王海麗，蒙 蒙

(寶雞市食品藥品檢驗檢測中心，寶雞 721013)

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HPLC法測定兒童回春顆粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量

王海麗，蒙 蒙

(寶雞市食品藥品檢驗檢測中心，寶雞 721013)

目的 建立HPLC法同時測定兒童回春顆粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量。方法 色譜柱為KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈-0.3mL·L-1磷酸溶液，梯度洗脫；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：210nm；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：25 ℃。結(jié)果 哈巴苷與哈巴俄苷的線性范圍分別為0.296～5.92μg·mL-1(r=0.999 9)和 0.103～2.06μg·mL-1(r=0.999 8)；平均回收率分別為99.3%(RSD=0.50%)和 98.9%(RSD=0.72%)。結(jié)論 該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為兒童回春顆粒的質(zhì)量控制方法。

兒童回春顆粒；哈巴苷；哈巴俄苷；HPLC

兒童回春顆粒為兒童常用藥物，由玄參、桔梗、羚羊角、淡豆豉等20味中藥制成[1]，具有清熱解毒、透表化痰的功效。其制劑中玄參具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)的功效，主要成分為哈巴苷和哈巴俄苷，故本實驗在參考有關(guān)文獻(xiàn)[2-11]的基礎(chǔ)上，采用HPLC梯度洗脫法同時測定兒童回春顆粒中哈巴苷、哈巴俄苷的含量，該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為兒童回春顆粒的質(zhì)量控制方法，為兒童回春顆粒的質(zhì)量監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waterse2695高效液相色譜儀，檢測器Waters2498；BT125D型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 供試樣品兒童回春顆粒(貴州漢方藥業(yè)有限公司，批號: 1406105，1404102，1409168)；陰性對照樣品，自制。哈巴苷對照品(批號111729-200602)、哈巴俄苷對照品(批號111730-200604)，均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為進(jìn)口色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：KromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)。流動相：乙腈(A)-0.3mL·L-1磷酸溶液(B)梯度洗脫(0～10min，10%A；10～20min，10%～35%A；20～25min，35%～50%A；25～30min，50%～75%A；30～35min，75%A；35～55min，75%～10%A)。流速：1.0mL·min-1；柱溫：25 ℃；檢測波長：210nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取哈巴苷與哈巴俄苷對照品適量，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇制成質(zhì)量濃度為29.6和10.3μg·mL-1的混合對照品儲備液。

精密量取混合對照品儲備液1mL，置于10mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，制成質(zhì)量濃度分別為2.96 和1.03μg·mL-1的混合對照品溶液，按照2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，得到對照品HPLC圖譜，見圖1A。

2.2.2 供試品溶液的制備 取兒童回春顆粒，研細(xì)，取2.0g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇25mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸漬1h，超聲處理(功率500W，頻率40kHz)45min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)充減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。按照2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，得到兒童回春顆粒樣品HPLC圖譜，見圖1B。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照制劑工藝制備不含玄參的陰性樣品，按照2.2.2項下方法制備陰性對照樣品溶液，并按照2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，得到兒童回春顆粒陰性對照HPLC圖譜，結(jié)果陰性對照無干擾，見圖1C。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.樣品；C.陰性樣品；1.哈巴苷；2.哈巴俄苷

Fig.1HPLCchromatograms

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1，2，4，8，10和20μL，注入液相色譜儀，按照2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得哈巴苷回歸方程：Y=1.17×105X-1 873.9(r=0.999 9)；哈巴俄苷回歸方程：Y=1.90×106X-809.3(r=0.999 8)。結(jié)果表明，哈巴苷和哈巴俄苷質(zhì)量濃度分別在0.296～5.92和0.103～2.06μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度實驗 精取吸取同一混合對照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次(n=6)，記錄峰面積，結(jié)果哈巴苷和哈巴俄苷峰面積RSD值分別為0.52%和0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一批號(1406105)兒童回春顆粒供試品溶液，分別于配制后0，2，6，12和24h后進(jìn)樣，測定各成分的峰面積，計算。結(jié)果顯示樣品中哈巴苷、哈巴俄苷峰面積積分值基本穩(wěn)定不變，其RSD值分別為0.65%和0.91%，表明在室溫條件下，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性實驗 取同一批次(1406105)供試品適量，研細(xì)，精密稱取6份，按照2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，測定哈巴苷和哈巴俄苷的峰面積，計算。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷的RSD值分別為0.42%和0.85%，表明該方法重復(fù)性良好。2.3.5 加樣回收率實驗 取已知含量的樣品(1406105，其中含哈巴苷、哈巴俄苷分別為0.030 7和0.010 9mg·g-1)適量，研細(xì)，精密稱定6份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對照品儲備液1mL，按照2.2.2項下方法進(jìn)行制備，依法測定。實驗結(jié)果表明，該方法回收性良好。見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.4 樣品測定 取兒童回春顆粒樣品3批(批號1406105，1406102，1409168)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，計算哈巴苷和哈巴俄苷的含量，結(jié)果3批樣品中哈巴苷的含量分別為0.030 7，0.029 5和0.031 2mg·g-1，哈巴俄苷的含量分別為0.010 9，0.011 3和0.010 1mg·g-1。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 本實驗分別對所測成分在200～400nm波長處進(jìn)行掃描，結(jié)果哈巴苷和哈巴俄苷均在210nm處有最大吸收，參考2010年版《中國藥典》一部玄參[12]中哈巴苷、哈巴俄苷含量測定項下的檢測波長選擇在210nm處進(jìn)行測定。

3.2 流動相的選擇 兒童回春顆粒分別用乙腈-0.3mL·L-1磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水為流動相進(jìn)行實驗，結(jié)果用乙腈-0.3mL·L-1磷酸溶液為流動相分離效果較好，保留時間更穩(wěn)定，因此選用乙腈-0.3mL·L-1磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫。

本實驗以HPLC梯度洗脫法測定兒童回春顆粒中哈巴苷和哈巴俄苷的含量，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于兒童回春顆粒的內(nèi)在質(zhì)量控制。

[1]WS3-B-2276-97-1，國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].

[2] 陳登豐，何孝金.HPLC法測定養(yǎng)陰降糖膠囊中哈巴苷和哈巴俄苷的含量[J]. 中國醫(yī)院用藥評價與分析，2014， 14(8)：703-705.

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[12]國家藥典委員會．中國藥典2010年版[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010：108.

Determination of harpagide and harpagoside in Ertong Huichun Granules by HPLC

WANGHaili，MENGMeng

(BaojiFoodandDrugTestingCenter，Baoji721013，China)

ObjectiveToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofharpagideandharpagosideinErtongHuichunGranules.MethodsKromasilC18(250mm×4.6mm，5μm)columnwasused.Themobilephasewasacetonitrile-0.3mL·L-1phosphoricacidsolutionbygradientelution；theflowratewas1.0mL·min-1;thedetectionwavelengthwassetat210nm;theinjectionvolumewas10μL;thecolumntemperaturewas25 ℃.ResultsThelinearrangeofharpagidewas0.296-5.92μg·mL-1(r=0.999 9)，andharpagosidewas0.103-2.06μg·mL-1(r=0.999 8).Theaveragerecoveryofharpagidewas99.3%(RSD=0.50%)，andharpagosidewas98.9%(RSD=0.72%).ConclusionThismethodissimple，accurate，reliableandreproducible.ItcanbeusedforthequalitycontrolofErtongHuichunGranules.

ErtongHuichunGranules；harpagide；harpagoside；HPLC

tandards；B.sample；C.blanksample；1.harpagide；2.harpagoside

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.010

R

A

2016-01-05)