劉 亞，張曉軍

(1.商洛市中心醫(yī)院藥劑科，商洛 726000；2.第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系物理教研室，西安 710032)

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·藥理·

外源性骨強(qiáng)化蛋白對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎小鼠的療效研究

劉 亞1，張曉軍2*

(1.商洛市中心醫(yī)院藥劑科，商洛 726000；2.第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系物理教研室，西安 710032)

目的 評(píng)估外源性骨強(qiáng)化蛋白(sclerostin，SOST)治療強(qiáng)直性脊柱炎的療效。方法BALB/cIL-4小鼠每隔2周皮下注射2mg人蛋白多糖，8周后誘導(dǎo)脊柱炎(PGISp)模型，PGISp小鼠體內(nèi)SOST表達(dá)下調(diào)。隨后將PGISp小鼠根據(jù)治療方案，分為SOST組與陽(yáng)性對(duì)照組。SOST組注射2.5μg重組SOST(recombinantSOST，rSOST)，持續(xù)8周。陽(yáng)性對(duì)照組注射同劑量外源性Wnt通路抑制因子Dickkopf1(DKK-1)，同樣持續(xù)8周。使用雙能X線骨密度儀(DEXA) 檢測(cè)2組小鼠組織學(xué)和骨骼變化，評(píng)估外周關(guān)節(jié)及中軸骨疾病的發(fā)展?fàn)顩r。結(jié)果SOST組外周或軸向疾病發(fā)展，骨質(zhì)密度或疾病嚴(yán)重程度均無(wú)改善。rSOST注射8h達(dá)到峰值，注射24h后血漿SOST質(zhì)量濃度水平較高，導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)SOST血清水平累積。免疫組化法檢查骨細(xì)胞水平，陽(yáng)性對(duì)照組中未受累關(guān)節(jié)內(nèi)骨細(xì)胞水平顯著低于受累關(guān)節(jié)內(nèi)骨細(xì)胞水平；SOST組小鼠不同關(guān)節(jié)之間的骨細(xì)胞水平無(wú)差異。組間未受累關(guān)節(jié)進(jìn)行比較，陽(yáng)性對(duì)照組優(yōu)于SOST組。結(jié)論rSOST未能降低關(guān)節(jié)內(nèi)的骨細(xì)胞水平，但其具有生物活性。今后需要改變劑量，提高骨靶向能力，從而影響骨生成；目前外源性骨強(qiáng)化蛋白療效不及DKK-1。

強(qiáng)直性脊柱炎；Wnt通路抑制因子Dickkopf1；骨強(qiáng)化蛋白；骨形成

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis，AS)是一種典型的脊椎關(guān)節(jié)病[1]。AS患者體內(nèi)Wnt信號(hào)途徑促進(jìn)AS患者骨細(xì)胞發(fā)育，導(dǎo)致過(guò)度骨生成[2]。Wnt抑制因子骨強(qiáng)化蛋白(sclerostin,SOST)可特異性地抑制骨生成，改善患者生活質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 雙能X線骨密度儀(DEXA，上海愛(ài)申科技發(fā)展股份有限公司)。

1.2 試藥 人蛋白多糖(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；SOST(諾華制藥有限公司，瑞士)；蘇木精-伊紅染色液(舜田生物有限公司)；DKK-1(上海伯易生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物 3月齡雌性BALB/cIL-4小鼠，體質(zhì)量為40±5g(南京君科生物工程有限公司)。本研究遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則，獲得動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有小鼠均飼養(yǎng)于特定無(wú)菌房，可隨意飲水且配有標(biāo)準(zhǔn)食物。

2 方法

2.1 疾病誘導(dǎo)及治療 小鼠每隔2周皮下注射2mg人蛋白多糖，連續(xù)8周誘導(dǎo)脊柱炎(PGISp)模型，PGISp小鼠體內(nèi)SOST表達(dá)下調(diào)。隨后將PGISp小鼠分為SOST組與陽(yáng)性對(duì)照組。SOST組每日皮下注射2.5μg重組SOST(recombinantSOST，rSOST)杜氏磷酸鹽緩沖液，連續(xù)注射8周。陽(yáng)性對(duì)照組注射同等劑量的DKK-1。

2.2 觀察指標(biāo) 每日記錄所有小鼠的外周疾病，并進(jìn)行評(píng)分。用雙能X線骨密度儀(DEXA) 檢測(cè)骨密度。首次注射rSOST之前，采集小鼠血清，掃描骨密度，作為基線值。rSOST注射8周后處死小鼠，用于組織學(xué)檢查。

2.3 組織學(xué)評(píng)分 椎間關(guān)節(jié)經(jīng)蘇木精-伊紅(H&E)染色后，采用組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分：1分：肌腱端炎，炎性細(xì)胞聚集在椎間盤或纖維環(huán)滲透；2分：椎間盤破壞<50%；3分：椎間盤破壞>50%；4分：軟骨/骨關(guān)節(jié)強(qiáng)直。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPadPrism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用百分比表示，用t檢驗(yàn)比較組間差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SOST組血漿質(zhì)量濃度分析 SOST組首次注射rSOST 24h內(nèi),用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA法)檢測(cè)rSOST血漿質(zhì)量濃度?rSOST注射后15min及1,2,4,8和24h的血漿質(zhì)量濃度分別為2.0,3.2,3.5,3.0,3.5和2.5ng·mL-1?

治療第4周后，檢測(cè)循環(huán)系統(tǒng)中的SOST血漿質(zhì)量濃度，SOST組和陽(yáng)性對(duì)照組SOST血漿質(zhì)量濃度明顯下降；第8周，2組SOST的血漿質(zhì)量濃度略有回升。

3.2 2組外周關(guān)節(jié)病變比較SOST組小鼠，外周關(guān)節(jié)炎先于軸向疾病，爪腫脹度和后腿關(guān)節(jié)僵硬度評(píng)分較高。2.5μg劑量的rSOST未改善外周關(guān)節(jié)病情，見(jiàn)圖1。2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1rSOST對(duì)外周關(guān)節(jié)疾病的影響

Fig.1ImpactofrSOSTtreatmentonperipheraldiseaseprogression

3.3 中軸骨病變組織學(xué)分析 組織學(xué)檢查軸向疾病進(jìn)展。蘇木精-伊紅(H&E)染色椎間關(guān)節(jié)評(píng)分顯示：2組病變椎間關(guān)節(jié)和異位關(guān)節(jié)無(wú)差異；2組小鼠的椎間關(guān)節(jié)和椎間盤均受到破壞；2組小鼠全身、脊椎和股骨骨礦物質(zhì)密度(BMD)組間存在差異，治療初期及結(jié)束，2組骨密度變化無(wú)差異。見(jiàn)圖2。

圖2rSOST對(duì)骨密度的影響

A.全身骨密度(P=0.09)；B.脊柱終端和骨盆骨密度(P=0.01)；C.右股骨骨密度(P=0.02)；D.全身骨密度(P=0.06)；E.2組整體骨密度隨時(shí)間變化(P=0.01)

Fig.2rSOSTimpactonbonedensity

A.thewholebodybonemineraldensity(P=0.09);B.terminalspineandpelvisbonemineraldensity(P=0.01);C.therightfemurbonemineraldensity(P=0.02);D.thewholebodybonemineraldensity(P=0.06);E.overallbonemineraldensitychangesovertimeinthe2groups(P=0.01)

陽(yáng)性對(duì)照組未受累關(guān)節(jié)內(nèi)骨細(xì)胞水平顯著低于受累關(guān)節(jié)內(nèi)骨細(xì)胞水平(P<0.05)；SOST組不同關(guān)節(jié)之間的骨細(xì)胞水平無(wú)差異。2組未受累關(guān)節(jié)骨細(xì)胞水平比較，SOST組顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。

4 討論

目前沒(méi)有任何治療方案可逆轉(zhuǎn)或顯著減緩強(qiáng)直性脊柱炎過(guò)度骨生成。多項(xiàng)研究證實(shí)，AS患者體內(nèi)Wnt抑制因子SOST水平下降，導(dǎo)致Wnt信號(hào)上調(diào)，促進(jìn)骨生成[3-5]。此外，HaynesKR等[6]報(bào)道，通過(guò)抑制β-catenin功能，可實(shí)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路抑制[7]。因此，外源性補(bǔ)充SOST可抑制Wnt信號(hào)途徑，成為潛在的AS治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，注射rSOST后，SOST組的PGISp小鼠，周圍關(guān)節(jié)或中軸骨骼關(guān)節(jié)病變并未改善，說(shuō)明外源性SOST并未發(fā)揮抑骨作用。其無(wú)效原因可能為SOST被血液中的其他蛋白附著，從而阻止SOST的活性。

rSOST治療無(wú)效因素包括rSOST自身藥效、rSOST穩(wěn)定性、rSOST靶向性和注射劑量。研究表明，人體SOST在小鼠模型有效(人SOST轉(zhuǎn)基因小鼠)，可減少骨質(zhì)增生[8]。SOST高表達(dá)可有效阻止Wnt信號(hào)途徑，最終導(dǎo)致骨細(xì)胞活動(dòng)和骨生成顯著降低。本研究SOST組注射rSOST后，ELISA法24h內(nèi)檢測(cè)rSOST血漿質(zhì)量濃度。rSOST注射后15min及1，2，4，8和24h的血漿質(zhì)量濃度分別為2.0，3.2,3.5,3.0,3.5和2.5ng·mL-1。循環(huán)系統(tǒng)中rSOST保持較高的血漿質(zhì)量濃度，說(shuō)明rSOST在小鼠體內(nèi)降解緩慢。外源性SOST導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)SOST總體水平提高，但是外周關(guān)節(jié)炎先于軸向疾病，爪腫脹度和后腿關(guān)節(jié)僵硬度評(píng)分較高，外周關(guān)節(jié)病情未改善，2組小鼠全身、脊椎和股骨骨礦物質(zhì)密度(BMD)存在組間差異。

研究結(jié)果表明，雖然外源性SOST提高循環(huán)系統(tǒng)SOST水平，并無(wú)效抑制骨生成，但不排除SOST的潛在臨床價(jià)值。PGISp小鼠模型椎間關(guān)節(jié)SOST表達(dá)下調(diào)。外源性SOST治療PGISp小鼠，尚屬首次。注射劑量2.5μg并未達(dá)到療效，建議今后的相關(guān)研究可增大藥物劑量，同時(shí)也應(yīng)觀察其安全性和毒性。

總之，本研究基于Wnt信號(hào)途徑抑制作用，初步應(yīng)用SOST治療AS。雖然未改善病情，但仍具有生物活性。今后可借助劑量反映并提高SOST骨靶向能力，實(shí)現(xiàn)抑制骨生成。

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Treatment of a mouse model of ankylosing spondylitis with exogenous sclerostin

LIUYa1，ZHANGXiaojun2*

(1.PharmacyofDepartment，ShangluoCentralHospitalofShaanxi，Shangluo726000，China；2.DepartmentofPhysics，SchoolofBiomedicalEngineering，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi′an710032，China)

ObjectiveToevaluatethecurativeeffectofexogenousbonestrengtheningprotein(sclerostin,SOST)forthetreatmentofankylosingspondylitis.MethodsTheproteoglycan(2mg)-inducedspondylitis(PGISp)mousemodelinwhichwepreviouslydemonstrateddownregulatedSOSTexpression，wasusedforthisstudy.Micewereinjectedwith2.5μgrSOST/dayforaperiodof8weeksfollowinginductionofdisease.SamedoseDickkopf1(DKK-1)wasinjectedincontrolgroup，also8weeks.AxialskeletondiseasedevelopmentwasassessedbyhistologyandskeletalchangesexaminedusingDEXA.ResultsSOSTtreatmenthadnoeffectonperipheraloraxialdiseasedevelopment，bonedensityordiseaseseverity.InjectedrSOSTwasstableover8handresiduallevelswereevident24hafterinjection，resultinginacumulativeincreaseinSOSTserumlevelsoverthetreatmenttimecourse.ImmunohistochemicalexaminationofSOSTlevelswithinthejointsincontrolgroupshowedasignificantdecreaseinthepercentageofpositiveosteocytesintheunaffectedjointscomparedtotheaffectedjoints，whilenodifferencewasobservedinSOSTtreatedmice.ThissuggeststhatrSOSTtreatmentincreasesthenumberofSOST-positiveosteocytesinunaffectedjointsbutnotaffectedjoints，despiteofhavingnoimpactonthenumberofjointsaffectedbydisease.ConclusionsAlthoughnotdisease-modifying，rSOSTtreatmentdidappeartoregulateSOSTlevelsinthejointssuggestingbiologicalactivity.FurtherdoseresponsestudiesarerequiredandSOSTmayrequiremodificationstoimproveitsbonetargetingabilityinordertoaffecttissueformationtoameaningfullevelinthismodel.ThecurativeeffectisinferiortoDKK-1.

ankylosingspondylitis；Dickkopf1；sclerostin；boneformation

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(編號(hào):51377163)

劉亞，女，主管藥師

*通信作者：張曉軍，男，教授

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.014

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A

2016-04-21)