain 1的蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)；與多柔比星組相比較，多柔比星+維拉帕米組calpain 1的蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 不同分組中TPC-1細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)活性的Western blot實(shí)驗(yàn)分析

與空白對(duì)照組相比較，多柔比星組LC3的蛋白表達(dá)活性增強(qiáng)(P<0.05)，維拉帕米組LC3的蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)；與多柔比星組相比較，多柔比星+維拉帕米組LC3的蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

討 論

自噬，又稱(chēng)Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞內(nèi)某些胞質(zhì)成分通過(guò)一系列嚴(yán)格調(diào)控的途徑，最后被溶酶體內(nèi)蛋白酶降解，釋放出大分子物質(zhì)再循環(huán)的過(guò)程。自噬具有雙重功能：當(dāng)自噬在對(duì)不同形式的細(xì)胞應(yīng)激作出反應(yīng)時(shí)自噬可被快速上調(diào)，這種快速的自噬誘導(dǎo)可以通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及毒性代謝分子，并通過(guò)產(chǎn)生維持細(xì)胞重要功能所必需的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)件的方式以利于細(xì)胞的生存[9]，但自噬的持續(xù)過(guò)度性激活也可導(dǎo)致細(xì)胞最終發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡[10]。

Figure 3.Western blot analysis of calpain 1 protein expression in the TPC-1 cells with different treatments after 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsdoxorubicin group.

圖3 24 h后不同分組中TPC-1細(xì)胞calpain 1蛋白表達(dá)的Western blot實(shí)驗(yàn)分析

Figure 4.Western blot analysis of autophagy-related protein LC3 expression in the TPC-1 cells with different treatments after 24 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsdoxorubicin group.

圖4 24 h后不同分組中TPC-1細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)活性的Western blot實(shí)驗(yàn)分析

自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及非mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]，后者主要指L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Calpain是L型鈣依賴(lài)性的半胱氨酸蛋白酶，又可分為μ-calpain和m-calpain，二者均由1個(gè)80 kD左右的大片段及1個(gè)28 kD的小片段組成，對(duì)應(yīng)的80 kD大片段分別稱(chēng)為calpain 1和calpain 2，μ-calpain是L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起作用的主要蛋白酶[11]。Calpain可以特異性水解多種酶及蛋白。作為非mTOR依賴(lài)信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子，calpain可結(jié)合由細(xì)胞膜L型鈣離子通道進(jìn)入的及三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)釋放的Ca2+，進(jìn)而通過(guò)刺激型G蛋白的α亞單位(Gsα)通路激活環(huán)磷酸腺苷而抑制自噬[12]；故L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)自噬起負(fù)調(diào)節(jié)作用。

自噬相關(guān)蛋白LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母自噬蛋白ATG8的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，是細(xì)胞自噬泡膜的通用標(biāo)志物[13]。細(xì)胞中新合成的LC3蛋白經(jīng)過(guò)加工，成為胞漿可溶性LC3-I，后者經(jīng)泛素樣加工修飾過(guò)程，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，稱(chēng)為L(zhǎng)C3-II。LC3-II含量的多少在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定TPC-1細(xì)胞的存活率，發(fā)現(xiàn)TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性與藥物濃度及藥物作用時(shí)間有關(guān), 與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[14-15]。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)當(dāng)TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星耐受時(shí)，加入不對(duì)細(xì)胞造成損害濃度的維拉帕米后導(dǎo)致TPC-1細(xì)胞的存活率降低，即能有效地對(duì)抗TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多柔比星組與空白對(duì)照組相比，TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流減弱，calpain 1的蛋白表達(dá)亦減弱，而LC3的自噬活性增強(qiáng)，結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)中TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星耐受這個(gè)結(jié)果，可以認(rèn)為T(mén)PC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性與其自噬活性增強(qiáng)有關(guān)，且可能有L-Ca2+/calpain信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與。同時(shí)，我們推測(cè)當(dāng)TPC-1細(xì)胞處在多柔比星這種毒性藥物的作用下，細(xì)胞受損，但經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的適應(yīng)，TPC-1細(xì)胞通過(guò)自噬活性的增強(qiáng)來(lái)保護(hù)自己，維持生存，從而產(chǎn)生了對(duì)多柔比星的抗性。

有文獻(xiàn)報(bào)道維拉帕米本身就有增強(qiáng)自噬的作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)中，維拉帕米與空白對(duì)照組相比，TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流大幅降低，calpain 1的蛋白表達(dá)減弱，而LC3的蛋白表達(dá)增強(qiáng)，結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)中TPC-1細(xì)胞的存活率未見(jiàn)明顯下降這個(gè)結(jié)果，可以得出維拉帕米可增強(qiáng)自噬，且可能有L-Ca2+/calpain 1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與的結(jié)論。這種自噬的增強(qiáng)未對(duì)細(xì)胞造成明顯損害。

另外，多柔比星+維拉帕米組與多柔比星組相比， TPC-1細(xì)胞的L型鈣離子通道電流大幅降低，calpain 1的蛋白表達(dá)減弱，而LC3的自噬活性增強(qiáng)，結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)中TPC-1細(xì)胞存活率明顯降低這個(gè)結(jié)果，可以得出結(jié)論，維拉帕米對(duì)抗TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星的抗性與自噬的進(jìn)一步增強(qiáng)有關(guān)，可能有L-Ca2+/calpain 1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與。我們推測(cè)，由于多柔比星與維拉帕米均能通過(guò)L-Ca2+/calpain 1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增強(qiáng)自噬，導(dǎo)致自噬活性過(guò)度增強(qiáng)，TPC-1細(xì)胞出現(xiàn)了自噬性死亡，故細(xì)胞存活率明顯下降。

本實(shí)驗(yàn)不但找到了TPC-1細(xì)胞對(duì)多柔比星產(chǎn)生抗性的原因及機(jī)制，還發(fā)現(xiàn)了維拉帕米對(duì)抗這種抗性的原因及機(jī)制。另外，本實(shí)驗(yàn)組還收集了PTC患者切下的大體標(biāo)本，與周?chē)＝M織比較，發(fā)現(xiàn)了蛋白LC3及calpain 1表達(dá)的變化，不過(guò)將另文發(fā)表。這些結(jié)論可為PTC術(shù)后化療多柔比星與維拉帕米聯(lián)合應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

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[文章編號(hào)] 1000- 4718(2016)10- 1788- 11

Mechanism of L-Ca2+/calpain signal transduction in verapamil inversing resistance of papillary thyroid carcinoma to doxorubicin

WANG Jun-bing1, 2, DING Xiang-dong2, ZHENG Yuan-yuan3, LIANG Ying-ying1, WANG Hao1, LI Guang-ming3, JIANG Ming-liang3, DONG Jun3

(1PanyuCentralHospital,Guangzhou511400,China;2LimitedCorporationofGuangzhouJinyuMedicalExaminationCenter,Guangzhou510330,China;3SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:dongjunbox@163.com)

AIM: To investigate the mechanism of L-type calcium channel (L-Ca2+)/calpain signal transduction pathway in verapamil inversing resistance of papillary thyroid carcinoma to doxorubicin. METHODS: Human papillary thyroid carcinoma TPC-1 cells were cultured for 2 d. For determining the appropriate concentrations and treatment time of verapamil and doxorubicin, a compatibility test was conducted to detect the cell viability by CCK-8 assay. The cells were divided into control group, doxorubicin group, verapamil group and doxorubicin+verapamil group. The techniques of whole-cell patch-clamp was used to record L-Ca2+currents. The protein expression levels of calpain 1 and LC3 were detected by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the density of L-Ca2+current decreased in doxorubicin group and verapamil group (P<0.05). Compared with verapamil group, the density of L-Ca2+current decreased in doxorubicin+verapamil group (P<0.01). Compared with control group, the expression of calpain 1 decreased in doxorubicin group and verapamil group (P<0.05). Compared with doxorubicin group, the expression of calpain 1 decreased in doxorubicin+verapamil group (P<0.05). Compared with control group, the expression of LC3 increased in doxorubicin group and verapamil group (P<0.05). Compared with doxorubicin group, the expression of LC3 increased in doxorubicin+verapamil group (P<0.01). CONCLUSION: The drug resistance of TPC-1 cells to doxorubicin may be related to the increase in autophagic activity. Verapamil further increases autophagic activity of TPC-1 cells, resulting in autophagic death and inversing the resistance of TPC-1 cells to doxorubicin. The mechanism may be involved in L-Ca2+/calpain 1 signal transduction pathway of autophagy.

Autophagy; Resistance; L-type calcium channel; Calpain; Papillary thyroid carcinoma

1000- 4718(2016)10- 1782- 06

2016- 06- 27

2016- 09- 07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81171134； No. 81471235)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2014A030313360)； 廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 20141A011111)； 廣州市番禺區(qū)科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2014-203-26)； 高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃(No. B14036)

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