曹敬正 盧培剛 董元 李博 梁媛 郝振強(qiáng) 李育鑫

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 濟(jì)南 250031)

·腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤研究·

ClC-3與BK離子通道在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)中的作用研究

曹敬正 盧培剛*董元 李博 梁媛 郝振強(qiáng) 李育鑫

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 濟(jì)南 250031)

目的觀察3型氯離子通道(ClC-3通道)與大電導(dǎo)鈣激活K+通道(BK通道)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)；研究ClC-3離子通道與BK離子通道在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)中的作用。方法Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ClC-3與BK通道分別在C6及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的蛋白表達(dá)，免疫熒光技術(shù)檢測(cè)兩種通道蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的形態(tài)學(xué)分布情況；采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)應(yīng)用ClC-3通道特異性阻滯劑氯代毒素(ClTX)以及BK通道特異性阻滯劑伊比蝎毒素(IBTX)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的變化情況。結(jié)果U251及C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均高度表達(dá)ClC-3離子通道，而B(niǎo)K離子通道在兩種膠質(zhì)瘤系中的表達(dá)相對(duì)較低；應(yīng)用ClTX 后U251細(xì)胞的侵襲性顯著降低(Plt;0.05)，且呈劑量依賴關(guān)系；應(yīng)用IBTX后U251細(xì)胞的侵襲性無(wú)明顯變化。結(jié)論ClC-3離子通道在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用，可作為未來(lái)治療膠質(zhì)瘤的新靶標(biāo)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤; ClC-3與BK離子通道; 侵襲; 靶向治療

近年來(lái)，離子通道在膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)生物學(xué)中的作用日益受到廣泛關(guān)注[1]。ClC-3屬于電壓門(mén)控氯通道家族(voltage-gated chloride channnel, CICs)，參與“調(diào)節(jié)性細(xì)胞容積回縮(regulatory volume decrease, RVD)”，是“容積敏感性外向整流性(volume sensitive outwardly rectifying, VSOR)”氯通道的主要成員[2]，并參與介導(dǎo)細(xì)胞氯離子外流，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。大電導(dǎo)鈣激活K+通道(big mediate-conductance Ca2+-activated K+channel, BK通道)又稱(chēng)KCa1.1通道，它受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以及細(xì)胞去極化的雙重調(diào)控[4]，對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化尤為敏感，因此能夠參與包括膠質(zhì)瘤細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞的行為學(xué)改變。本研究旨在進(jìn)一步驗(yàn)證ClC-3以及BK通道在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并在此基礎(chǔ)之上探討它們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程中的重要作用，以期獲得直接的體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材料與方法

一、材料

C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株、U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清購(gòu)自Gibco公司， ClC-3通道特異性阻斷劑氯代毒素(Chlorotoxin, ClTX)購(gòu)自Anaspec公司，BK通道特異性阻斷劑伊比蝎毒素(Iberiotoxin, IBTX)購(gòu)自Alomone Labs公司。Matrigel膠、Transwell侵襲小室(24孔8 μm孔徑)購(gòu)自Corning公司， ClC-3與BK通道蛋白一抗工作液為 Abcam公司產(chǎn)品。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基中(抗生素濃度為100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

三、Western blot檢測(cè)ClC-3與BK離子通道在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，使用100 μl預(yù)冷的RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer )充分裂解，離心后提取總蛋白，8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，300 mA轉(zhuǎn)膜1 h，封閉液封閉1 h，洗滌后，加入一抗(ClC-3兔多克隆抗體1 ∶300，BK兔單克隆抗體1 ∶1 000)稀釋后4℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗，37℃搖床震搖孵育1 h；結(jié)果采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描。β-actin作為內(nèi)參對(duì)照。

四、免疫熒光檢測(cè)ClC-3與BK離子通道在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)分布情況

細(xì)胞爬片后，預(yù)溫的磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)清洗3次，4%的多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗3次，加0.4%Triton X-100透化20 min，山羊血清室溫封閉30 min，傾去血清，滴加一抗工作液(ClC-3兔多克隆抗體1 ∶100，BK兔單克隆抗體1 ∶100)，4℃濕盒中過(guò)夜，PBS漂洗3次。加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記二抗工作液(1 ∶50)避光孵育30 min，棄二抗，滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染料工作液(1 ∶1 000)，室溫孵育10 min，95%甘油封片，用PBS替代一抗工作液作為陰性對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察拍照并分析結(jié)果。

五、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell 小室上層均勻鋪50 μl基質(zhì)膠(無(wú)血清培養(yǎng)基：Matrigel為4 ∶1)，靜置于37℃培養(yǎng)箱中1 h使膠凝固，事先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞換用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，消化并用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml。小室內(nèi)加入含1% BSA上述細(xì)胞懸液200 μl，下室加入600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，1 h后待細(xì)胞貼壁，對(duì)照組不做處理，實(shí)驗(yàn)組分別在上下兩室加入特定濃度的ClC-3通道抑制劑ClTX 1、5 μmol/L[5]及BK通道抑制劑IBTX 10、50 nmol/L[3]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室棄去上室內(nèi)液體，4%多聚甲醛室溫下固定15 min，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)面的基質(zhì)膠與細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫避光染色10 min，200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、ClC-3與BK在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，U251及C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均高度表達(dá)ClC-3離子通道蛋白，BK離子通道蛋白在兩種膠質(zhì)瘤系中的表達(dá)相對(duì)較低，如圖1所示。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)證實(shí)ClC-3在 C6和U251兩種膠質(zhì)瘤系中均呈高表達(dá)，集中分布于細(xì)胞質(zhì)和胞膜上，而B(niǎo)K在兩種膠質(zhì)瘤系中的表達(dá)均相對(duì)較低，如圖2 所示。

二、應(yīng)用ClC-3與BK通道阻斷劑后膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的變化情況

通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)研究ClC-3 通道特異性阻滯劑ClTX以及BK通道阻滯劑IBTX對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的影響。U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞孵育24 h后，細(xì)胞均勻分布于Transwell小室，與對(duì)照組相比(158 17.5/視野)，應(yīng)用1 μmol/L ClTX后，透過(guò)小孔的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)目顯著減少(111±11.3/視野)，應(yīng)用5 μmol/L ClTX后，透過(guò)小孔的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步減少(76 9.3/視野)；而應(yīng)用不同梯度濃度的IBTX后透過(guò)小孔的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)目雖略有下降趨勢(shì)(IBTX 10 nmol/L ∶145±23.8/視野，IBTX 50 nmol/L ∶133±19.4/視野)，但尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖3所示。此結(jié)果說(shuō)明，相對(duì)BK通道，ClC-3 通道在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用，抑制ClC-3 通道可有效降低膠質(zhì)瘤侵襲性。

圖1 ClC-3與BK在U251及C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)情況

Fig 1 Expression of ClC-3 and BK in U251 and C6 glioma cell lines

A: Western blot for ClC-3 and BK expression in U251 and C6 cell lines; B: Statistical representation for the expression of ClC-3 and BK in U251 and C6 cell lines.

aPlt;0.05,vsClC-3 expression.

圖2 ClC-3與BK在U251及C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的形態(tài)分布情況

Fig 2 The morphological distribution of ClC-3 and BK in U251 and C6 glioma cell lines

A: The expression of ClC-3 in C6 cells; B: The expression of BK in C6 cells; C: The expression of ClC-3 in U251 cells; D: The expression of BK in U251 cells.

圖3 應(yīng)用ClC-3與BK通道阻斷劑后膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的變化情況

Fig 3 The changes of glioma cells invasion after application of ClC-3 and BK channel inhibitor

A: The penetrated U251 cells in control Transwells; B: The penetrated U251 cells in ClTX (1 μM)-treated Transwells; C: The penetrated U251 cells in ClTX (5 μM)-treated Transwells; D: The penetrated U251 cells in IBTX (10 nM)-treated Transwells; E: The penetrated U251 cells in IBTX (50 nM)-treated Transwells; F: The comparison of number of penetrated cells in different groups.

aPlt;0.05, ClTX (1 μM) and ClTX (5 μM) groupvsControl group;bPlt;0.05, ClTX (5 μM) groupvsCLTX (1 μM) group.

n=6, Bar=10 μm.

討 論

惡性膠質(zhì)瘤是一種致死性極高且最為常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的33.3%～58.6%[6]。近年來(lái)，雖然惡性腦膠質(zhì)瘤的治療效果有一定的提高，但是中位生存期仍僅為9～12個(gè)月，5年生存期仍不能超過(guò)10%[7]。影響患者生存期的主要原因是膠質(zhì)瘤在中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈侵襲性生長(zhǎng)，腫瘤界限不清，使手術(shù)切除程度受限。因此，腦膠質(zhì)瘤治療的進(jìn)展在很大程度上仍有賴于針對(duì)其侵襲性生長(zhǎng)的臨床治療研究。目前認(rèn)為，影響腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)的因素主要包括：膠質(zhì)瘤自身的生物學(xué)特性[8]，各種生長(zhǎng)因子及其相關(guān)信號(hào)通路，血管生成[9]以及膠質(zhì)瘤與機(jī)體免疫系統(tǒng)間的相互作用[10,11]等。盡管膠質(zhì)瘤高度侵襲的生物學(xué)行為已被廣泛接受，但目前大多數(shù)藥物針對(duì)的是"膠質(zhì)瘤侵襲微環(huán)境的變化“而不是針對(duì)具有侵襲性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)功能變化”的特異“靶點(diǎn)”。因此，探索和篩選針對(duì)侵襲瘤細(xì)胞本身結(jié)構(gòu)功能變化特征的新靶點(diǎn)，將在整個(gè)惡性膠質(zhì)瘤侵襲性治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。膠質(zhì)瘤細(xì)胞在侵襲周?chē)ＤX組織時(shí)，其容積會(huì)大大縮減，形成狹窄的梭形，這有助于其在狹窄的細(xì)胞外空間中侵襲性生長(zhǎng)，在這一過(guò)程中，會(huì)伴隨著大量K+、Cl-及隨之而來(lái)的水分子的流出[12]，因此，介導(dǎo)上述溶質(zhì)成分流動(dòng)變化的各種離子通道在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)中的作用便凸顯出來(lái)。迄今為止，已經(jīng)證實(shí)的與侵襲膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)變化密切相關(guān)的K+、Cl-離子通道主要為鈣激活的鉀離子通道(Ca2+-activated K+channels)和2，3型氯離子通道(ClC-2，ClC-3)[12～14]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們主要選擇BK(大電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道)和ClC-3作為研究對(duì)象，首先觀察二者在C6及U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的蛋白表達(dá)及形態(tài)分布情況，然后分別運(yùn)用BK通道特異性阻滯劑IBTX以及ClC-3特異性阻滯劑ClTX，觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的變化情況。研究結(jié)果顯示，U251及C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系均高度表達(dá)ClC-3離子通道蛋白，BK離子通道蛋則表達(dá)相對(duì)較低。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)運(yùn)用ClC-3 通道特異性阻滯劑ClTX后，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)特性顯著降低。上述結(jié)果表明，相對(duì)BK通道，ClC-3 通道在膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用，抑制ClC-3 通道可有效降低膠質(zhì)瘤侵襲性。就BK通道而言，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)中的作用有限，其與某些研究報(bào)道結(jié)果并不完全相符，分析原因如下：①在不同的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，BK通道表達(dá)及功能可能存在差異；②其它類(lèi)型鈣激活鉀離子通道，如IK(大電導(dǎo)鈣激活鉀離子通道)[15]，可能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)中發(fā)揮更重要的作用，其有待我們進(jìn)一步研究?？傊?，緊緊圍繞上述侵襲相關(guān)性離子通道，探尋以它們?yōu)榘袠?biāo)的新型治療策略將在惡性膠質(zhì)瘤侵襲性治療中具有重要意義。

1Huber SM. Oncochannels [J]. Cell Calcium, 2013, 53(4): 241-255.

2Lambert IH, Hoffmann EK, Pedersen SF. Cell volume regulation: physiology and pathophysiology [J]. Acta Physiol (Oxf), 2008, 194(4): 255-282.

3Weaver AK, Bomben VC, Sontheimer H. Expression and function of calcium-activated potassium channels in human glioma cells [J]. Glia, 2006, 54(3): 223-233.

4D'Amico M, Gasparoli L, Arcangeli A, et al. Potassium channels: novel emerging biomarkers and targets for therapy in cancer [J]. Recent Pat Anticancer Drug Discov, 2013, 8(1): 53-65.

5Liu VC, Lung SS, Pu JK, et al. Invasion of human glioma cells is regulated by multiple chloride channels including ClC-3 [J]. Anticancer Res, 2010, 30(11): 4515-4524.

6Preusser M, de Ribaupierre S, Wohrer A, et al. Current concepts and management of glioblastoma [J]. Ann Neurol, 2011, 70(1): 9-21.

7Arribas Alpuente L, Menendez Lopez A, Yaya Tur R. Glioblastoma: changing expectations? [J]. Clin Transl Oncol, 2011, 13(4): 240-248.

8Teodorczyk M, Martin-Villalba A. Sensing Invasion: cell surface receptors driving spreading of glioblastoma [J]. Cell Physiol, 2010, 222(1): 1-10.

9Onishi M, Ichikawa T, Kurozumi K, et al. Angiogenesis and invasion in glioma [J]. Brain Tumor Pathol, 2011, 28(1): 13-24.

10Sciume G, Santoni A, Bernardini G. Chemokines and glioma: invasion and more [J]. Neuroimmunol, 2010, 224(1-2): 8-12.

11Yi L, Xiao H, Xu M, et al. Glioma-initiating cells: a predominant role in microglia/macrophages tropism to glioma [J]. J Neuroimmunol, 2011, 232(1-2): 75-82.

12Sontheimer H. An unexpected role for ion channels in brain tumor metastasis [J]. Exp Biol Med (Maywood), 2008, 233(7): 779-791.

13Weaver AK, Olsen ML, McFerrin MB, et al. BK channels are linked to IP3-receptors via lipid rafts: a novel mechanism for coupling [Ca2+] to ion channel activation [J]. Biol Chem, 2007, 282(43): 31558-31568.

14Parkerson KA, Sontheimer H. Contribution of chloride channels to volume regulation of cortical astrocytes [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2003, 284(6): C1460-C1467.

15Turner KL, Honasoge A, Robert SM, et al. A Proinvasive role for the Ca21- Activated K Channel KCa3.1 in Malignant Glioma [J]. Glia, 2014, 62(6): 971-981.

TherolesofClC-3andBKionchannelingliomacellsinvasion

CAOJingzheng,LUPeigang,DONGYuan,LIBo,LIANGYuan,HAOZhenqiang,LIYuxin

DepartmentofNeurosurgery,JinanGeneralHospitalofPLA,Jinan,Shandong250031, China

ObjectiveThe expressions of voltage-gated chloride channel-3 (ClC-3 channel) and big mediate-conductance Ca2+-activated K+channel (BK channel) in glioma cells are observed and the roles of ClC-3 and BK ion channel on invasion of glioma cells are investigated.MethodsThe expressions of ClC-3 and BK ion channel in two glioma cell lines (C6 and U251) were evaluated by Western blot; immunofluorescence staining was used to detect the distribution of the two channels in C6 and U251 glioma cell lines; Transwell invasion assay was used to determine the effects of chlorotoxin (ClTX, a ClC-3 inhibitor) and iberiotoxin (IBTX, a BK inhibitor) on the invasion of the two glioma cell lines.ResultsU251 and C6 glioma cell lines were highly expressed in ClC-3 ion channel, but the expression of BK ion channel in two glioma lines was relatively lower; U251 glioma invasion was decreased significantly after the application of ClC-3 specific blocker chlorotoxin in a dose-dependent manner, but the BK channel specific blocker iberiotoxin showed no obvious effect in U251 glioma invasion.ConclusionClC-3 ion channels play an important role in the invasive growth of glioma, suggesting that ClC-3 ion channels might be a new target for the future therapy of glioma.

Glioma; ClC-3 and BK ion channel; Invasion; Targeted therapy

1671-2897(2016)15-389-04

R 739.41

A

曹敬正，碩士研究生，E-mail:cz-12345@163.com

*通訊作者： 盧培剛，主任醫(yī)師，E-mail: pglu912@126.com

2015-01-04；

2015-03-20)