董倫 宿建輝 王曉東* 張恒柱 韓崇旭 魏民

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院: 1神經(jīng)外科; 2醫(yī)務(wù)處; 3中心實驗室, 江蘇 揚(yáng)州 225001)

·腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤研究·

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者外周血中miRNA特異性表達(dá)研究

董倫1宿建輝2王曉東1*張恒柱1韓崇旭3魏民1

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院:1神經(jīng)外科;2醫(yī)務(wù)處;3中心實驗室, 江蘇 揚(yáng)州 225001)

目的檢測GBM患者和健康人外周血中miRNA的異常表達(dá)。方法利用基因芯片分析GBM患者和正常對照者血清中miRNA的表達(dá)量，然后進(jìn)一步進(jìn)行靶基因的生物信息學(xué)分析。結(jié)果miRNA芯片表明在血清中15例GBM組和15例正常對照組的外周血miRNA表達(dá)有明顯差異。752種miRNA中，GBM組有95種miRNA表達(dá)上調(diào)，22種表達(dá)下調(diào)。(倍數(shù)≥2.0,Plt;0.01)。通過深入分析，我們發(fā)現(xiàn)GBM患者miR-576-5p、miR-340和miR-626過表達(dá)，但 miR-320、let-7g-5p、miR-7-5p低表達(dá)。進(jìn)一步相關(guān)生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，他們在腦膠質(zhì)瘤信號通路的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。結(jié)論與正常人比較，以上6種miRNA在GBM患者外周血中有顯著差異。外周血中的miRNA表達(dá)譜中一些特異性表達(dá)的miRNA可能作為高特異性和靈敏度診斷膠質(zhì)瘤的新靶向標(biāo)志物。

膠質(zhì)瘤; 微小RNA; 基因芯片; 外周血

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科臨床工作中最常見的原發(fā)性顱內(nèi)惡性腫瘤。其發(fā)病機(jī)制不明確，迄今仍缺乏早期準(zhǔn)確、客觀、系統(tǒng)的診斷指標(biāo)。膠質(zhì)瘤的形成與發(fā)展是一個復(fù)雜的過程[1]。美國在2010對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分子分型進(jìn)行了報告。但在膠質(zhì)瘤的研究領(lǐng)域內(nèi)的早期診斷領(lǐng)域的研究仍極其薄弱。目前已經(jīng)證實，miRNA在組織和細(xì)胞中的表達(dá)表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性。將健康人外周血中的miRNA(microRNA微小RNA)視為正常miRNA作為參照， miRNA在外周血中的表達(dá)同樣具有腫瘤相關(guān)性和組織特異性，同時與RNA比較，其表達(dá)穩(wěn)定性更為顯著[2]。惡性膠質(zhì)母細(xì)胞血液中miRNA檢測罕見報告[3]。因此，對開展對該領(lǐng)域的研究對膠質(zhì)瘤的早期診斷及治療有及其重要的意義。我們擬應(yīng)用miRNA芯片篩選出血液系統(tǒng)與惡性膠質(zhì)母細(xì)胞發(fā)生可能相關(guān)的候選miRNA，提出表達(dá)差異最大的miRNA作為惡性膠質(zhì)母細(xì)胞標(biāo)志物的假設(shè)，為確立膠質(zhì)瘤的無創(chuàng)診、治療及預(yù)后評估診斷提供新方法。

材料與方法

一、樣品制備和RNA的提取

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)患者15例循環(huán)血液樣本， 15例年齡和性別匹配的健康自愿者作為對照組?；颊吆炇鹬橥鈺瑯颖臼占⒈４嬖谝旱?。用19號針頭采集血漿制備含0.129檸檬酸鈉( 1體積的抗凝血和9體積全血)抗凝血漿標(biāo)本2 000 g在真空采血管22℃離心15 min，轉(zhuǎn)移到在1 ml等分的無菌冷凍管并儲存于-70℃直至進(jìn)一步分析。利用miRNeasy Mini Kits從血漿中提取RNA。樣品通過氯仿提取，乙醇沉淀，轉(zhuǎn)移至的RNeasy Mini試管，根據(jù)制造商說明書洗脫。RNA洗脫液在50 μl無RNA酶的水中。

二、MicroRNAs實時熒光定量PCR陣列標(biāo)記及雜交

基因芯片采用Ⅰ+Ⅱ v3(752 miRNA)miRCURY LNATM普通的RT miRNA PCR陣列。它們用于分析低水平表達(dá)miRNA的血漿樣品的敏感性有特殊的優(yōu)勢。DS-cDNA(雙鏈cDNA)序列的合成。利用miRCURY LNATM普通的RT microRNA PCR試劑盒 (Exiqon, Vedbaek公司, 丹麥)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按說明取10 μl樣品進(jìn)行PCR。對照組包括六個參照基因，其中包括3小microRNA[hsa-miR-103, hsa-miR-191 and hsa-miR-423-5p, 3個small RNA，U6, 核仁小分子38B (SNORD38B)and核仁小分子RNAD49(SNORD49)]。芯片雜交溫度42℃，16～20 h。雜交后，使用NimbleGen(NimbleGen公司, 美國)的洗滌緩沖液試劑盒洗滌。

三、圖像采集和數(shù)據(jù)分析

基因Pix4000B芯片掃描儀進(jìn)行掃描，在5 μm/像素分辨率，GenePix4000B掃描儀(分子設(shè)備公司)掃描熒光強(qiáng)度，然后將掃描圖像TIFF格式(Tagged Image File Format, TIFF)輸入基因Pix PRO 6.0軟件進(jìn)行表達(dá)數(shù)據(jù)分析。然后導(dǎo)入NimbleScan(Nimble掃描器)，通過分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化并將數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范。所有的mRNA水平數(shù)據(jù)然后導(dǎo)入到Agilent GeneSpring GX軟件(版本11.0)作進(jìn)一步分析[4]。

四、統(tǒng)計分析

所有的結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。比較兩個芯片組的t檢驗。Plt;0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、膠質(zhì)瘤患者miRNA的差異表達(dá)

使用微陣列定量分析752種成熟miRNA。通過分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。所有表達(dá)強(qiáng)度低于100的miRNA被認(rèn)為是表達(dá)量稀少而去除。剩余的117種miRNA顯著異常(倍數(shù)≥2.0)。與對照組相比，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤外周血中，95的miRNA表達(dá)上調(diào)(81%) ，而22種miRNA表達(dá)下調(diào)(19%)。在其中經(jīng)進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)20種有顯著表達(dá)差異的miRNA(圖1)。表達(dá)上調(diào)的11種miRNA (hsa-miR-4726-5p, hsa-miR-1255b-2-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-4275, hsa-miR-4712-3p, hsa-miR- 576-5p, hsa-miR-1299, hsa-miR-4268, hsa-miR-3591-5p, hsa-miR-626, hsa-miR- BART18-3p, hsa-miR-3169)表達(dá)下調(diào)的11種miRNA (hsa-miR-320b, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-7-5p, hsa-miR-4524b-5p, hsa-miR-3171, hsa-miR-1246, hsa-miR-1273g-3p)。經(jīng)分析其中上調(diào)及下調(diào)前3位的分別有：miR-576-5p、miR-340、miR-626 miRNA顯著上調(diào)，而miR-320,let-7g-5p,miR-7-5p顯著下調(diào)。其中，在6種miRNA中，miR-576-5p表達(dá)增加4.05倍。miR-7-5p的表達(dá)水平下降0.57倍。

圖1 火山散點圖分析外周血中膠質(zhì)母細(xì)胞患者與正常人miRNA表達(dá)差異

Fig 1 Comparison of miRNA expression between GBM patients and normal controls by Scatter plots

A: The normal brain sample from human total serum; B: The GBM sample from human total serum.

二、預(yù)測GBM患者外周血miRNA差異表達(dá)的和功能注釋

為了進(jìn)一步探討這20種miRNA潛在靶基因的功能，我們選擇的表達(dá)上調(diào)的11種miRNA(hsa-miR-4726-5p, hsa-miR-1255b-2-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR -4275, hsa-miR-4712-3p, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-1299, hsa-miR-4268, hsa-miR-3591-5p, hsa-miR-626, hsa-miR-BART18-3p, hsa-miR-3169)和表達(dá)下調(diào)的11種miRNA (hsa-miR-320b, hsa-let-7g-5p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-7-5p, hsa-miR- 4524b-5p, hsa-miR-3171, hsa-miR-1246, hsa-miR-1273g-3p)進(jìn)行，功能注釋和同源分析(Gene Ontology分析, GO分析)及pathway信號通路分析。期望了解異常表達(dá)的miRNA在GBM患者外周血的潛在功能，通過使用生物信息學(xué)方法預(yù)測各種生物過程基因，分析了明顯表達(dá)異常的20種miRNA作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者外周血中的潛在靶標(biāo)的可能性。結(jié)果表明，靶基因涵蓋了這的三個領(lǐng)域：細(xì)胞代謝過程，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分子功能。其中細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面包括：膜周圍的細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外器。分子功能方面：調(diào)節(jié)肌球蛋白結(jié)合、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活性、血清素受體活性、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性、視黃酸受體結(jié)合、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔因子活性、蛋白激酶激活劑活性、乙酰氨基活動等。

為了檢測這種20種miRNA信號通路，通過pathway分析我們尋找可能干預(yù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能有：嘧啶代謝，細(xì)胞質(zhì)DNA的檢測途徑，血清素突觸聯(lián)系，堿基切除修復(fù)，鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，糖胺聚糖的生物合成，硫酸角質(zhì)素，人類T型細(xì)胞淋巴病毒Ⅰ型(human T-cell lymphotropic virus-Ⅰ, HTLV-Ⅰ)感染，嘌呤代謝等。其中明顯上調(diào)miR-576-5p、miR-340、miR-626，明顯下調(diào)的miR-320、let-7g-5p和miR-7-5p均極有可能通過靶向，影響相應(yīng)的分子通路生物活性。

討 論

腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是降低死亡率，改善預(yù)后的關(guān)鍵所在。外周血腫瘤標(biāo)志物的檢測具有無創(chuàng)傷、可重復(fù)、可于同一時間點進(jìn)行檢測多項指標(biāo)等優(yōu)點，是腫瘤診斷和隨訪的理想手段。最近，不少學(xué)者將關(guān)注點投向了外周血miRNA，有大量研究探討了外周血miRNA作為腫瘤標(biāo)志物的可行性。目前已經(jīng)證實，miRNA在組織和細(xì)胞中的表達(dá)表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性。有趣的是，miRNA在外周血中的表達(dá)同樣具有腫瘤相關(guān)性和組織特異性，同時與RNA比較，其表達(dá)穩(wěn)定性更為顯著。

本課題GBM外周血中檢測miRNA表達(dá)結(jié)果與patrick Roth等人的有一定的差異[3]。在比較了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者和健康對照組310個miRNA，他們觀察到的52 miRNA的一個顯著異常表達(dá)，占分析miRNA的16.8%。其中，27個miRNA的表達(dá)上調(diào)(52%)，而25的miRNA表達(dá)下調(diào)(48%)。而我們發(fā)現(xiàn)GBM血清中20種miRNA顯著異常表達(dá)，與一些學(xué)者研究結(jié)果有差異。差異的形成的原因可能有：首先，由于經(jīng)濟(jì)原因，我們主要分析了顯著不同的20種miRNA。其次，因為列入的多100多個miRNA的不同，非常難以評估一個觀察到的變化是否是真正的顯著或只是由于偶然性，因此，我們僅選擇表達(dá)量最多的20種miRNA表現(xiàn)出的表達(dá)變化。在這20個miRNA中，只有miR-576-5p、miR-340、miR-626、miR-320、let-7g-5p和miR-7-5p失調(diào)最為顯著。另外一個因素是， 全血中RNA提取并從全血中純化的流程不同， miRNA的水平在血漿中正常的生物變化和經(jīng)過處理樣品的步驟差異，即從采血到的逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)，可能影響觀察miRNA的表達(dá)[5]。此外，大部分miRNA在血清和血細(xì)胞中被檢測到。然而，只有少數(shù)miRNA是獨特地存在于血清或血細(xì)胞，這表明大多數(shù)血清的miRNA可以從循環(huán)血細(xì)胞衍生的[6,7]。最后，本研究用于檢測已知血漿miRNA的miRCURY LNA的RT-qPCR的系統(tǒng)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是比第一代微陣列系統(tǒng)更靈敏[8]。

我們發(fā)現(xiàn)miR-576-5p、miR-340、miR-626、miR-320、let-7G-5p和miR-7-5p在GBM的血液中表達(dá)顯著異常，表明在外周血中某些microRNA在膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長和增殖的可能有一定的生物學(xué)作用，以上6種miRNA在外周血中的潛在功能迄今至今尚未有人深入研究。例如，miR-342-3p，迄今還沒有在膠質(zhì)瘤組織中進(jìn)行研究。Li等人的實驗結(jié)果表明了miR-576-5p的過度表達(dá)發(fā)生在腦轉(zhuǎn)移癌[9]。在其他疾病領(lǐng)域中，miR-576-5p在骨關(guān)節(jié)炎(OA)下調(diào)[10]， 但在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)仍無報告。最近的一些研究已經(jīng)證明了miR-7抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[11,12]。在miRNA領(lǐng)域最新進(jìn)展表明，miRNA用 miR-7-5p的替代治療可能是一個治療癌癥的可行方法[13]。有學(xué)者認(rèn)為與原發(fā)性黑色素瘤細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤衍生的細(xì)胞系中miR-7-5p的表達(dá)減少，異位表達(dá)的miR-7-5p顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞遷移和侵襲。此外，一些作者報告，胰島素受體底物-2(insulin receptor substrate 2, IRS-2)是的miR-7-5p在黑色素瘤細(xì)胞的目標(biāo)。通過使用RNA干擾(RNAi)，它們證明IRS-2激活蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)，并促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的遷移。推測miR-7-5p的可能是一種新的腫瘤抑制型miRNA，在黑素瘤中通過其部分抑制IRS-2表達(dá)與致癌Akt信號發(fā)揮作用[14]。在本報告中的在GBM患者外周血中miR-7-5p顯著失調(diào)，其原因有待進(jìn)一步探討。

以往的研究確定血清miRNA的生物標(biāo)志物一般集中個的miRNA。然而，基于單個miRNA的生物標(biāo)志物的特異性通常是有爭議的。本項研究中表明，血清中6種異常表達(dá)的miRNA可能是GBM的診斷更全面的指標(biāo)。它尚未在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的組織或血清中被精確地研究。但在我們的研究中仍有幾個限制。

miRNA檢測研究存在以下幾個方面的問題：首先，樣本量較小，尚缺乏追蹤隨訪資料，因此對于外周血腫瘤相關(guān)miRNA與轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和生存率之間的關(guān)系尚不明確。其次，這六種血清miRNA是否可以建立一個常規(guī)的生物標(biāo)志物診斷將需要更多的檢測，目前已通過實驗篩選出的可能用作診斷指標(biāo)的外周血腫瘤相關(guān)miRNA尚缺乏進(jìn)一步的實驗論證。要求大量的臨床樣品的測試證明本研究的結(jié)果。再次，檢測方法仍比較繁瑣，且價格昂貴，不利于臨床應(yīng)用。最后，作為腫瘤標(biāo)志物的外周血miRNA的參考值范圍還未確定。我們目前只能評估部分失調(diào)的miRNA 的差異表達(dá)，我們期望在未來的探索研究中發(fā)現(xiàn)新的miRNA被認(rèn)定為GBM診斷的血清生物標(biāo)志物。

1董倫, 李健, 武永康, 等. mir-7-3基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長抑制作用的研究 [J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 13(1): 2-6.

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4董倫, 韓磊, 康春生, 等. 長鏈非編碼RNA在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中異常表達(dá)研究 [J]. 中國神經(jīng)腫瘤雜志, 2013, 11(3): 160-164.

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miRNAmicroarrayrevealsspecificexpressionintheperipheralbloodofglioblastoma

DONGLun1,SUJianhui2,WANGXiaodong1,ZHANGHengzhu1,HANChongxu3,WEIMin1

1DepartmentofNeurosurgery;2DepartmentofMedicalAffairs;3DepartmentofCenterLaboratory,ClinicalMedicalCollege,YangzhouUniversity,Yangzhou225001, China

ObjectiveThe expression profile variation of miRNA in the blood of both healthy and patients was investigated.MethodsmiRNA in serum of patients with GBM and normal controls were analyzed by microarray analysis. Then their relevant bioinformatic analysis of the predicted target genes (gene ontology, pathway, gene network analysis) was done for further research.ResultsThe miRNA microarray revealed that there were significant difference in the expression of miRNAs in serum between the GBM and normal controls. Among 752 miRNAs, 95 miRNAs were up-regulated in the GBM group, and 22 miRNAs were down-regulated (fold change≥2.0,Plt;0.01). By further analysis, miR-576-5p, miR-340, and miR-626 were significantly over-expressed, but miR-320, let-7g-5p, and miR-7-5p were significantly lowly expressed in GBM patients. By further relevant bioinformatic analysis, they possibly played the important roles in the regulation of glioma signaling pathways.ConclusionThe six miRNAs are significant differentially expressed in the peripheral blood of patients with GBM pathologies. These data suggest that the miRNA profile of the peripheral blood may serve as a new biomarker for glioma diagnosis with high specificity and sensitivity.

Glioblastoma; miRNA; microarray; Peripheral blood

1671-2897(2016)15-401-04

R 341

A

董倫，博士，E-mail: dongluen@163.com

*通訊作者： 王曉東，博士，E-mail: lundongu571@163.com

2015-05-08；

2015-11-20)