陸敬平，王沛

丹參酮ⅡA抑制血管平滑肌細胞增殖的機制

陸敬平1，王沛1

目的 探討丹參酮ⅡA抑制血管平滑肌細胞（VSMC）增殖的機制。方法 組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠腹主動脈VSMC，隨后分為對照組：VSMC加入50 μl 30% FBS培養(yǎng)液，A組：10 mg/L丹參酮ⅡA 25μl +30% FBS培養(yǎng)液25 μl，B組：20 mg/L丹參酮Ⅱ A 25μl +30% FBS培養(yǎng)液25 μl，每組設(shè)置4個復(fù)孔。采用四唑鹽（MTT）法檢測VSMC的細胞毒性，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，RT-PCR檢測p21 mRNA相對表達量。結(jié)果 MTT檢測結(jié)果，對照組吸光度值明顯高于藥物干預(yù)A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；B組吸光度值明顯低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。丹參酮Ⅱ A干預(yù)的A組和B組細胞凋亡率明顯高于對照組，而B組凋亡率明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。與對照組比較，A組和B組p21 mRNA的相對表達量明顯升高，同時，B組p21 mRNA相對表達量明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 丹參酮Ⅱ A對VSMC的增殖有明顯的抑制作用，其機制可能與細胞周期蛋白p21表達增強有關(guān)。

丹參酮ⅡA；血管平滑肌細胞；增殖；細胞周期蛋白p21

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。⒏哐獕?、糖尿病血管并發(fā)癥等均為老年人群多發(fā)的心血管疾病，血管平滑肌細胞（VSMC）的異常增殖和遷移是其共同病理基礎(chǔ)，目前認(rèn)為抑制VSMC增殖是抑制心血管疾病發(fā)展的基礎(chǔ)[1,2]。丹參是心血管疾病治療常用中藥，具有廣泛的藥理作用[3]。丹參酮ⅡA是一種從丹參中提取出來的脂溶性有效成分，能夠保護血管內(nèi)皮細胞、抑制血小板聚集、改善心肌缺血區(qū)冠狀動脈血流量[4]。目前有研究顯示[5]，丹參酮ⅡA能夠抑制VSMC增殖。本研究采用組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠主動脈VSMC，并分別采用不同濃度丹參酮ⅡA進行干預(yù)，分析各組細胞情況，探討丹參酮ⅡA抑制VSMC增殖的潛在機制。

1　材料與方法

1.1試劑及材料 胎牛血清（江蘇綠葉生物科技有限公司）、丹參酮ⅡA（中國藥品生物鑒定所）、低糖DMEM培養(yǎng)液（上?？ㄟ~舒Kmaels科技實業(yè)有限公司）、RT-PCR試劑盒（Promega公司）、Binding Buffer與V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（上?？ㄟ~舒Kmaels科技實業(yè)有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠VSMC培養(yǎng) 選取100～150 g健康雄性SD大鼠，由西安交通大學(xué)提供，脫臼處死后，無菌條件下取大鼠腹主動脈，并將外周結(jié)締組織、內(nèi)膜去除；將中膜層組織用預(yù)冷的PBS沖洗后剪成小塊，接種于培養(yǎng)瓶。細胞置于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM低糖培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過一周生長，細胞從組織邊緣爬出，此后每隔一天換一次培養(yǎng)液，待細胞長至70%～80%融合狀態(tài)后即可傳代。然后取4～6代VSMC 進行純化，分組干預(yù)。

1.2.2細胞分組和染色 對照組：VSMC加入50 μl 30% FBS培養(yǎng)液，A組：10 mg/L丹參酮Ⅱ A 25μl +30% FBS培養(yǎng)液25 μl，B組：20 mg/L丹參酮ⅡA 25μl +30% FBS培養(yǎng)液25 μl。使用試劑盒，免疫組化法對細胞平滑肌α-肌動蛋白進行染色。

1.2.3四唑鹽（MTT）法檢測細胞毒性 收集對數(shù)期細胞，將細胞消化，離心制成細胞懸液，在倒置顯微鏡下測定細胞濃度，接種于96孔板，加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置37℃、 5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后，按1.2.2分組給藥，每組設(shè)4個復(fù)孔，在振動器上混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，每孔加入20μl MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩充分融解結(jié)晶物。在酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度，波長570 nm，吸光度值越高提示促進細胞增殖，越低提示抑制增殖。

1.2.4流式細胞儀檢測凋亡 將6代VSMC細胞接種于32孔培養(yǎng)板，2×105個/孔，置37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，按1.2.2分組給藥，每組設(shè)4個復(fù)孔，在振動器上混勻，孵育6 h，棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶消化分散為單細胞，將細胞懸液用PBS洗滌2次，2000 rpm離心10 min，棄去上清，加100 μl Binding Buffer與10 μl FITC標(biāo)記的Annexin V（20 μg/ml），避光30 min，加5 μl碘化丙啶（50 μg/ml），避光5 min，加400 μl Binding Buffer，立即進行流式細胞術(shù)定量檢測，同時以不加Annexin V的一管為陰性對照，利用CEI I Quest軟件檢測分析并計算凋亡細胞占總細胞的百分?jǐn)?shù)，即細胞凋亡百分率。

1.2.5RT-PCR檢測 給藥干預(yù)48 h后，按照Ttizol Reagent的說明書步驟進行總RNA提取，采用PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA：45℃，45 min；鳥類成髓細胞白細胞病毒反轉(zhuǎn)錄酶激活：94℃，2 min；合成第2條cDNA鏈并進行PCR擴增，變性：94℃，30 s；退火：58℃，1 min；延伸：72℃，1 min；最終延伸：72℃，7 min，進行1個循環(huán)。p21引物上游序列：5’-C GAGAACGGTGGAACTTTGAC-3’，下游序列：5’-CAGGGCTCAGGTAGACCTTG-3’，擴增片段長度106 bp。內(nèi)參β-actin引物上游序列：5’-AACAATAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’，下游序列：5’-TACTGAGGTAGTCTGTCAG-3’，擴增片段長度241 bp。制備2.0%瓊脂糖凝膠，加入PCR擴增產(chǎn)物，電泳電壓100V，約30～40 min，將電泳膠放入凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1VSMC鑒定結(jié)果 經(jīng)特異的平滑肌α-肌動蛋白免疫細胞化學(xué)染色后，高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量棕色，并且與長軸平行的纖維細絲，即平滑肌α-肌動蛋白絲（圖1）。

2.2各組平滑肌細胞抑制比較 對照組吸光度值明顯高于藥物干預(yù)A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；B組吸光度值明顯低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.3各組細胞凋亡情況比較 丹參酮Ⅱ A干預(yù)的A組和B組細胞凋亡率明顯高于對照組，而B組凋亡率明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）（表2）。

2.4各組p21 mRNA相對表達量比較 與對照組比較，A組和B組p21 mRNA的相對表達量明顯升高，同時，B組p21 mRNA相對表達量明顯高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3，圖2）。

3　討論

圖1　平滑肌α-肌動蛋白免疫細胞化學(xué)染色（×400）

表1　各組吸光度值比較（n=4）

表2　各組凋亡率比較（n=4）

表3　各組p21 RNA相對表達量比較（n=4）

圖2　各組p21凝膠電泳圖（1：對照組；2：A組；3：B組）

丹參，性味苦、微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛、清心除煩、活血通經(jīng)之功效，是常用活血化瘀中藥[6]，臨床常用于治療冠心病和心絞痛等心腦血管疾病。大量動物實驗表明，丹參具有多種藥理作用，如增加血流量、擴張冠狀動脈、減慢心率、增強心肌收縮力、改善心臟功能和促進組織修復(fù)等[7]。丹參酮ⅡA是丹參的主要有效成分，可抑制各種因素引起的平滑肌細胞增殖，在微循環(huán)和抗缺血缺氧方面具有積極作用[8]。

VSMC在正常生理條件下，發(fā)揮調(diào)節(jié)血管張力，分泌釋放調(diào)節(jié)因子和維持血管正常功能的作用[9]。當(dāng)機體血管內(nèi)皮功能受到損傷，多種細胞因子釋放并作用于VSMC膜受體，能夠激活細胞內(nèi)多條信號傳導(dǎo)通路，促進VSMC增殖[10,11]。VSMC自中膜遷移至內(nèi)膜下間隙并異常增殖是多種心血管疾病的共同病理基礎(chǔ)，抑制VSMC增殖是目前治療心血管疾病的靶點[12]。本研究分離大鼠腹主動脈通過培養(yǎng)獲得VSMC，采用不同濃度的丹參酮ⅡA進行干預(yù)，通過MTT法檢測細胞毒性，結(jié)果顯示，與對照組相比，丹參酮ⅡA干預(yù)的A組和B組吸光度值明顯降低，提示丹參酮ⅡA具有抑制VSMC增殖的作用，與李澤爭等[13]和沈曉君等[14]研究結(jié)果基本一致。

VSMC的增殖和遷移受多種細胞、生長因子以及活性代謝產(chǎn)物的影響和調(diào)節(jié)，本質(zhì)上是受相關(guān)基因調(diào)控[15]。各種細胞增殖周期相對固定，改變細胞周期只能對G1期進行調(diào)控。G1/S檢驗點是細胞在G1期進入S期之前必須要通過的，如果細胞受到抑制，則不能通過該點，細胞周期停頓，增殖受到抑制。p21基因定位于人染色體6p21.2，DNA長度為85kb[16]，p21基因表達的產(chǎn)物p21蛋白定位于細胞核中，由164個氨基酸組成，是細胞周期負(fù)性調(diào)控蛋白。在某些條件的誘導(dǎo)下，p21基因可促進細胞凋亡[17]。本研究通過檢測3組p21 RNA表達和細胞凋亡顯示，對照組p21 mRNA相對表達量和細胞凋亡率明顯低于藥物干預(yù)的A組和B組，提示丹參酮ⅡA可能通過抑制VSMC的p21 mRNA表達抑制其增殖。該結(jié)果與李靖等[18]研究結(jié)果相似。

綜上所述，丹參酮II A對FBS誘導(dǎo)的VSMC增殖有明顯的抑制作用，其機制可能與細胞周期蛋白p21表達增強有關(guān)。但本研究僅設(shè)置了2個藥物濃度，有必要增加濃度找出細胞抑制率約50%的濃度，以排除藥物濃度過高對細胞的毒性作用。

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本文編輯：姚雪莉

Mechanism of tanshinone ⅡA in inhibiting proliferation of vascular smooth muscle cells

LU Jing-ping*, WANG Pei.
*First Clinical School, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China.

LU Jing-ping, E-mail: addaa163@163.com

Objective To discuss the mechanism of tanshinone ⅡA (Tan ⅡA) in inhibiting the proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods The abdominal aortic VSMC were cultured by using tissue explant method, and then VSMC were divided into control group [in nutrient solution of 30% fetal bovine serum (FBS, 50 μl)], group A [in nutrient solution of Tan ⅡA (10 mg/L, 25 μl) and 30% FBS (25 μl)], and group B [in nutrient solution of Tan ⅡA (20 mg/L, 25 μl) and 30% FBS (25 μl)]. The cytotoxicity of VSMC was detected by using methyl thiazolyl tetrazolium test (MTT), apoptosis of VSMC was detected by using flow cytometer, and relative expression of cyclin (p21) mRNA was measured by using reverse transcription-polymerase chain reaction (RTPCR). Results The results of MTT detection showed that the absorbance value was significantly higher in control group than that in group A and group B (all P<0.05), and was significantly lower in group B than that in group A (P<0.05). The apoptosis of VSMC was significantly higher in group A and group B than that in control group, and was significantly higher in group B than that in group A (all P<0.05). Compared with control group, the relative expression of p21 mRNA increased significantly in group A and group B, and was significantly higher in group B than that in group A (all P<0.05). Conclusion Tan ⅡA has significant inhibitory effect on the proliferation of VSMC, and the mechanism maybe related to higher expression of p21.

Tanshinone ⅡA; Vascular smooth muscle cells; Proliferation; Cyclin (p21)

R541.4

A

1674-4055(2016)10-1220-03

1210000 南京,南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

陸敬平,E-mail：addaa163@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.10.20