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        外源性骨強(qiáng)化蛋白對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎小鼠的療效研究

        2016-11-22 08:19:03張曉軍
        西北藥學(xué)雜志 2016年6期
        關(guān)鍵詞:血漿小鼠

        劉 亞,張曉軍

        (1.商洛市中心醫(yī)院藥劑科,商洛 726000;2.第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系物理教研室,西安 710032)

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        ·藥理·

        外源性骨強(qiáng)化蛋白對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎小鼠的療效研究

        劉 亞1,張曉軍2*

        (1.商洛市中心醫(yī)院藥劑科,商洛 726000;2.第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系物理教研室,西安 710032)

        目的 評(píng)估外源性骨強(qiáng)化蛋白(sclerostin,SOST)治療強(qiáng)直性脊柱炎的療效。方法BALB/cIL-4小鼠每隔2周皮下注射2mg人蛋白多糖,8周后誘導(dǎo)脊柱炎(PGISp)模型,PGISp小鼠體內(nèi)SOST表達(dá)下調(diào)。隨后將PGISp小鼠根據(jù)治療方案,分為SOST組與陽(yáng)性對(duì)照組。SOST組注射2.5μg重組SOST(recombinantSOST,rSOST),持續(xù)8周。陽(yáng)性對(duì)照組注射同劑量外源性Wnt通路抑制因子Dickkopf1(DKK-1),同樣持續(xù)8周。使用雙能X線骨密度儀(DEXA) 檢測(cè)2組小鼠組織學(xué)和骨骼變化,評(píng)估外周關(guān)節(jié)及中軸骨疾病的發(fā)展?fàn)顩r。結(jié)果SOST組外周或軸向疾病發(fā)展,骨質(zhì)密度或疾病嚴(yán)重程度均無(wú)改善。rSOST注射8h達(dá)到峰值,注射24h后血漿SOST質(zhì)量濃度水平較高,導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)SOST血清水平累積。免疫組化法檢查骨細(xì)胞水平,陽(yáng)性對(duì)照組中未受累關(guān)節(jié)內(nèi)骨細(xì)胞水平顯著低于受累關(guān)節(jié)內(nèi)骨細(xì)胞水平;SOST組小鼠不同關(guān)節(jié)之間的骨細(xì)胞水平無(wú)差異。組間未受累關(guān)節(jié)進(jìn)行比較,陽(yáng)性對(duì)照組優(yōu)于SOST組。結(jié)論rSOST未能降低關(guān)節(jié)內(nèi)的骨細(xì)胞水平,但其具有生物活性。今后需要改變劑量,提高骨靶向能力,從而影響骨生成;目前外源性骨強(qiáng)化蛋白療效不及DKK-1。

        強(qiáng)直性脊柱炎;Wnt通路抑制因子Dickkopf1;骨強(qiáng)化蛋白;骨形成

        強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosingspondylitis,AS)是一種典型的脊椎關(guān)節(jié)病[1]。AS患者體內(nèi)Wnt信號(hào)途徑促進(jìn)AS患者骨細(xì)胞發(fā)育,導(dǎo)致過(guò)度骨生成[2]。Wnt抑制因子骨強(qiáng)化蛋白(sclerostin,SOST)可特異性地抑制骨生成,改善患者生活質(zhì)量。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器 雙能X線骨密度儀(DEXA,上海愛(ài)申科技發(fā)展股份有限公司)。

        1.2 試藥 人蛋白多糖(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司);SOST(諾華制藥有限公司,瑞士);蘇木精-伊紅染色液(舜田生物有限公司);DKK-1(上海伯易生物科技有限公司)。

        1.3 動(dòng)物 3月齡雌性BALB/cIL-4小鼠,體質(zhì)量為40±5g(南京君科生物工程有限公司)。本研究遵循動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則,獲得動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有小鼠均飼養(yǎng)于特定無(wú)菌房,可隨意飲水且配有標(biāo)準(zhǔn)食物。

        2 方法

        2.1 疾病誘導(dǎo)及治療 小鼠每隔2周皮下注射2mg人蛋白多糖,連續(xù)8周誘導(dǎo)脊柱炎(PGISp)模型,PGISp小鼠體內(nèi)SOST表達(dá)下調(diào)。隨后將PGISp小鼠分為SOST組與陽(yáng)性對(duì)照組。SOST組每日皮下注射2.5μg重組SOST(recombinantSOST,rSOST)杜氏磷酸鹽緩沖液,連續(xù)注射8周。陽(yáng)性對(duì)照組注射同等劑量的DKK-1。

        2.2 觀察指標(biāo) 每日記錄所有小鼠的外周疾病,并進(jìn)行評(píng)分。用雙能X線骨密度儀(DEXA) 檢測(cè)骨密度。首次注射rSOST之前,采集小鼠血清,掃描骨密度,作為基線值。rSOST注射8周后處死小鼠,用于組織學(xué)檢查。

        2.3 組織學(xué)評(píng)分 椎間關(guān)節(jié)經(jīng)蘇木精-伊紅(H&E)染色后,采用組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分:1分:肌腱端炎,炎性細(xì)胞聚集在椎間盤或纖維環(huán)滲透;2分:椎間盤破壞<50%;3分:椎間盤破壞>50%;4分:軟骨/骨關(guān)節(jié)強(qiáng)直。

        2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用GraphPadPrism統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用百分比表示,用t檢驗(yàn)比較組間差異。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 SOST組血漿質(zhì)量濃度分析 SOST組首次注射rSOST 24h內(nèi),用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA法)檢測(cè)rSOST血漿質(zhì)量濃度?rSOST注射后15min及1,2,4,8和24h的血漿質(zhì)量濃度分別為2.0,3.2,3.5,3.0,3.5和2.5ng·mL-1?

        治療第4周后,檢測(cè)循環(huán)系統(tǒng)中的SOST血漿質(zhì)量濃度,SOST組和陽(yáng)性對(duì)照組SOST血漿質(zhì)量濃度明顯下降;第8周,2組SOST的血漿質(zhì)量濃度略有回升。

        3.2 2組外周關(guān)節(jié)病變比較SOST組小鼠,外周關(guān)節(jié)炎先于軸向疾病,爪腫脹度和后腿關(guān)節(jié)僵硬度評(píng)分較高。2.5μg劑量的rSOST未改善外周關(guān)節(jié)病情,見(jiàn)圖1。2組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        圖1rSOST對(duì)外周關(guān)節(jié)疾病的影響

        Fig.1ImpactofrSOSTtreatmentonperipheraldiseaseprogression

        3.3 中軸骨病變組織學(xué)分析 組織學(xué)檢查軸向疾病進(jìn)展。蘇木精-伊紅(H&E)染色椎間關(guān)節(jié)評(píng)分顯示:2組病變椎間關(guān)節(jié)和異位關(guān)節(jié)無(wú)差異;2組小鼠的椎間關(guān)節(jié)和椎間盤均受到破壞;2組小鼠全身、脊椎和股骨骨礦物質(zhì)密度(BMD)組間存在差異,治療初期及結(jié)束,2組骨密度變化無(wú)差異。見(jiàn)圖2。

        圖2rSOST對(duì)骨密度的影響

        A.全身骨密度(P=0.09);B.脊柱終端和骨盆骨密度(P=0.01);C.右股骨骨密度(P=0.02);D.全身骨密度(P=0.06);E.2組整體骨密度隨時(shí)間變化(P=0.01)

        Fig.2rSOSTimpactonbonedensity

        A.thewholebodybonemineraldensity(P=0.09);B.terminalspineandpelvisbonemineraldensity(P=0.01);C.therightfemurbonemineraldensity(P=0.02);D.thewholebodybonemineraldensity(P=0.06);E.overallbonemineraldensitychangesovertimeinthe2groups(P=0.01)

        陽(yáng)性對(duì)照組未受累關(guān)節(jié)內(nèi)骨細(xì)胞水平顯著低于受累關(guān)節(jié)內(nèi)骨細(xì)胞水平(P<0.05);SOST組不同關(guān)節(jié)之間的骨細(xì)胞水平無(wú)差異。2組未受累關(guān)節(jié)骨細(xì)胞水平比較,SOST組顯著高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。

        4 討論

        目前沒(méi)有任何治療方案可逆轉(zhuǎn)或顯著減緩強(qiáng)直性脊柱炎過(guò)度骨生成。多項(xiàng)研究證實(shí),AS患者體內(nèi)Wnt抑制因子SOST水平下降,導(dǎo)致Wnt信號(hào)上調(diào),促進(jìn)骨生成[3-5]。此外,HaynesKR等[6]報(bào)道,通過(guò)抑制β-catenin功能,可實(shí)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路抑制[7]。因此,外源性補(bǔ)充SOST可抑制Wnt信號(hào)途徑,成為潛在的AS治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn),注射rSOST后,SOST組的PGISp小鼠,周圍關(guān)節(jié)或中軸骨骼關(guān)節(jié)病變并未改善,說(shuō)明外源性SOST并未發(fā)揮抑骨作用。其無(wú)效原因可能為SOST被血液中的其他蛋白附著,從而阻止SOST的活性。

        rSOST治療無(wú)效因素包括rSOST自身藥效、rSOST穩(wěn)定性、rSOST靶向性和注射劑量。研究表明,人體SOST在小鼠模型有效(人SOST轉(zhuǎn)基因小鼠),可減少骨質(zhì)增生[8]。SOST高表達(dá)可有效阻止Wnt信號(hào)途徑,最終導(dǎo)致骨細(xì)胞活動(dòng)和骨生成顯著降低。本研究SOST組注射rSOST后,ELISA法24h內(nèi)檢測(cè)rSOST血漿質(zhì)量濃度。rSOST注射后15min及1,2,4,8和24h的血漿質(zhì)量濃度分別為2.0,3.2,3.5,3.0,3.5和2.5ng·mL-1。循環(huán)系統(tǒng)中rSOST保持較高的血漿質(zhì)量濃度,說(shuō)明rSOST在小鼠體內(nèi)降解緩慢。外源性SOST導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)SOST總體水平提高,但是外周關(guān)節(jié)炎先于軸向疾病,爪腫脹度和后腿關(guān)節(jié)僵硬度評(píng)分較高,外周關(guān)節(jié)病情未改善,2組小鼠全身、脊椎和股骨骨礦物質(zhì)密度(BMD)存在組間差異。

        研究結(jié)果表明,雖然外源性SOST提高循環(huán)系統(tǒng)SOST水平,并無(wú)效抑制骨生成,但不排除SOST的潛在臨床價(jià)值。PGISp小鼠模型椎間關(guān)節(jié)SOST表達(dá)下調(diào)。外源性SOST治療PGISp小鼠,尚屬首次。注射劑量2.5μg并未達(dá)到療效,建議今后的相關(guān)研究可增大藥物劑量,同時(shí)也應(yīng)觀察其安全性和毒性。

        總之,本研究基于Wnt信號(hào)途徑抑制作用,初步應(yīng)用SOST治療AS。雖然未改善病情,但仍具有生物活性。今后可借助劑量反映并提高SOST骨靶向能力,實(shí)現(xiàn)抑制骨生成。

        [1] 楊俊玲,盧軍,趙翡翠,等.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志,2015,30(3): 329-332.

        [2] 王琦,王美美.Wnt信號(hào)途徑在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨代謝改變中的作用[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2012,16(6): 426-429.

        [3] 陳小靜,高艷虹.Wnt信號(hào)通路調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2013, 33(1): 99-103.

        [4] 李玲慧,詹紅生,丁道芳,等.基于Wnt信號(hào)通路的骨質(zhì)疏松癥分子靶向治療研究進(jìn)展[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2014,30(8): 712-715.

        [5]HuZ,LinD,QiJ,etal.SerumfrompatientswithankylosingspondylitiscanincreasePPARD,fra-1,MMP7,OPGandRANKLexpressioninMG63cells[J].Clinics(SaoPaulo),2015,70(11): 738-742.

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        [8] 王紫薇,田京.骨硬化蛋白單克隆抗體治療骨質(zhì)疏松[J].中國(guó)組織工程研究,2013,17(33): 6021-6026.

        Treatment of a mouse model of ankylosing spondylitis with exogenous sclerostin

        LIUYa1,ZHANGXiaojun2*

        (1.PharmacyofDepartment,ShangluoCentralHospitalofShaanxi,Shangluo726000,China;2.DepartmentofPhysics,SchoolofBiomedicalEngineering,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

        ObjectiveToevaluatethecurativeeffectofexogenousbonestrengtheningprotein(sclerostin,SOST)forthetreatmentofankylosingspondylitis.MethodsTheproteoglycan(2mg)-inducedspondylitis(PGISp)mousemodelinwhichwepreviouslydemonstrateddownregulatedSOSTexpression,wasusedforthisstudy.Micewereinjectedwith2.5μgrSOST/dayforaperiodof8weeksfollowinginductionofdisease.SamedoseDickkopf1(DKK-1)wasinjectedincontrolgroup,also8weeks.AxialskeletondiseasedevelopmentwasassessedbyhistologyandskeletalchangesexaminedusingDEXA.ResultsSOSTtreatmenthadnoeffectonperipheraloraxialdiseasedevelopment,bonedensityordiseaseseverity.InjectedrSOSTwasstableover8handresiduallevelswereevident24hafterinjection,resultinginacumulativeincreaseinSOSTserumlevelsoverthetreatmenttimecourse.ImmunohistochemicalexaminationofSOSTlevelswithinthejointsincontrolgroupshowedasignificantdecreaseinthepercentageofpositiveosteocytesintheunaffectedjointscomparedtotheaffectedjoints,whilenodifferencewasobservedinSOSTtreatedmice.ThissuggeststhatrSOSTtreatmentincreasesthenumberofSOST-positiveosteocytesinunaffectedjointsbutnotaffectedjoints,despiteofhavingnoimpactonthenumberofjointsaffectedbydisease.ConclusionsAlthoughnotdisease-modifying,rSOSTtreatmentdidappeartoregulateSOSTlevelsinthejointssuggestingbiologicalactivity.FurtherdoseresponsestudiesarerequiredandSOSTmayrequiremodificationstoimproveitsbonetargetingabilityinordertoaffecttissueformationtoameaningfullevelinthismodel.ThecurativeeffectisinferiortoDKK-1.

        ankylosingspondylitis;Dickkopf1;sclerostin;boneformation

        國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(編號(hào):51377163)

        劉亞,女,主管藥師

        *通信作者:張曉軍,男,教授

        10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.014

        R

        A

        2016-04-21)

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