伊卜拉伊木·胡達(dá)拜爾迪，郭金亮，孫貝貝，李 偉，石長青

（塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

外源性褪黑激素對非繁殖季節(jié)和田羊睪丸曲細(xì)精管組織結(jié)構(gòu)的影響

伊卜拉伊木·胡達(dá)拜爾迪，郭金亮，孫貝貝，李 偉，石長青

（塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

為研究外源性褪黑激素（MT）對非繁殖季節(jié)和田羊睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響，選取體重?zé)o明顯差異且年齡2歲的健康和田公羊8只，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組，每組4只。在非繁殖季節(jié)對試驗(yàn)組每只羊的耳根下方皮下埋植20 mg的MT顆粒，對照組不做埋植處理。兩組同舍飼養(yǎng)26 d后，屠宰取出睪丸，用Bouin氏液固定、石蠟切片、H.E染色、光學(xué)顯微鏡觀察。結(jié)果表明：試驗(yàn)組和田羊睪丸曲細(xì)精管的管壁厚度、直徑和細(xì)胞層數(shù)均明顯增加，與對照組間均差異極顯著（P＜0.01），同時曲細(xì)精管內(nèi)各類生精細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對照組。表明外源性MT對非繁殖季節(jié)和田公羊的曲細(xì)精管中生精細(xì)胞發(fā)育有促進(jìn)作用。

褪黑激素；非繁殖季節(jié)；和田公羊；睪丸；曲細(xì)精管

和田羊是主要分布于新疆和田地區(qū)的短尾脂粗毛羊種，具有抗病力強(qiáng)、耐粗飼的特點(diǎn)。其羊毛長而均勻，彈性、光澤和潔白度好，是和田地毯織造的優(yōu)良原料，2006年被農(nóng)業(yè)部再次列入《國家級畜禽遺傳資源保護(hù)名錄》［1］。但和田羊?qū)儆诙倘照詹溉閯游铮湫云鞴俚陌l(fā)育、衰退與生殖機(jī)能活動均存在明顯的季節(jié)性變化規(guī)律，僅在秋冬之際開始性腺活動。而在非繁殖季節(jié)，性腺發(fā)育停止，終止繁殖活動［2］，因此造成其繁殖率不高。大量的研究發(fā)現(xiàn)，動物季節(jié)性繁殖活動主要是通過光照周期調(diào)節(jié)松果腺對MT（褪黑激素）的合成與分泌的節(jié)律而實(shí)現(xiàn)［3］。MT對短日照動物普遍都有提前其發(fā)情期的作用［4］，可通過補(bǔ)充外源性MT來使非繁殖季節(jié)的公羊處于精子發(fā)生的活性狀態(tài)，以此來調(diào)節(jié)動物繁殖的季節(jié)性［5］。目前，關(guān)于通過補(bǔ)充外源性MT對短日照動物如水貂［6］、山羊［7］和獺兔［8］等動物皮毛產(chǎn)量和品質(zhì)影響的研究較多，而對和田羊睪丸發(fā)育及其組織學(xué)結(jié)構(gòu)影響的研究較少。本試驗(yàn)對非繁殖季節(jié)的雄性和田羊皮下埋植MT，通過對其睪丸曲細(xì)精管組織結(jié)構(gòu)的觀察，分析外源性MT對和田公羊睪丸的影響，為和田羊的高效繁殖研究工作提供一定的參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與設(shè)備

褪黑激素埋植顆粒（MT，含量10 mg/顆粒），埋植器，Bouin氏固定液，梯度酒精（50%、75%、85%、95%、100%），切片石蠟，1%鹽酸酒精，二甲苯，中性樹膠，伊紅染液與蘇木精染液。YD-6D生物組織包埋機(jī)，DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），CX31光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），DHG-P246A電熱恒溫干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），DFC4500C萊卡顯微數(shù)碼照像系統(tǒng)（德國萊卡公司）。

1.2方法

1.2.1樣品采集于2015年6月1日，在塔里木大學(xué)實(shí)驗(yàn)站選取體重?zé)o明顯差異且年齡2歲的健康和田公羊8只，隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組，并編號（每組各4只），然后在試驗(yàn)組每只羊的耳根下方處皮下埋植20 mg的MT顆粒，對照組不做埋植處理。兩組羊同舍飼養(yǎng)26 d后，屠宰取出睪丸并切塊放入Bouin氏固定液中固定24 h。

1.2.2石蠟切片制備及H.E染色取出固定好的睪丸組織塊并修成5 mm×5 mm×2 mm大小，再將組織塊放入50%酒精12 h，然后經(jīng)過梯度酒精脫水（其中75%酒精12 h，85%、95%、100%酒精各1.5 h）。將脫水后的組織塊在酒精-二甲苯液中（1:1）過渡15 min。取出經(jīng)二甲苯透明、浸蠟、自動包埋機(jī)石蠟包埋。石蠟切片以5 μm的厚度連續(xù)切片，每間隔10張取1張切片鋪于45℃恒溫水浴鍋中展片，用涂有蛋白甘油的載玻片進(jìn)行撈片并放置在切片架中，在50℃恒溫干燥箱中烤片。再經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各10 min）透明，用梯度酒精（100%、95%、85%、75%）復(fù)水（各4 min），然后將水洗后的切片浸入蒸餾水2 min，蘇木精染色10 min，1%鹽酸酒精分化20 s，流水藍(lán)化，伊紅染色2 min，水洗后按50%、75%、80%、95%、100%梯度酒精順序脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明后用中性樹膠封片，自然風(fēng)干。

1.2.3數(shù)據(jù)測量及采集在光學(xué)顯微鏡（40倍物鏡）下觀察睪丸曲細(xì)精管的管壁厚度、直徑和管壁細(xì)胞層數(shù)。取每個公羊的睪丸組織切片10張，每張切片取10個曲細(xì)精管的正圓形切面，然后在400倍高倍鏡下，采用DFC4500C萊卡顯微數(shù)碼照像系統(tǒng)，以“十字”法測量曲細(xì)精管橫斷面的直徑、管壁厚度及管壁細(xì)胞層數(shù)，計算平均值。

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計軟件，對采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行One-wayAnova分析。統(tǒng)計結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，以P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與分析

如圖1所示，在非繁殖季節(jié)，和田羊睪丸實(shí)質(zhì)部分有大量的曲細(xì)精管分布，彼此之間界限明顯，曲細(xì)精管之間有結(jié)締組織為主要成分所構(gòu)成的睪丸間質(zhì)，其間有較多的睪丸間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)，核圓形、染色深。與對照組相比，試驗(yàn)組睪丸間質(zhì)組織比例較低，間質(zhì)細(xì)胞大多成群分布；其次試驗(yàn)組曲細(xì)精管管壁細(xì)胞排列緊密，壁厚且層數(shù)較多，處于不同發(fā)育時期的生精細(xì)胞層次清晰，并出現(xiàn)大量初級精母細(xì)胞，胞體大、核大而染色深，同時管腔中出現(xiàn)較多的精子。

圖1　和田羊睪丸曲細(xì)精管組織結(jié)構(gòu)觀察（H.E染色，200×）

對于對照組而言，其睪丸間質(zhì)組織比例相對高，間質(zhì)細(xì)胞大多散在，曲細(xì)精管壁薄，管壁細(xì)胞數(shù)量少，層數(shù)少且排列相對疏松，大多為精原細(xì)胞，同時有少量的初級精母細(xì)胞，而精子數(shù)量較少。

從表1可以看出，皮下埋植MT的試驗(yàn)組公羊睪丸內(nèi)曲細(xì)精管管壁厚度、管徑和細(xì)胞層數(shù)分別為286.00 μm ±20.72 μm、778.99 μm±58.13 μm和4.79層±0.22層，且均極顯著高于對照組的 218.82 μm±34.12 μm、616.81 μm±86.55 μm和3.16層±0.32層（P＜0.01）。

表1　試驗(yàn)組與對照組和田羊睪丸曲細(xì)精管組織結(jié)構(gòu)比較

3　討論

褪黑激素是由松果體合成并分泌的一種多功能神經(jīng)類激素，其通過下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）［10］，在下丘腦水平上調(diào)節(jié)促性腺激素的合成與分泌，進(jìn)而影響生殖系統(tǒng)功能，同時也能與垂體、睪丸、卵巢及腎上腺細(xì)胞的β腎上腺受體結(jié)合，直接調(diào)節(jié)促黃體生成素、泌乳素、P4和促卵泡刺激素等性腺激素的合成和分泌［11］。大量的研究發(fā)現(xiàn)，光照時間的長短可以影響MT的合成和分泌，而在雄性動物的睪丸中，有高親和力的Mel-1a型的褪黑激素受體，MT能通過與相應(yīng)受體的結(jié)合影響睪丸的生理學(xué)形態(tài)和生殖功能。對于綿羊和山羊、赤鹿及藍(lán)狐等短日照季節(jié)性發(fā)情動物，補(bǔ)充外源性MT對其生殖系統(tǒng)的發(fā)育有促進(jìn)作用［12-13］。雄性動物的繁殖性能與睪丸的發(fā)育有密切的關(guān)系，通過對睪丸組織學(xué)水平的研究可較為全面地反映其結(jié)構(gòu)與功能的變化規(guī)律［9］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對非繁殖季節(jié)的和田公羊皮下埋植外源性MT后，睪丸曲細(xì)精管管壁增厚、細(xì)胞層數(shù)增加，并出現(xiàn)精子等情況，表明通過補(bǔ)充非繁殖季節(jié)時期機(jī)體內(nèi)相對匱乏的褪黑激素，可使公羊在生理上提前從繁殖靜默狀態(tài)進(jìn)入繁殖活躍狀態(tài)，這與姚麗娟等［4］報道的MT能使成年綿羊繁殖季節(jié)提前到來的結(jié)果吻合，同時也與張培玉等［14］研究的外源性MT可以明顯促進(jìn)水貂睪丸發(fā)育及精子產(chǎn)生的報道相同。究其原因，這與補(bǔ)充外源性MT使動物體內(nèi)MT數(shù)量增加后，分布在睪丸組織中的MT受體與充足的MT結(jié)合［15］，直接調(diào)節(jié)垂體合成與分泌促性腺激素，繼而促進(jìn)曲細(xì)精管生精細(xì)胞發(fā)育與分化有關(guān)。

從試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在非繁殖季節(jié)，對照組睪丸曲細(xì)精管中也出現(xiàn)少量的精子，這個結(jié)果說明，羊作為已被長期馴化的短日照繁殖動物，繁殖行為受外部人工環(huán)境的影響較大。舍飼條件下，和田羊的繁殖生理變化除了受MT的合成與分泌影響外，還與營養(yǎng)水平和溫度條件有關(guān)，其協(xié)同影響機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。但從對照組與試驗(yàn)組在曲細(xì)精管的管壁厚度、管徑和細(xì)胞層數(shù)上差異極顯著的結(jié)果來看，在非繁殖季節(jié)通過埋植外源性MT對激發(fā)和田羊提前進(jìn)入繁殖狀態(tài)有著非常明顯的效果。

4　結(jié)論

在非繁殖季節(jié)，皮下埋置MT可以促進(jìn)和田羊睪丸曲細(xì)精管生精細(xì)胞的發(fā)育與分化，其管壁厚度、管腔直徑和細(xì)胞層數(shù)均顯著增大。

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Effects of Exogenous Melatonin on the Histological Structure of Seminiferous Tubule of Hetian Rams in Non-breeding Season

Yibulayimu·Hudabaierdi，GuoJinliang，Shi Changqing，et al
（Institute ofAnimal Science，TarumUnniversity，Alar 843300，Xinjiang，China）

In order toinvestigate the effects ofexogenous melatonin on histological structure of seminiferous tubule of Hetian rams in non-breedingseason，eight healthyHetian rams at the age oftwo-year old with similar bodyweight were allotted randomlyinto control group and experimental group，with 4 Hetian rams in each group.The rams in experimental group were implanted ofmelatonin capsules（20 mg）at the subcutaneous ofears，while the rams in control group were not implanted melatonin.After 26 days，the rams testis from two groups were removed and then fixed with Bouin's solution，embedded with paraffin，were cut 5 μm thick sections and stained with H.E，observed with optical microscopy.The results showed that the wall thickness，diameter and cell layers of seminiferous tubule in experimental group increased obviously over the control group（P＜0.01）.Results indicated that exogenous melatonin could promote the development ofspermatogenic cell ofHetian rams in non-breedingseason.

melatonin；non-breedingseason；Hetian ram；testis；seminiferous tubule

S852.2

A

2095-3887（2016）01-0019-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.01.006

2015-12-26

兵團(tuán)農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2014BA010）；國家大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201410757024）

伊卜拉伊木·胡達(dá)拜爾迪（1993-），男，本科。

石長青（1971-），男，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物生殖內(nèi)分泌方面的研究。