王業(yè)海，孔一夫，陳晨晨2，李宜明

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，合肥230009；2.中國科學(xué)院強(qiáng)磁場科學(xué)中心，合肥230031）

K 33位乙?；揎桽UMO蛋白的化學(xué)合成

王業(yè)海1，孔一夫1，陳晨晨2，李宜明1

（1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，合肥230009；2.中國科學(xué)院強(qiáng)磁場科學(xué)中心，合肥230031）

采用高溫輔助固相合成技術(shù)及基于多肽酰肼的自然化學(xué)連接技術(shù)，高效獲得了小泛素相關(guān)修飾物（SUMO）蛋白及33位賴氨酸（K33）乙?；疭UMO蛋白.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）和圓二色光譜分析結(jié)果表明，與生物表達(dá)蛋白相比，化學(xué)合成蛋白具有較好的純度和類似的二級結(jié)構(gòu).

小泛素相關(guān)修飾物；乙?；桓邷剌o助固相合成；多肽酰肼；自然化學(xué)連接

在真核細(xì)胞中小泛素相關(guān)修飾物（SUMO）修飾已經(jīng)成為調(diào)控蛋白質(zhì)功能的一種關(guān)鍵翻譯后修飾［1～6］.研究發(fā)現(xiàn)，數(shù)以百計(jì)的蛋白可以被 SUMO化［7～9］，SUMO化蛋白進(jìn)而參與到染色質(zhì)的組裝、DNA的修復(fù)、蛋白質(zhì)的體內(nèi)平衡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程中［10，11］.與蛋白質(zhì)泛素化類似，蛋白質(zhì)的SUMO化同樣需要E1激活酶、E2結(jié)合酶和E3連接酶等3種酶的參與［12］.這3種酶的協(xié)同作用使底物蛋白SUMO化，而底物蛋白的SUMO化位點(diǎn)主要發(fā)生在一段收斂的ΨK x D／E（Ψ代表疏水性氨基酸；x代表任意氨基酸）序列的賴氨酸上［13］.

SUMO化蛋白的識(shí)別主要是通過SUMO與其效應(yīng)蛋白上SUMO相互作用基序（SIM域）的非共價(jià)相互作用來實(shí)現(xiàn)［14～16］.SIM是一段少于10個(gè)氨基酸的多肽序列，包含1個(gè)以3～4個(gè)氨基酸為核心的疏水序列（主要是Val或者Ile）和1個(gè)鄰近的酸性區(qū)域［17］.SIM中的疏水殘基會(huì)結(jié)合SUMO結(jié)構(gòu)中的β2股，并且會(huì)使β折疊延伸.SIM中的酸性殘基通過結(jié)合SUMO蛋白表面上的酸性區(qū)域來增加SIM與SUMO蛋白的結(jié)合力.SUMO化蛋白與效應(yīng)蛋白SIM域的正確識(shí)別是SUMO化蛋白發(fā)揮正常功能的關(guān)鍵.

SIM中的一些Ser或Thr可以被磷酸化，磷酸化后的SIM則可通過電荷相互作用增強(qiáng)其與SUMO化蛋白的結(jié)合力［18～20］；SUMO蛋白可以被乙酰化，乙酰化后的SUMO蛋白與SIM的結(jié)合力則大幅度降低［21］.SUMO蛋白與SIM之間的這種精細(xì)化調(diào)控是SUMO化蛋白相關(guān)功能得以正常發(fā)揮的重要保證.

與磷酸化SIM的制備相比，制備大量、性質(zhì)均一的乙酰化SUMO則要困難得多.目前，制備乙?；疭UMO蛋白的主要方法為通過非天然氨基酸定點(diǎn)嵌入方法將乙?；疞ys嵌入到SUMO蛋白中，或通過酶促反應(yīng)，體外獲得乙?；疭UMO蛋白［22］.這2種方法都難以獲得大量的乙?；疭UMO蛋白.近年來，由于多肽固相合成及片段連接技術(shù)的發(fā)展，使得蛋白質(zhì)化學(xué)合成成為一種高效獲得翻譯后修飾蛋白的方法［23～34］.尤其是高溫輔助的Fmoc固相多肽合成技術(shù)有助于一次性合成序列較長的多肽片段［35］.基于此，本文以高溫輔助的Fmoc固相合成技術(shù)結(jié)合基于多肽酰肼的自然化學(xué)連接方法，將乙?；疭UMO蛋白分成兩片段合成，然后將兩片段肽連接獲得全長蛋白，合成路線如Scheme 1所示.

Scheme 1 Am ino acid sequence of SUMO2（A）and the synthesis strategy of SUMO2 and K 33?Ac?SUMO2（B）

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

20種Fmoc氨基酸、Fmoc?Nle?OH和6?氯苯并三氮唑?1，1，3，3?四甲基脲六氟磷酸酯（HCTU）購自吉爾生化（上海）有限公司；N，N′?二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、N，N′?二異丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸（TFA）、甲醇、苯酚和乙腈均為分析純，巰基乙酸甲酯（純度為96%），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；哌啶、乙醚和水合肼均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三苯基甲基氯樹脂（取代度為0.43mmol／g）和Rink酰胺樹脂（取代度為0.34 mmol／g）購自天津南開和成科技有限公司；2?肟氰乙酸乙酯（Oxyma，純度為98%）和N，N′?二異丙基碳二亞胺（DIC，純度為99%）購自安耐吉化學(xué)公司.

Centrifuge 5424型離心機(jī)（德國艾本德股份公司）；FE20?K?Plus型pH計(jì)（瑞士梅特勒?托利多公司）；SHB?Ⅲ型臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城儀器有限公司）；FD?1A?50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；IKA C?MAG SH7型磁力攪拌器［德國艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司］；ME103E型分析天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；LC?20AT型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津公司）；Ultimate XB?C18型分析型色譜柱（φ250 mm×4.6 mm，美國格雷斯公司）；Ultimate XB?C18型半制備型色譜柱（φ250 mm×10 mm，美國格雷斯公司）；安捷倫1100型液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國An?glient公司）；J?1100型圓二色光譜（CD）儀（香港佰泰科技有限公司）.

1.2 酰肼樹脂的制備

將2 g三苯基甲基氯樹脂（0.86 mmol）溶于30 mL DMF／DCM（體積比1∶1）混合溶劑中，加入8.6 mmol水合肼和17.2 mmol DIEA，冰浴條件下反應(yīng)12 h；加入2 mL甲醇封閉未反應(yīng)掉的三苯基甲基氯樹脂；反應(yīng)結(jié)束后，依次用DMF、水、甲醇和乙醚洗滌得到的酰肼樹脂，風(fēng)干并置于4℃冰箱中備用（經(jīng)測定酰肼樹脂的取代度為0.38 mmol／g）.

1.3 小泛素相關(guān)修飾物第一片段（SUMO2?1）的制備

將263.1mg酰肼樹脂置于固相合成管中，用15 mL DMF／DCM混合溶劑（體積比1∶1）溶脹15min后抽干，采用高溫輔助的Fmoc固相合成法合成SUMO2?1（0.4 mmol氨基酸＋0.4 mmol Oxyma＋0.4 mmol DIC），反應(yīng)時(shí)間為20～30 min，反應(yīng)溫度為75℃.其中，精氨酸（Arg）采用HCTU作為縮合劑，室溫下反應(yīng)40 min，反應(yīng)2次；組氨酸（His）采用DIC作為縮合劑，室溫下反應(yīng)40 min；半胱氨酸（Cys）采用DIC作為縮合劑，50℃反應(yīng)40 min.反應(yīng)完畢，依次用DMF，DCM和DMF各洗滌5次，加入含有哌啶（體積分?jǐn)?shù)20%）的DMF溶液反應(yīng)2次（反應(yīng)時(shí)間分別為2和10 min），脫除Fmoc保護(hù)基.組裝完肽鏈后，向多肽合成管中加入8 mL切割試劑［V（TFA）∶V（苯酚）∶V（水）∶V（三異丙基硅烷，TIPS）＝88∶5∶5∶2］，反應(yīng)2 h，將多肽從樹脂上切下，并脫除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán).將切割液置于離心管中，

用N2氣鼓泡，濃縮溶液，最后用冰乙醚沉淀，離心，得到粗肽，經(jīng)LC?MS分析確定是否為目標(biāo)產(chǎn)物，使用半制備型HPLC分離得到SUMO2?1（110 mg，分離產(chǎn)率20.8%）.

1.4 K 33乙?；》核叵嚓P(guān)修飾物第一片段（K 33?Ac?SUMO2?1）的制備

將263.1mg酰肼樹脂置于固相合成管中，用15mLDMF／DCM混合溶劑（體積比1∶1）溶脹15min后抽干；采用高溫輔助的Fmoc固相合成法合成K33?Ac?SUMO2?1.每一種氨基酸耦合的合成步驟與SUMO2?1相同，不同之處在于第33位的Lys采用側(cè)鏈氨基Alloc保護(hù)的Fmoc氨基酸進(jìn)行耦合.當(dāng)所有氨基酸耦合完成后，先用四（三苯基膦）鈀（0.01mmol）脫除K33位賴氨酸上的Alloc保護(hù)基（反應(yīng)2次，每次30 min）；沖洗過后再加入乙酸酐試劑（1 mL乙酸酐＋1 mL DIEA＋8 mL DMF）對K33進(jìn)行乙酰化修飾，反應(yīng)10 min后，將肽鏈末端的Fmoc保護(hù)基用哌啶脫除掉.最后，將多肽從樹脂上切割下來，采用相同的后處理過程得到粗肽，經(jīng)LC?MS分析確定是否為目標(biāo)產(chǎn)物，使用半制備型HPLC分離得到K33?Ac?SUMO2?1（106 mg，分離產(chǎn)率19.8%）.

1.5 小泛素相關(guān)修飾物第二片段SUMO2?2的制備

將294 mg Rink酰胺樹脂置于固相合成管中，用15 mL DMF／DCM混合溶劑（體積比1∶1）溶脹15 min后抽干；采用高溫輔助的Fmoc固相合成法合成SUMO2?2.每一種氨基酸耦合的合成步驟與SUMO2?1相同.加完所有氨基酸后，將多肽從樹脂上切割下來，采用相同的后處理過程得到粗肽，經(jīng)LC?MS分析確定是否為目標(biāo)產(chǎn)物，使用半制備型HPLC分離得到SUMO2?2（95 mg，分離產(chǎn)率17.9%）.

1.6 SUMO2?1與SUMO2?2肽片段連接

參照文獻(xiàn)［36～38］方法，將26.3 mg SUMO2?1用PBS緩沖液（6.0 mol／L Gn·HCl，0.2 mol／L Na2HPO4）溶解，在－10℃，pH＝3.0條件下用亞硝酸鈉氧化，得到?；B氮產(chǎn)物，再加入巰基乙酸甲酯（MTG），調(diào)節(jié)pH值至7.0，得到SUMO2?1硫酯；加入39.7 mg SUMO2?2，用分析型HPLC監(jiān)測反應(yīng)；待完全轉(zhuǎn)化為SUMO2后，經(jīng)LC?MS分析確定是否為目標(biāo)產(chǎn)物，用半制備型HPLC分離，凍干，得到全長的SUMO2蛋白（24 mg，分離產(chǎn)率45.6%）.

1.7 K 33?Ac?SUMO2?1與SUMO2?2肽片段連接

將26.5 mg K33?Ac?SUMO2?1用PBS緩沖液溶解，在－10℃，pH＝3.0條件下用亞硝酸鈉氧化，得到酰基疊氮產(chǎn)物；再加入巰基乙酸甲酯（MTG），調(diào)節(jié)pH值至7.0，得到K33?Ac?SUMO2?1的硫酯；加入39.7 mg SUMO2?2，用分析型HPLC監(jiān)測反應(yīng)；待完全轉(zhuǎn)化為K33?Ac?SUMO2后，經(jīng)LC?MS分析確定是否為目標(biāo)產(chǎn)物，用半制備型HPLC分離，凍干，得到全長的K33?Ac?SUMO2蛋白（21mg，分離產(chǎn)率39.7%）.

2 結(jié)果與討論

2.1 SUMO2肽片段的合成與HPLC表征

實(shí)驗(yàn)中嘗試采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相合成方法合成SUMO2肽片段.將所需的氨基酸（0.4 mmol）、2?（7?偶氮苯并三氮唑）?N，N，N′，N′?四甲基脲六氟磷酸酯（0.36 mmol）和 N，N′?二異丙基乙胺（0.8 mmol）依次加入合成管中反應(yīng)生成SUMO2肽片段，由于片段過長導(dǎo)致合成效果并不理想.在Fmoc固相合成方法中，高溫可以提高氨基酸之間的耦合效率，進(jìn)而提高長片段多肽合成產(chǎn)率，因此本文采用該方法合成SUMO的2個(gè)片段.通過這種方法制得了純度較高的2個(gè)片段的粗肽，但質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)所得到的產(chǎn)物并不是SUMO2?1和SUMO2?2.經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，相比于正常肽片段每個(gè)產(chǎn)物的分子量都多32.由于甲硫氨酸（Met）易于氧化，且每條肽片段都含有2個(gè)Met，故推測是在合成過程中Met發(fā)生了氧化.因此，采用正亮氨酸（Nle）替代Met來獲得正確的多肽片段［24］.經(jīng)過改進(jìn)獲得了純度較高的粗肽產(chǎn)物，HPLC分析結(jié)果如圖1所示.雖然乙酰化片段1的純度比天然片段略有下降，但整體產(chǎn)率依然較好（SUMO2?1產(chǎn)率20.8%，K33?Ac?SUMO2?1產(chǎn)率19.8%，SUMO2?2產(chǎn)率17.9%）.

2.2 SUMO2的獲得與HPLC表征

Fig.1 HPLC trace（A，B，C）and MS（D，E，F(xiàn)）of SUMO2?1（A，D），K 33?Ac?SUMO2?1（B，E）and SUMO2?2（C，F(xiàn)）

在獲得SUMO2肽片段后，利用基于多肽酰肼的自然化學(xué)連接方法進(jìn)行肽片段的連接.首先，使用MPAA作為硫醇試劑進(jìn)行肽片段的連接，經(jīng)過4～5 h的反應(yīng)即可獲得連接產(chǎn)物.但在隨后的分離過程中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物SUMO2的出峰位置與MPAA的出峰位置重合，調(diào)整分離梯度后依然無法將兩者分開.為了解決這個(gè)問題，使用MTG作為反應(yīng)的硫醇試劑進(jìn)行肽片段的連接［24］.經(jīng)過5～6 h反應(yīng)，獲得了全長的SUMO2產(chǎn)物（產(chǎn)率45.6%），HPLC分析結(jié)果如圖2所示，并且在后續(xù)的分離純化過程中并未受到硫醇出峰的影響.

2.3 K 33?Ac?SUMO2的獲得與HPLC表征

以MTG作為硫醇試劑，通過兩片段多肽酰肼連接反應(yīng)，獲得了目標(biāo)K33?Ac?SUMO2蛋白（產(chǎn)率39.7%），圖3示出了HPLC分析結(jié)果.同樣，使用MTG作為硫醇可使產(chǎn)物的分離較為順利.

Fig.3 Ligation trace of K 33?Ac?SUMO2?1（A）and SUMO 2?2（B），and MS（C）of K 33?Ac?SUMO 2

2.4 SDS?PAGE分析

通過SDS?PAGE鑒定了SUMO和K33?Ac?SUMO蛋白是否具有正確的分子量.由圖4可知，化學(xué)全合成的SUMO及K33?Ac?SUMO蛋白與生物表達(dá)的SUMO蛋白處在同一位置，且具有較好的純度.

Fig.4 SDS?PAGE of expressed SUMO 2（1），syn?thesized SUMO2（2）and synthesized K 33?Ac?SUMO2（3）

2.5 圓二色光譜（CD）分析

利用圓二色光譜（CD）鑒定了SUMO蛋白和K33?Ac?SUMO蛋白是否具有正確的二級結(jié)構(gòu).將合成蛋白溶于水中使其自發(fā)折疊，調(diào)節(jié)濃度至0.5～1 mg／mL用于CD測試.由圖5可知，化學(xué)全合成的SUMO蛋白和K33?Ac?SUMO蛋白與生物表達(dá)的SUMO蛋白在溶液中具有類似的二級結(jié)構(gòu).

Fig.5 CD spectra of exp ressed SUMO 2，synthe?sized SUMO2 and synthesized K 33?Ac?SU?MO2

3 結(jié) 論

采用高溫輔助的Fmoc固相多肽合成方法，結(jié)合多肽酰肼連接技術(shù)以兩片段高效合成了SUMO2蛋白與K33?Ac?SUMO2蛋白.通過與生物表達(dá)SUMO2的SDS?PAGE和CD數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，證明了合成蛋白具有較好的均一性與類似的二級結(jié)構(gòu).本文通過化學(xué)合成的策略獲得了含有翻譯后修飾的SUMO2蛋白，為研究乙酰化SUMO2與底物蛋白SIM的相互作用提供了重要的基礎(chǔ).除SUMO蛋白外，泛素蛋白也含有類似的乙?；傲姿峄揎棧?9，40］，這些翻譯后修飾發(fā)揮了重要的生理功能.該合成策略的成功應(yīng)用也為高效獲得含有類似翻譯后修飾的泛素蛋白提供了有效的途徑.

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Chem ical Synthesis of K33 Acetylated SUMO Protein?

WANG Yehai1，KONG Yifu1，CHEN Chenchen2，LIYiming1?
（1．School ofBiological and Medical Engineering，Hefei University of Technology，Hefei230009，China；2．High Magnetic Field Laboratory of the Chinese Academy ofSciences，Hefei230031，China）

Sumoylated protein was found to reduce the protein binding force with the SUMO?interaction motif （SIM）of effector protein when K33 of SUMO was acetylated.To further study the structures and mechanism，a large amount of uniformity acetylated SUMO protein was greatly needed.In this work，SUMO protein and K33 acetylated SUMO protein was efficiently obtained using high temperature assisted solid?phase peptide syn?thesis（SPPS）technology combined with peptide hydrazide ligation.SUMO and K33 acetylated SUMO was identified with corrected molecularweightby the SDS?PAGE.Itwas also confirmed that the chemically synthe?tic protein and biologically expressed SUMO2 own similar homogeneity and secondary structure by the CD analysis.These results provided a foundation for the follow?up study of K33 acetylated SUMO protein.

Small ubquitin?related modifier；Acetylation；High temperature assisted solid?phase peptide syn? thesis；Peptide hydrazide；Native chemical ligation

O629

A

10.7503／cjcu20160417

（Ed.：P，H，W，K）

?Supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21372058，21572043）.

2016?06?12.

日期：2016?10?19.

國家自然科學(xué)基金（批準(zhǔn)號(hào)：21372058，21572043）資助.

聯(lián)系人簡介：李宜明，男，博士，副教授，主要從事翻譯后修飾蛋白的化學(xué)合成、結(jié)構(gòu)及功能方面的研究. E?mails：lym2007@mail.ustc.edu.cn；ymli@hfut.edu.cn