蔡 艷，張 莉，李海燕，馬小亞，張抗懷

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院藥學部，西安 710004)

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腦脊液中利奈唑胺質(zhì)量濃度測定方法的建立及臨床應用

蔡 艷，張 莉，李海燕，馬小亞，張抗懷

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院藥學部，西安 710004)

目的 建立人腦脊液中利奈唑胺質(zhì)量濃度測定方法并開展臨床檢測。方法 使用高效液相色譜儀(HPLC)，采用外標法。色譜條件為：色譜柱：Agilent5TC-C18(2)，250mm×4.6mm；流動相：甲醇-水(40∶60)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長：250nm。結果 利奈唑胺質(zhì)量濃度在0.31～40mg·L-1范圍內(nèi)線性關系良好(r=0.999 6)，定量下限為0.31mg·L-1，方法回收率、提取回收率均大于85%，高、中、低3個質(zhì)量濃度日內(nèi)、日間精密度的RSD值均小于5%。藥物干擾試驗中美羅培南、頭孢曲松及頭孢他啶對利奈唑胺的測定無影響。對8例患者開展27例次腦脊液利奈唑胺質(zhì)量濃度測定，平均質(zhì)量濃度為2.67±1.11mg·L-1。結論 建立的利奈唑胺腦脊液質(zhì)量濃度測定方法簡單、方便、靈敏、準確，可用于臨床檢測；利奈唑胺在腦脊液中的質(zhì)量濃度個體差異較大。

利奈唑胺；腦脊液；中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染；高效液相色譜法

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染治療難度大、死亡率高，目前指南推薦在經(jīng)驗治療階段均使用以萬古霉素為基礎的聯(lián)合治療方案。但萬古霉素腦脊液穿透率低(腦脊液/血液的質(zhì)量濃度比值為7%～14%)，且有腎毒性，對于存在腎功能損害或前期使用萬古霉素療效不佳的患者，治療更為棘手[1-2]。利奈唑胺是噁唑烷酮類衍生物，其組織分布廣泛，耐藥率低，是目前重癥和多重耐藥菌感染的主要治療藥物之一[3-4]。國外文獻顯示，利奈唑胺可作為化膿性腦膜炎的治療選擇，且安全性較萬古霉素更高[5]，可用于新生兒及老年患者。但是利奈唑胺的腦脊液質(zhì)量濃度在不同患者間差異較大，建議使用利奈唑胺治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時監(jiān)測其腦脊液中的藥物質(zhì)量濃度[6]。因此，本課題擬建立利奈唑胺腦脊液質(zhì)量濃度測定方法，應用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者，初步探討利奈唑胺在腦脊液中的分布情況，為該類患者治療方案的調(diào)整提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國戴安公司生產(chǎn)，包括P680四元泵、PDA-100光電二極管序列檢測器、自動脫氣機、柱溫箱、自動進樣器、Chromeleon色譜工作站)；超純水機(Milli-Qplus，美國milipope公司)；臺式高速離心機(TG1650-WS，湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 試藥 利奈唑胺對照品(加拿大多倫多研究化學品公司，批號5-ARP-79-1)；注射用頭孢他啶(葛蘭素史克制藥有限公司，批號15010026)；注射用頭孢曲松(上海羅氏制藥有限公司，批號SH6069)；注射用美羅培南(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號150320902)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.3 腦脊液 空白腦脊液：入住神經(jīng)外科、考慮為非感染性疾病、且近期在院外未使用藥物的患者，經(jīng)同意后行腰椎穿刺留取的腦脊液作為空白腦脊液，用于建立測定方法；已使用利奈唑胺的患者，在住院期間需開展腦脊液常規(guī)、生化檢查時經(jīng)患者同意后行腰椎穿刺后留取；或已行腦室引流的患者從引流管中緩慢抽取適量用于測定。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent5TC-C18(2)，250mm×4.6mm；流動相：甲醇-水(40∶60)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長：250nm；進樣量：10μL。

2.2 樣品處理與測定 參照李淑娟等[7]建立的腦脊液樣品處理方法，精密量取適量空白腦脊液，加入等量甲醇渦旋混勻1min，離心(25 ℃，10 000r·min-1，10min)，吸取上清液測定，記錄色譜峰面積。將其代入標準曲線方程，求出藥物質(zhì)量濃度。

2.3 方法專屬性 分別取空白腦脊液、利奈唑胺標準液及含利奈唑胺的腦脊液樣品，按照樣品處理方法處理后進行測定。

2.4 標準曲線的制備 配制含利奈唑胺梯度質(zhì)量濃度為40，20，10，5，2.5，1.25，0.63和0.31mg·L-1的腦脊液樣品，編號為1～8，按照樣品處理方法進行操作，記錄峰面積。以樣品的峰面積為縱坐標，以利奈唑胺質(zhì)量濃度為橫坐標作圖，采用最小二乘法進行線性回歸，得標準曲線方程及相關系數(shù)。

2.5 回收率試驗 配制質(zhì)量濃度為 1.25，5和20mg·L-1的腦脊液樣品，按照2. 2項下方法處理后分析測定，每一質(zhì)量濃度測定5個樣品，記錄峰面積，并帶入標準曲線方程計算質(zhì)量濃度，與實際質(zhì)量濃度進行比較，計算方法回收率。同法配制并處理上述3種質(zhì)量濃度的腦脊液各5份，另取與腦脊液樣品相同質(zhì)量濃度的利奈唑胺對照品溶液，將2組峰面積比進行比較，計算提取回收率。

2.6 精密度試驗 取適量空白腦脊液，配制成質(zhì)量濃度分別為20，5和1.25mg·L-1的樣品溶液各5份，按照樣品處理方法進行處理，分別在同日內(nèi)測定5次，連續(xù)測定3d，計算腦脊液日內(nèi)及日間精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取適量空白腦脊液，配制成質(zhì)量濃度分別為20，5和1.25mg·L-1的樣品溶液，分別考察室溫放置穩(wěn)定性(24h)、樣品處理后穩(wěn)定性(室溫24h)、長期冷凍穩(wěn)定性(-20 ℃保存20d)以及凍融穩(wěn)定性(反復凍融3次)，按照2.2項下方法處理后測定其質(zhì)量濃度。

2.8 干擾性試驗 由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的經(jīng)驗治療方案中往往會使用2種抗菌藥物同時覆蓋陽性菌和陰性菌，因此，將常用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的抗革蘭陰性菌藥物頭孢曲松、頭孢他啶和美羅培南作為干擾藥物。將美羅培南、頭孢曲松和頭孢他啶配制成適當質(zhì)量濃度的腦脊液溶液，進樣測定，記錄保留時間；將上述干擾藥品加入到含利奈唑胺的腦脊液溶液中，進樣測定，觀察其他抗菌藥物對利奈唑胺質(zhì)量濃度的測定有無影響。

2.9 患者腦脊液中利奈唑胺的質(zhì)量濃度測定 收集8位神經(jīng)外科診斷為顱內(nèi)感染或肺部感染，且使用利奈唑胺的患者，在利奈唑胺第4次給藥后，第5次或之后任何一次給藥前測定谷質(zhì)量濃度。對于多次行腰椎穿刺或行腦室引流的患者可多次測定。

3 結果

3.1 方法專屬性 腦脊液中利奈唑胺的高效液相色譜圖見圖1。利奈唑胺的保留時間為12.25min，腦脊液中的內(nèi)源性雜質(zhì)峰在2～3min之間，不干擾利奈唑胺的測定。

圖1 腦脊液中利奈唑胺的HPLC圖

A.空白腦脊液；B.利奈唑胺溶液；C.含利奈唑胺的腦脊液樣品;1.利奈唑胺Fig.1HPLCchromatogramsoflinezolidincerebrospinalfluid

A.blankcerebrospinalfluid；B.linezolidsolution；C.cerebrospinalfluidsample;1.linezolid

3.2 標準曲線 線性回歸方程為Y=2.438 9X+0.266 5，r=0.999 6，利奈唑胺質(zhì)量濃度在0.31～40mg·L-1范圍內(nèi)線性關系良好，定量下限為0.31mg·L-1。

3.3 精密度與回收率 日內(nèi)、日間精密度及提取回收率、方法回收率結果見表1。由表1可知，本方法的日內(nèi)、日間的RSD值均小于5%，說明有良好的精密度；提取回收率和方法回收率也較高，達到試驗要求。

表1 利奈唑胺測定方法的回收率和精密度

Tab.1Recoveryandprecisionoflinezoliddetermination

利奈唑胺質(zhì)量濃度/mg·L-1日內(nèi)RSD/%日間RSD/%提取回收率/%方法回收率/%203.814.8692.1097.1852.843.6984.6599.191.254.324.1796.3596.42

3.4 樣品穩(wěn)定性 見表2。由表2可知，利奈唑胺腦脊液樣品放置24h、樣品處理后室溫放置24h和反復凍融3次的RSD值均小于5%，而長期冷凍20d的RSD值大于15%。

表2 樣品穩(wěn)定性

Tab.2Samplestability

利奈唑胺質(zhì)量濃度/mg·L-1室溫24hRSD/%處理后室溫24hRSD/%冷凍20dRSD/%反復凍融3次RSD/%202.513.6710.132.7853.772.4819.014.211.254.084.2224.192.58

3.5 干擾性試驗 測得的美羅培南、頭孢曲松和頭孢他啶3種藥物的保留時間分別為3.47，2.84和3.13min，與利奈唑胺的保留時間相差較遠，對利奈唑胺測定無影響。見圖2。

3.6 治療藥物監(jiān)測 8名神經(jīng)外科患者診斷為顱內(nèi)感染或肺部感染，已使用利奈唑胺(劑量均為600mg，ivgtt，q12h)，因診斷或治療需要行腰穿或腦室引流時抽取腦脊液測定，每位患者測定次數(shù)為1～5次。患者基本信息及腦脊液中利奈唑胺質(zhì)量濃度測定結果見表3。其中6名患者細菌培養(yǎng)呈陽性，利奈唑胺對致病菌的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC，紙片法測定，測定結果由我院微生物室提供)均為1或2mg·L-1。8例患者共測定27例次，測得腦脊液中利奈唑胺平均質(zhì)量濃度為2.67±1.11mg·L-1，患者轉(zhuǎn)歸情況均為治愈或好轉(zhuǎn)。

圖2 藥物干擾性試驗

A.含美羅培南和利奈唑胺的腦脊液樣品；B.含頭孢曲松的和利奈唑胺的腦脊液樣品；C.含頭孢他啶和利奈唑胺的腦脊液樣品；1.美羅培南；2.頭孢曲松；3.頭孢他啶；4.利奈唑胺

Fig.2Interferenceexperiments

A.cerebrospinalfluidcontainingmeropenemandlinezolid；B.cerebrospinalfluidcontainingceftriaxoneandlinezolid；C.cerebrospinalfluidcontainingceftazidimeandlinezolid;1.meropenem; 2.ceftriaxone; 3.ceftazidime; 4.linezolid

表3 患者基本信息及其腦脊液中利奈唑胺質(zhì)量濃度

Tab.3Patientsinformationandmonitorresultsoflinezolidlevelincerebrospinalfluid

序號性別年齡體質(zhì)量/kg診斷腦脊液質(zhì)量濃度測定次數(shù)范圍/mg·L-1與MIC值比較治療轉(zhuǎn)歸1女5450面肌痙攣術后;顱內(nèi)感染32.08～4.13>MIC治愈2男6758化膿性腦膜炎22.76～4.52>MIC治愈3男3875腦膠質(zhì)瘤術后;顱內(nèi)感染41.55～2.64>MIC好轉(zhuǎn)4女7053腦出血術后;顱內(nèi)感染52.07～4.45未測定好轉(zhuǎn)5男2977開放性顱腦損傷;顱內(nèi)感染50.82～1.98MIC好轉(zhuǎn)7男5760顱內(nèi)感染;肺部感染31.22～4.12未測定好轉(zhuǎn)8男6672腦膿腫41.94～3.55>MIC好轉(zhuǎn)

4 討論

本研究在李淑娟等[7]建立的利奈唑胺腦脊液質(zhì)量濃度測定方法的基礎上，對色譜條件進行了調(diào)整，結果顯示，該方法所得利奈唑胺峰形好，與內(nèi)源性物質(zhì)分離完全，定量限、精密度和回收率等均能達到試驗要求。同時，我們增加了干擾性試驗，將常用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的抗革蘭陰性菌藥物頭孢曲松、頭孢他啶和美羅培南加入到樣品溶液中，結果發(fā)現(xiàn)上述3種藥物對腦脊液中利奈唑胺質(zhì)量濃度的測定均無影響。因此，該方法適用于監(jiān)測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者腦脊液中利奈唑胺的質(zhì)量濃度。

本研究中8名中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者均使用了相同劑量的利奈唑胺(600mg，q12h)測定谷質(zhì)量濃度。結果表明，8名患者的腦脊液谷質(zhì)量濃度范圍在0.82～4.52mg·L-1之間，個體差異較大，平均質(zhì)量濃度為2.67±1.11mg·L-1，與文獻[8-9]結果相似。對于產(chǎn)生個體差異的原因，YogevR等[8]認為與腦膜炎性程度、年齡關系均不大，可能與不同患者腦積水程度不同而導致與腦脊液容積差異有關，但由于他們并未測定腦脊液容積，所以對此相關性并未確立；同時他們的數(shù)據(jù)顯示，不同患者利奈唑胺在血漿中藥物質(zhì)量濃度差異也非常大，因此推測其他影響利奈唑胺組織分布的因素可能影響了腦脊液中質(zhì)量濃度。在國內(nèi)，張雷[10]開展了利奈唑胺在中國人群的群體藥代/藥效動力學研究，結果表明，體質(zhì)量可能是影響利奈唑胺血藥質(zhì)量濃度的重要因素。本研究中體質(zhì)量較輕的女性患者腦脊液質(zhì)量濃度較其他高，原因可能類似，但由于樣本量小，暫不能得出上述結論。另外，8名患者治療結果均較好，其中有5例患者利奈唑胺腦脊液中谷質(zhì)量濃度均高于其對病原菌的MIC值，1名患者多次測定谷質(zhì)量濃度仍低于MIC，但最終也達到了較好的效果，其原因可能是腦脊液中利奈唑胺消除時間較血漿中長，經(jīng)多次給藥后腦脊液中藥物蓄積，質(zhì)量濃度不斷升高并最終達到有效治療質(zhì)量濃度[7]。因此，后續(xù)的研究中，有必要擴大檢測例數(shù)，對于有腦脊液引流或行多次腰椎穿刺的患者，測定多個時間點的藥物質(zhì)量濃度，并與患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、血肌酐、肝功能分級、腦脊液體積、是否手術和治療結局等做相關性分析，以獲得利奈唑胺在腦脊液中的動力學數(shù)據(jù)并了解其影響因素，為利奈唑胺治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染提供指導。

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Establishment and clinical application of determination method of linezolid concentration in human cerebrospinal fluid

CAIYan，ZHANGLi，LIHaiyan，MAXiaoya，ZHANGKanghuai

(DepartmentofPharmacy，theSecondAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity，Xi′an710004，China)

ObjectiveToestablishamethodforthedeterminationoflinezolidconcentrationinhumancerebrospinalfluidandapplythismethodtodeterminelinezolidconcentrationincerebrospinalfluidofintracranialinfectionpatients.MethodsReversedphasehigh-performanceliquidchromatographywasselectedandexternalstandardmethodwasused.TheseparationwasperformedonanAgilent5TC-C18(2) (250mm×4.6mm)chromatographiccolumn，mobilephasewasconsistedofmethanol-water(40∶60)withaflowrateof1.0mL·min-1.Thecolumntemperaturewas25 ℃andtheUVdetectionwavelengthwas250nm.Thelinezolidconcentrationwasdetectedinthecerebrospinalfluidofintracranialinfectionpatients.ResultsThecalibrationcurveoflinezolidshowedgoodlinearity(r=0.999 6)inthedruglevelrangefrom0.31mg·L-1to40mg·L-1andtheminimumquantitationlimitwas0.31mg·L-1.Theabsoluterecoveryandtherelativerecoveryratewereabove85%andtheintra-dayandinter-dayvariationwasbelow5%.Meropenem，ceftriaxoneandceftazidimehadnoinfluenceinthedeterminationoflinezolid.Thelinezolidconcentrationinthecerebrospinalfluidofintracranialinfectionpatientswas2.67±1.11mg·L-1.ConclusionThemethodwassimple，convenient，sensitiveandaccurate，itcanbeusedformonitoringlinezolidconcentrationofcerebrospinalfluid.Thelinezolidconcentrationinthecerebrospinalfluidvariedindifferentpatients.

linezolid；cerebrospinalfluid；centralnervoussysteminfection；HPLC

西安交通大學臨床新技術項目(編號：XJLS-2015-313)；西安交通大學第二附屬醫(yī)院科研基金青年項目(編號：YJ(QN)201309)

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.009

R

A

2016-01-12)