張穎

(西安市第九醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710054)

·論著·

線粒體單倍群亞型分布與特發(fā)性癲癇的關系

張穎*

(西安市第九醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710054)

目的研究線粒體DNA(mtDNA)單倍群亞型與特發(fā)性癲癇易感的關系。方法收集特發(fā)性癲癇患者尿液標本45例，健康對照組尿液標本31例，提取尿液脫落細胞基因組，采用聚合酶鏈式反應(PCR)、Sanger測序法進行線粒體全基因組測序，測序結果與美國國立生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中正常人線粒體基因組(NC_012920.1)比對，使用MitoTool軟件分析患者線粒體單倍群。結果單倍群分析結果顯示45例特發(fā)性癲癇患者中23(51.1%)例為mtDNA單倍群N型，22(48.9%)例為mtDNA單倍群M型。31例健康對照中14(45.2%)例為mtDNA單倍群N型，17(54.8%)例為mtDNA單倍群M型。兩組mtDNA單倍群M和N的頻率無顯著差異(Plt;0.05)。結論本研究中全部個體單倍群類型符合亞洲地區(qū)線粒體單倍群分布特點，尚不能明確線粒體單倍群亞型分布與特發(fā)性癲癇易感有相關性。

癲癇; 線粒體; 單倍群

癲癇是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，影響了世界上2%的人口[1]。特發(fā)性癲癇(idiopathic epilepsies，IE)，又稱原發(fā)性癲癇，與遺傳因素有密切關系。自1963年Nass等人發(fā)現(xiàn)線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)以來，已有大量的研究證實線粒體基因突變與多種疾病相關，包括癲癇在內(nèi)的許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病。很多線粒體DNA突變所致疾病都會伴有癲癇發(fā)作，Leber遺傳性視神經(jīng)病(leber hereditary optic neuropathy, LHON)就是最早被證實的線粒體疾病，還有較常見的線粒體腦肌病并發(fā)乳酸酸中毒及中風樣發(fā)作(mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and a stroke-like episode, MELAS)、肌陣攣性癲癇和破碎紅纖維(myoclonic rpilepsy and ragged red fibers, MERRF)和KSS綜合征(kearns-sayre syndrome)等[2]。除此之外還有很多其他的綜合征也合并癲癇發(fā)作[3]。線粒體DNA呈母系遺傳，在不同民族間mtDNA的多態(tài)性頻率有差異，在遺傳學上依據(jù)mtDNA的差異而定義出一些單倍型，可使研究者追索母系遺傳的人類起源[4]。因此我們從線粒體基因入手，探討線粒體單倍型與特發(fā)性癲癇易感性的關系。

對象與方法

一、病例及標本

在2014年9月至2015年6月，于我院癲癇?？崎T診就診，經(jīng)臨床癥狀、影像學檢查及MRI確診為特發(fā)性癲癇的患者45例，采集其尿液為檢測標本。同時選取本院同期接受體檢的正常人群31例，無癲癇家族史，經(jīng)規(guī)范檢查確定排除神經(jīng)系統(tǒng)疾病，采集其尿液標本為對照組。本研究所有研究對象均來自漢族人群，均簽署知情同意書。

二、基因檢測方法

采用全基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Micro DNA Kit)，提取尿道脫落細胞中的DNA，參照文獻設計24對引物[5]，使用聚合酶鏈反應擴增線粒體基因組全部序列，共16519個堿基，擴增產(chǎn)物以Sanger測序法直接測序。

三、測序結果分析

測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫中正常人線粒體基因組(NC_012920.1)比對，參照人類線粒體基因組數(shù)據(jù)庫尋找突變位點。線粒體單倍群分析使用MitoTool軟件。

四、統(tǒng)計分析

統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件包的t檢驗和卡方檢驗，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

45例特發(fā)性癲癇患者中，男性30例，女性15例，年齡為5～41歲，病史為3～8年，31例健康對照中，男性19例，女性12例，年齡為8～45歲，均為漢族，兩組人群在性別、年齡等方面比較差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)(性別的比較行χ2檢驗，年齡的比較行t檢驗)，具有可比性(表1)。單倍群分析結果顯示，本研究中所有個體均可明確地歸屬為單倍群M及N的亞群(表2,3)，群N在病例組中的頻率為51.1%，在對照組中的頻率為45.2%，群M在病例組中的頻率為48.9%，在對照組中的頻率為54.8%，兩組mtDNA單倍群M和N的頻率無顯著差異(Pgt;0.05)(行χ2檢驗)(表4)。

討 論

線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位，是糖類、脂肪和蛋白質(zhì)最終氧化釋放能量的場所[6]，線粒體是真核細胞的重要細胞器，正常細胞內(nèi)有多個線粒體，每個線粒體擁有2～10個DNA分子[7]。mtDNA分子為環(huán)狀雙鏈DNA分子，包含16569個堿基，組成37個基因，編碼的22個tRNA和2個rRNA參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，編碼的13個多肽參與線粒體ATP的合成。mtDNA中各基因排列緊密，沒有內(nèi)含子，利用率極高，任何區(qū)域的突變都可能會影響線粒體功能，mtDNA與核基因組DNA不同，mtDNA缺乏內(nèi)含子和組蛋白的保護，更易發(fā)生氧化性損傷，其突變率較核DNA高10～20倍[8]，線粒體細胞內(nèi)氧化應激的平衡會影響mtDNA的生物合成，導致mtDNA突變和水平的改變，使細胞能量生成不足，甚至誘導細胞凋亡，最終出現(xiàn)器官功能障礙而致病[9,10]。

線粒體DNA呈母系遺傳，在不同人群間mtDNA的多態(tài)性頻率有差異，在遺傳學上依據(jù)mtDNA的差異而定義出一些單倍型，Torroni等將共享有某個或某些穩(wěn)定位點突變的所有單倍型的集合定義為單倍群[11]。Walace等構建了完整的mtDNA亞洲系統(tǒng)發(fā)生樹，這一系統(tǒng)發(fā)生樹顯示所有的亞洲人mtDNA都可利用10 394位點上多態(tài)造成的Dde I酶切位點和在10 397位點上的Alu I酶切位點存在與否分成兩大類，如果這兩個位點都存在，單倍型組就稱為M聚類，包括C、D、E、G單倍群，而同時缺乏這兩個酶切位點的mtDNA為另一聚類N，包括單倍群A、B、F[12]。2014年mtDNA系統(tǒng)發(fā)生樹被更新完善，M群及N群也增加了Q、H等很多新的亞型。本研究中單倍群分析結果顯示，病例組及對照組的全部個體中不存在單倍群N和M以外的類型，符合亞洲地區(qū)線粒體單倍群分布特點。

本試驗研究對象均來源于中國西北地區(qū)的漢族人群，要檢測一個人群，一個種族的單倍型頻率，需要進行大樣本試驗，而我們的研究對象僅局限于本院門診患者以及體檢者，總例數(shù)才76例，遠遠達不到要求，而且由于樣本量太少，Pgt;0.05，差異無統(tǒng)計學意義，更無法進行年齡以及性別分層統(tǒng)計。因此，需要進一步擴大樣本研究來證實mtDNA單倍型與特發(fā)性癲癇致病危險的關系。目前，特發(fā)性癲癇的發(fā)病機理中，mtDNA突變在不同種族、人群、性別中作用的差異，是原發(fā)還是繼發(fā)，以及與環(huán)境暴露、年齡老化等因素的作用等仍未能闡明。因此，還需要大量研究來逐漸弄清這些機理。

表1 45例特發(fā)性癲癇患者基本信息

GroupSexMaleFemale AgeDurationofseizure Idiopathicepilepsy30(66．7%)15(33．3%)16．82±8．748．38±4．19 Control19(61．3%)12(38．7%)a17．73±8．13b?

aPgt;0.05,vsidiopathic epilepsy;bPgt;0.05,vsidiopathic epilepsy.

表2 45例特發(fā)性癲癇患者線粒體單倍群分析結果

Tab 2 mtDNA haplogroup analysis of 45 cases of patients with idiopathic epilepsy

mtDNAhaplogroupCase(%)mtDNAhaplogroupCase(%) N M R1M72 R111M81 B47M91 B51M201 B61C11 F15C71 F23G22 F31Z31 J11D48 N92D54 Total23(48．9)22(51．1)

表3 31例健康對照者線粒體單倍群分析結果

Tab 3 mtDNA haplogroup analysis of 31 cases of control group

mtDNAhaplogroupCase(%)mtDNAhaplogroupCase(%) N M R12M73 R51M101 B43M132 B81M171 T21M271 F11C41 F41C71 J11E11 N51G31 N91D43 A11D51 D61 Total14(45．2)17(54．8)

表4 mtDNA單倍群與特發(fā)性癲癇易感性的關聯(lián)研究

Tab 4 The association between mtDNA haplogroup and idiopathic epilepsy

GroupMN Idiopathicepilepsy51．1%(22/45)48．9%(23/45) Control54．8%(17/31)45．2%(14/31)

1Thurman DJ, Beghi E, Begley CE, et al. Standards for epidemiologic studies and surveillance of epilepsy [J]. Epilepsia, 2011, 52 Suppl 7: 2-26.

2Liolitsa D, Rahman S, Benton S, et al. Is the mitochondrial complex I ND5 gene a hot-spot for MELAS causing mutations ? [J]. Ann Neurol, 2003, 53(1): 128-132.

3Lee YM, Kang HC, Lee JS, et al. Mitochondrial respiratory chain defects: underlying etiology in various epileptic conditions [J]. Epilepsia, 2008, 49(4): 685-690.

4Cao Y, Wan LH, Gu LG, et al. Heteroplasmy in human mtDNA control region [J]. Fa Yi Xue Za Zhi, 2006, 22(3): 190-192.

5Rieder MJ, Taylor SL, Tobe VO, et al. Automating the identification of DNA variations using quality-based fluorescence re-sequencing: analysis of the human mitochondrial genome [J]. Nucleic Acids Res, 1998, 26(4): 967-973.

6Picard M, Taivassalo T, Gouspillou G, et al. Mitochondria: isolation, structure and function [J]. J Physiol, 2011, 589(Pt 18): 4413-4421.

7Detmer SA, Chan DC. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8(11): 870-879.

8White DJ, Wolff JN, Pierson M, et al. Revealing the hidden complexities of mtDNA inhentance [J]. MoI Ecol, 2008, 17(23): 4925-4942.

9Martinc B, Grabnar I, Vovk T. The role of reactive species in epileptogenesis and influence of antiepileptic drug therapy on oxidative stress [J]. Curr Neuropharmacol, 2012, 10(4): 328-343.

10Sack GJ. Introduction to the mini-review series on mitochondrial matters in epilepsy [J]. J Bioenerg Biomembr, 2010, 42(6): 441-442.

11Wallace DC, Brown MD, Lott MT. Mitochondrial DNA variation in human evolution and disease [J]. Gene, 1999, 238(1): 211-230.

12Torroni A, Schurr TG, Cabell MF, et al. Asian affinities and continental radiation of the four founding Native American mtDNAs [J]. Am J Hum Genet, 1993, 53(3): 563-590.

Correlationbetweenmitochondriahaplogroupsubtypedistributionandidiopathicepilepsy

ZHANGYing

DepartmentofNeurology,NinthHospitalofXi'an,Xi'an710054, China

ObjectiveThe correlation between mitochondrial DNA (mtDNA) haplogroup subtype and idiopathic epilepsy susceptibility was studied.MethodsUrine specimens from 45 idiopathic epilepsy patients and 31 samples from healthy controls were collected and then urine exfoliated cells genome was extracted to make sequencing for complete mitochondrial genome by polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing. The sequencing results were compared with normal mitochondrial genome (NC_012920.1) in National Center for Biotechnology Information (NCBI) database, and mitochondrial haplogroup of patients was analyzed with software MitoTool.ResultsAnalysis result of haplogroup showed 23 (51.1%) of 45 idiopathic epilepsy patients were mtDNA haplogroup N type, and 22 (54.8%) cases were mtDNA haplogroup M type; 14 (45.2%) cases of 31 healthy controls were mtDNA haplogroup N type, and 17 (54.8%) were mtDNA haplogroup M type. The frequency of two groups-mtDNA haplogroup M and N had no significant difference (Plt;0.05).ConclusionIn the study, all individual haplogroup type is consistent with the distribution characteristics of mitochondria haplogroup in Asia region, and it is not clear yet that there is a correlation between mitochondria haplogroup subtype distribution and idiopathic epilepsy susceptibility.

Epilepsy; Mitochondria; Haplogroup

1671-2897(2016)15-414-03

R 971.6

A

張穎，主治醫(yī)師，E-mail：1968494628@qq.com

*通訊作者：張穎，主治醫(yī)師，E-mail：1968494628@qq.com

2016-05-01；

2016-09-10)