葉 彬 陳令斌 劉 融

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溶血磷脂酰膽堿對MG-63細胞粘附和遷移能力的影響

葉 彬 陳令斌 劉 融

目的 探討溶血磷脂酰膽堿(lysoph-osphatidylcholine，LOA)對骨肉瘤細胞粘附和體外遷移能力的影響。方法 培養(yǎng)骨肉瘤細胞Mg-63，待其生長至對數(shù)生長期，傳至第3代收集腫瘤細胞，各細胞分為兩份。通過LOA預處理細胞后，一份以MTT微量酶比色反應法定量粘附細胞數(shù)，一份以劃痕損傷實驗檢測遷移能力。統(tǒng)計分析比較LOA對骨肉瘤細胞遷移和粘附能力的相關性。結果 MTT法檢測結果顯示，不同作用時間(0、6、12、24、48 h)不同劑量LOA(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)干預后骨肉瘤細胞體外粘附能力明顯加強，與對照組(0.000 mg/ml各組)相比，差異有統(tǒng)計學意義；Transwell結果顯示，不同作用時間(0、6、12、24、48 h)不同劑量LOA(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)干預后骨肉瘤細胞體外遷移能力隨著時間及劑量的增加而明顯加強，與對照組(0.000 mg/ml各組)相比，差異有統(tǒng)計學意義。結論 LOA具有促細胞骨架變化進而調(diào)節(jié)細胞粘附和遷移能力的作用，表明LOA在惡性腫瘤發(fā)生進展中可能與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。

溶血磷脂酰膽堿；骨肉瘤細胞；細胞粘附；體外遷移

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1593～1596)

骨肉瘤是青少年及兒童最常見的惡性骨腫瘤之一，腫瘤呈現(xiàn)局部侵襲性，且極易發(fā)生轉移。盡管近二十年來隨著新輔助化療和綜合治療的臨床應用，骨肉瘤的療效已經(jīng)顯著提高，但仍有30%以上患者出現(xiàn)復發(fā)和轉移，其中肺轉移為其死亡的主要原因，因此研究骨肉瘤的轉移以及侵襲的分子機制對于改善骨肉瘤的預后具有重要的臨床意義[1-2]。溶血磷脂酰膽堿是目前已知體內(nèi)結構最簡單的水溶性甘油磷脂，其中最引人關注的是，LOA具有促細胞骨架變化進而調(diào)節(jié)細胞粘附和遷移能力的作用[3]。基于LOA的基本功能以及LOA的某些腫瘤細胞具有調(diào)控粘附和遷移能力的研究，我們推斷LOA亦很可能對骨肉瘤細胞具備同樣的生物學效應，即LOA能夠通過其受體調(diào)控骨肉瘤細胞的粘附和遷移，進而影響骨肉瘤的侵襲和轉移[4-6]。本研究為明確LOA對骨肉瘤細胞粘附和遷移力的影響，以期探討LOA在骨肉瘤形成中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑、細胞

胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，骨肉瘤細胞Mg-63(中國科學院細胞庫)，DMEM、胰酶、EDTA(GIBCO公司，美國)TaqMix(東盛生物公司)，培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)，MTT試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，Transwell 24孔培養(yǎng)板(美國 Corning 公司)，10 cm2培養(yǎng)皿、96孔板(美國 Corning 公司)。溶血磷脂酰膽堿(美國 PeProtech 公司)避光4 ℃保存，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)，超凈工作臺SCW-HS-840型 (蘇州市長春電子儀器廠)，培養(yǎng)箱(Queue systems TM2711美國)，深低溫冰箱(SANYO，AltraLow日本)，全能型高性能臺式冷凍離心機(Heaeus，BiofugeStratos德國)，蒸汽高壓消毒箱(Tuttnauer，2540MK美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)與傳代[7]

含10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基對骨肉瘤細胞Mg-63進行培養(yǎng)，置于37 ℃ 5%CO2的孵箱中。傳代時機選擇在細胞密度達到70%以上的時候進行，首先對培養(yǎng)基清洗后，細胞消化采用含0.02%EDTA的胰蛋白酶，2～3 min對消化后的細胞加入同體積的含血清培養(yǎng)基終止消化，采用倒置顯微鏡觀察細胞以了解消化情況，對貼壁細胞進行吹打，并通過5 min 10 000 r/min的離心分離，去除上清，對細胞懸液進行計數(shù)，之后接種到新的培養(yǎng)瓶當中繼續(xù)培養(yǎng)有待下一次傳代。

1.3 分組及加藥方法

待細胞貼壁生長至密度為70～80 %時，在不同作用時間(0、6、12、24、48 h)分別予以不同濃度的溶血磷脂酰膽堿(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)作用骨肉瘤細胞Mg-63。

1.4 MTT法測定溶血磷脂酰膽堿對骨肉細胞粘附能力的影響[8]

取P3代細胞1×104細胞/孔接種至96孔板中，細胞貼壁后，棄掉原有培養(yǎng)基，分別加入含(0.000、0.001、0.010、0.060、0.100 mg/ml)溶血磷脂酰膽堿培養(yǎng)基100 μl進行培養(yǎng)，而對照組只加等量的含胎牛血清培養(yǎng)基，在不同作用時間(0、6、12、24、48 h)，加入20 μL 濃度為5 g/L MTT 試劑，37 ℃孵育4 h，棄掉原有培養(yǎng)基，再加入150 μlDMSO之后，持續(xù)振蕩混勻10 min，通過490 nm吸光度的酶標儀進行檢測，參考OD值以表示粘附細胞的數(shù)量，按照細胞粘附抑制率公式計算=(1-加藥值/空白值)×100%表示，實驗數(shù)據(jù)重復3次取平均值。

1.5 溶血磷脂酰膽堿對骨肉細胞體外遷移的影響[9]

取各組P3代骨肉瘤細胞于種板前1天，12 h無血清饑餓處理，常規(guī)消化、離心收集細胞，(含0.2% FBS)低血清DMEM培養(yǎng)液混懸成5×105/ml密度的單細胞懸液。并把Transwell培養(yǎng)池放入24孔培養(yǎng)板中，100 μg/ml溶血磷脂酰膽堿培養(yǎng)基100 μl進行培養(yǎng)，下室內(nèi)加入含10% FBS 500 μl的DMEM培養(yǎng)液，上室內(nèi)加入(約5×104細胞)100 μl細胞懸液，置于37 ℃孵箱，5% CO2環(huán)境內(nèi)。各組分別于培養(yǎng)0、6、12、24、48 h后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室內(nèi)細胞，運用4%多聚甲醛固定30 min以后，PBS洗2次，30 min 0.1 %結晶紫染色之后，PBS洗2次，以去掉多余染料，最后通過顯微鏡下觀察拍照。若在小室內(nèi)有多余水分需要采用棉簽吸掉，用十二烷基硫酸鈉(SDS)1% 500 μl 30 min溶解細胞。完全溶解之后，取100 μl的細胞裂解液，再次放入96孔板細胞培養(yǎng)板中，通過570 nm酶標儀測定吸光值以了解細胞體外遷移能力。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 骨肉細胞Mg-63的體外形態(tài)學變化

培養(yǎng)24 h后，鏡下可見大量圓形、折光性強的有核細胞懸浮在培養(yǎng)基上，換液后可見部分骨肉細胞已從骨塊爬出，貼壁生長，呈長梭形，7天左右細胞長滿瓶底，呈旋渦狀生長。傳至第3代顯微鏡下可見細胞生長旺盛、形態(tài)均一，呈旋渦狀、梭形生長。通過Giemsa染色后顯示胞漿豐富，細胞呈梭形，細胞核染成紫紅色，染色藍紫色。

2.2 細胞表面抗原免疫熒光鑒定

P3代細胞表面抗原CD34表達陰性、表面抗原CD44(CY3，紅色熒光)表達陽性，CD105(FITC，綠色熒光)。符合骨肉細胞Mg-63表型特征。

2.3 MTT法測定溶血磷脂酰膽堿對骨肉細胞粘附能力的影響

MTT法檢測結果顯示，LOA不同濃度干預后不同作用時間骨肉瘤細胞體外粘附能力明顯加強，各組與對照組(0.000 mg/ml)相比，差異有統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 MTT法測定溶血磷脂酰膽堿對骨肉細胞粘附能力的影響±s)

注：①為與對照組(0.000 mg/ml)相比，P<0.05。

2.4 溶血磷脂酰膽堿對骨肉細胞體外遷移的影響

Transwell結果顯示，經(jīng)不同濃度LOA干預后不同作用時間骨肉瘤細胞體外遷移能力明顯加強，各組與對照組(0.000 mg/ml)相比，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 溶血磷脂酰膽堿對骨肉細胞體外遷移的影響

注：①為與對照組(0.000 mg/ml)相比，P<0.05。

3 討論

骨肉瘤是起源于間葉組織，為青少年最常見的原發(fā)惡性骨瘤，大多數(shù)情況下腫瘤細胞產(chǎn)生不成熟的骨質(zhì)或骨，其發(fā)展迅速，主要病變部位位于長骨干骷端，侵襲性強，可出現(xiàn)全部組織器官的轉移，肺部轉移較為常見，該病預后較差，經(jīng)積極治療后5年的存活率僅為70%[10-11]。目前主要的治療方法是手術及全身化療的綜合治療方法，但是還是存在復發(fā)和轉移的可能，給患者造成了嚴重的經(jīng)濟負擔，由于疾病發(fā)病隱匿，進展很快，很多患者就診時已到達晚期，同時目前還缺乏骨肉瘤的診斷和治療靶標，因此尋找生物學靶標對于疾病的診治至關重要，本研究為探求該病的侵襲機制，尋找靶點基因與疾病的相關性，對該病的治療和預后判斷提供一定的指導價值[12]。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的過程，腫瘤患者死亡的主要原因則是腫瘤的轉移和侵襲作用。而此過程機制非常復雜，可將其概括為三步說，即蛋白降解酶、腫瘤細胞的遷移、腫瘤細胞的粘附作用[13]。細胞適度的粘附和遷移能力是機體生命活動與防御機制所必需的，但是，粘附和遷移能力的增強或改變均是導致腫瘤侵襲以及轉移的重要因素。當腫瘤細胞的侵襲及粘附能力發(fā)生改變，可與局部微環(huán)境脫離并降解局部基質(zhì)，并在遷移能力也異常的情況下，運動至鄰近的組織或穿過基底膜和細胞外基質(zhì)，到達更遠的部位建立繼發(fā)腫瘤，最終導致腫瘤的轉移。體外試驗研究表明，腫瘤細胞的遷移速度與其轉移能力呈正相關。

溶血磷脂酰膽堿是目前已知體內(nèi)結構最簡單的水溶性甘油磷脂，長期以來，被認為只是一個細胞膜的組成成分、磷脂合成的前體[14]。而近年的研究表明，LOA在多種組織和細胞中具有廣泛的生物學功能，被稱為細胞間“多功能磷脂信使”。具有促細胞骨架變化進而調(diào)節(jié)細胞粘附和遷移能力的作用。人們進而發(fā)現(xiàn)，LOA在惡性滲出液中顯著升高，而其受體在人類一些腫瘤中呈現(xiàn)異常表達等，這表明LOA在惡性腫瘤發(fā)生進展中可能與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。LOA可存在于正常人的血清中，但濃度較低，血漿中則檢測不到[15]。但已發(fā)現(xiàn)的各類腫瘤細胞當中，LOA具有能升高細胞周期蛋白D1水平，具有促細胞增殖功能的作用，從而進一步促進腫瘤的侵襲和生長遷移；同時還可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達，促進腫瘤血管生成間接刺激腫瘤生長和轉移。因此，LOA對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多方面多層次影響的，其主要通過自身分泌、相關受體、胞內(nèi)相關因子等環(huán)節(jié)影響腫瘤細胞的遷移和粘附以及凋亡和分化能力，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲和轉移，但是其具體調(diào)控機制及信號傳導，尚不清晰[16]。

本研究為探討骨肉瘤形成過程中LOA的作用，觀察LOA對骨肉瘤細胞粘附和體外遷移能力的影響。研究結果顯示，通過LOA預處理細胞后，觀察發(fā)現(xiàn)不同劑量的LOA對骨肉瘤細胞遷移和粘附能力具有一定的差異性，劑量越高其細胞遷移和粘附能力越強；同時隨著干預事件的延長，骨肉瘤細胞的遷移和粘附能力也隨之增強。推斷LOA亦很可能對骨肉瘤細胞具備同樣的生物學效應，即LOA能夠通過其受體調(diào)控骨肉瘤細胞的粘附和遷移，進而影響骨肉瘤的侵襲和轉移。

綜上所述，濃度和時間是對骨肉瘤細胞株具有不同的轉移和侵襲能力，隨著時間和濃度的增加，其遷移和粘附能力逐漸增強。我們推測，LOA可能通過其促進細胞凋亡和促侵襲的作用對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮調(diào)控作用。本研究闡明了LOA對骨肉瘤細胞粘附作用和侵襲作用的分子相關性，但是其主要的發(fā)病機制有待于深入的研究，同時通過本研究也為骨肉瘤的臨床診斷和預后判斷提供了新的策略方法，確定了LOA與骨肉瘤的相關性，以此作為抗腫瘤治療分子靶點，或可為臨床治療骨肉瘤及骨肉瘤的轉移提供新的、有良好前景的方法。

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(編輯：甘 艷)

Effect of Lysophosphatidic Acid on Mg-63 Cell Adhesion and Migration

YEBin,CHENLingbin,LIURong.

WuhanPurenHospital,Wuhan,430081

Objective To investigate the effect of lysophosphatidic acid (LOA)on osteosarcoma cell adhesion and migration in vitro.Methods Osteosarcoma cell Mg-63 were cultured,let it grow to a logarithmic growth phase,tumor cells were collected at the third generation,each cell was divided into 2 parts.After pretreatment of cells by LOA,MTT colorimetric reaction quantified to trace the number of adherent cells,a scratch wound assay with migration.LOA statistical analysis and comparison of osteosarcoma cell migration and adhesion of relevance.Results MTT assay test results showed that after (0.000,0.001,0.010,0.060,0.100 mg/ml) LOA intervention at different time (0,6,12,24,48 h) osteosarcoma cells in vitro adhesion significantly strengthened,compared with the control group,the difference (in each group 0.000 mg/ml) was statistically significant;Transwell results show different time after (0.000,0.001,0.010,0.060,0.100 mg/ml) LOA intervention (0,6,12,24,48 h) osteosarcoma cells in vitro migration significantly strengthened,compared with the control group (0.000 mg/ml compared to each group),the difference was statistically significant.Conclusion LOA promote cytoskeletal changes have in turn regulate cell adhesion and migration effects,LOA may be related to tumor invasion and metastasis in malignant tumor progression.

Lysophosphatidic acid(LOA);Osteosarcoma cell;Cell adhesion;Migration in vitro

430081 湖北省武漢市普仁醫(yī)院

劉 融

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.008

R738.7

A

1001-5930(2016)10-1593-04

2015-12-08

2016-04-05)