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        高效液相色譜法測(cè)定白駁丸中4種重樓皂苷含量

        2016-11-22 08:19:02江國(guó)榮
        西北藥學(xué)雜志 2016年6期

        孔 燕,陳 偉,江國(guó)榮*

        (1.徐州市中醫(yī)院,徐州 221009;2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州市吳門醫(yī)派研究院,蘇州 215009)

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        高效液相色譜法測(cè)定白駁丸中4種重樓皂苷含量

        孔 燕1,陳 偉2,江國(guó)榮2*

        (1.徐州市中醫(yī)院,徐州 221009;2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州市吳門醫(yī)派研究院,蘇州 215009)

        目的 建立高效液相色譜法測(cè)定白駁丸中4種重樓皂苷的含量。方法 采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫35 ℃;流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為水,進(jìn)行梯度洗脫;流速1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。結(jié)果 4種重樓皂苷質(zhì)量濃度在18.12~465.9 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9);平均回收率在95.11%~99.74%之間;RSD值均小于3.0%。結(jié)論 該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,可用于白駁丸的質(zhì)量控制。

        重樓皂苷;白駁丸;高效液相色譜法;含量測(cè)定

        A.stract:Objective To establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of 4 polyphyllins in Baibo Pills. Methods HPLC system consisted of Agilent Zorbax SB C18Column, gradient eluted with acetonitrile-water solution, the flow rate of the mobile phase was 1.0 mL·min-1, UV detection wavelength was set at 203 nm and column temperature was maintained at 35 ℃.Results 4 polyphyllins showed good linearity within the tested concentration scope(18.12-465.9 μg·mL-1,r=0.999 9);the method was validated and the recoveries of 4 polyphyllins were 95.11%~99.74%;RSD<3.0%. Conclusion This method is simple, accurate and reproducible,and can be used for the quality control for Baibo Pills.

        白駁丸為徐州市中醫(yī)院皮膚科常用制劑,具有補(bǔ)腎健脾、養(yǎng)血通絡(luò)、祛風(fēng)退斑的作用;已在臨床使用多年,對(duì)白癜風(fēng)、脂溢性脫發(fā)有顯著的療效。白駁丸組方藥味較多,主要由重樓等中草藥復(fù)方組成, 成分比較復(fù)雜。重樓為百合科植物云南重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz. 或七葉一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.)Hara 的干燥根莖[1-2];味苦,微寒,有小毒;歸肝經(jīng);清熱解毒,消腫止痛,涼肝定驚,主要用于療瘡癰腫[3],是一種臨床常用的皮膚科用藥。重樓主含甾體皂苷類成分,約占化合物總含量的80%[4]。

        為有效監(jiān)測(cè)該制劑的產(chǎn)品質(zhì)量,本研究采用高效液相色譜法測(cè)定重樓中4種皂苷含量,所得定性、定量分析方法可客觀地反映本制劑的內(nèi)在品質(zhì),為白駁丸的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)指標(biāo)提供了理論依據(jù)[5-7]。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters e2695-2998,PDA檢測(cè)器,Empower 3色譜工作站);Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);電子天平(Sartorius公司, BP115D,d=0.1 mg);高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司);超聲波清洗儀(KQ-400GKDV,昆山市超聲儀器有限公司)。

        1.2 試藥 甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純);乙腈(Sigma-Aldrich公司,色譜純);去離子水(Milli-Q超純水機(jī)制備,美國(guó)Millipore公司生產(chǎn))。4種重樓皂苷對(duì)照品:重樓皂苷Ⅰ(批號(hào)201103)、重樓皂苷Ⅱ(批號(hào)201103)、重樓皂苷Ⅵ(批號(hào)201203)和重樓皂苷Ⅶ(批號(hào)201303),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。9批白駁丸,批號(hào):150322,150418,150605,150703,150812,150917,151008,20151123,151212,均由徐州市中醫(yī)醫(yī)院制劑部生產(chǎn)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件 采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫為35 ℃;流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為水,梯度洗脫[8-9]:0~40 min A 30%~60%,40~50 min A 60%~30%;流速為1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

        2.2 溶液的制備

        2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取4種重樓皂苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成1 mL分別含重樓皂苷Ⅰ0.39 mg、重樓皂苷Ⅱ0.36 mg、重樓皂苷Ⅵ 0.47 mg和重樓皂苷Ⅶ 0.39 mg的混合溶液,即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

        2.2.2 供試品溶液的制備 取白駁丸適量,研細(xì),混勻,精密稱取1 g,置于25 mL量瓶中,加甲醇適量,超聲30 min,放冷,用甲醇定容至刻度,過濾,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.3 空白溶液 以相應(yīng)的溶劑為空白溶液,即得。

        2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液各10 μL,按照2.1項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè),4種重樓皂苷色譜峰分離度良好,空白無干擾,色譜圖見圖1。重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品峰的理論板數(shù)為63 966,主峰和雜質(zhì)分離良好,分離度為14.8,拖尾因子0.87。

        圖1 HPLC圖

        A.空白;B.對(duì)照品;C.白駁丸樣品20150605;1.重樓皂苷Ⅵ;2.重樓皂苷Ⅶ;3.重樓皂苷Ⅱ;4.重樓皂苷Ⅰ

        Fig.1 HPLC chromatograms

        2.4 線性關(guān)系 精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1,0.2,0.5,1.0和2.0 mL,分別置于2 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,進(jìn)樣10 μL,按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。分別以重樓皂苷質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程。將上述對(duì)照品溶液再稀釋后進(jìn)樣,根據(jù)峰高以信噪比S/N=3確定檢出下限,S/N=10確定定量下限。結(jié)果見表1。

        表1 4種重樓皂苷線性關(guān)系

        Tab.1 The linearity relationship of 4 polyphyllins

        對(duì)照品回歸方程r線性范圍/μg·mL-1檢出下限(S/N3∶1)/μg·mL-1定量下限(S/N10∶1)/μg·mL-1重樓皂苷ⅠY=6847X-348650.999919.71~394.26.5719.71重樓皂苷ⅡY=5926X-247030.999918.12~362.46.0418.12重樓皂苷ⅥY=4808X-272920.999923.30~465.97.76623.30重樓皂苷ⅦY=9859X-414340.999919.33~386.66.44319.33

        2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)20150605樣品的供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算4種重樓皂苷進(jìn)樣精密度,重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ 的RSD值分別為1.76%,1.22%,0.89%和1.04%,說明儀器精密度良好。

        2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取批號(hào)20150605樣品的供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0,4,6,8,12和24h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算4種重樓皂苷的穩(wěn)定性,重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ和重樓皂苷Ⅶ的RSD值分別為1.11%,1.26%,1.89%和0.98%,說明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取批號(hào)20150605樣品6份,每份1g,按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算4種重樓皂苷含量,其RSD值在0.77%~1.54%之間,說明方法重復(fù)性良好。

        2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測(cè)得含量的批號(hào)為20150605的樣品6份,各0.5g,分別置于25mL量瓶中,精密加入2.2.1項(xiàng)下混合重樓皂苷對(duì)照品溶液2.0mL,加甲醇適量,按照2.2.2項(xiàng)下方法制備溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積,計(jì)算回收率和RSD值,結(jié)果見表2。

        表2 4種重樓皂苷加樣回收率

        Tab.2 The recovery of 4 polyphyllins(n=6)

        2.9 樣品測(cè)定 取白駁丸樣品9批,按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定4種重樓皂苷含量,結(jié)果見表3。

        表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

        Tab.3 The results of content of 4 polyphyllins in Baibo Pills(mg·g-1)

        3 討論

        白駁丸是筆者所在醫(yī)院的臨床常用藥,主要由蒺藜、紅花和重樓等中藥組方而成。目前尚未制定對(duì)該制劑快速有效的質(zhì)量控制方法。重樓是白駁丸中有小毒的主要藥材,選定重樓中的主要成分進(jìn)行含量測(cè)定,并建立穩(wěn)定可靠的質(zhì)量控制方法比較符合制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究思路。

        由于中藥復(fù)方中成分眾多,等度洗脫難以充分分離,所以采用梯度洗脫的方法。選用AgilentZorbaxSBC18(250mm×4.6mm,5μm)色譜柱,采用梯度洗脫方法,比較了不同流動(dòng)相系統(tǒng)乙腈水溶液、甲醇水、乙腈醋酸水溶液。結(jié)果表明,乙腈水溶液系統(tǒng)優(yōu)于其他流動(dòng)相系統(tǒng),故選用乙腈水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)作為本制劑指紋圖譜流動(dòng)相系統(tǒng)。

        對(duì)樣品處理方法進(jìn)行比較。采用甲醇與水超聲提取,比較了甲醇的不同體積分?jǐn)?shù)(20%,40%,50%,60%,70%,80%,90%和100%)、不同提取方法(超聲、加熱回流、浸漬等)以及不同超聲時(shí)間(5,10,15,20,30,40,50和60min)。結(jié)果表明,甲醇優(yōu)于水;對(duì)不同提取方法進(jìn)行比較,結(jié)果表明,超聲提取峰面積大、時(shí)間短;對(duì)不同超聲時(shí)間進(jìn)行比較,結(jié)果表明,甲醇超聲30min以后,重樓4種皂苷各個(gè)峰的面積不增加。綜合上述各因素,選擇體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲30min。

        對(duì)不同柱溫與流速進(jìn)行比較,柱溫超過或低于35 ℃,色譜峰分離度??;流速高于或低于1.0mL·min-1,色譜峰分離度差。因此,選擇便于控制的柱溫35 ℃與流速1.0mL·min-1。

        本文建立了重樓4種皂苷含量測(cè)定方法,精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求。上述方法為制定白駁丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

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        Content determination of 4 polyphyllin in Baibo Pills by HPLC

        KONG Yan1,CHEN Wei2,JIANG Guorong2*

        (1.Xuzhou Hospital of Chinese Medicine,Xuzhou 221009,China;2.Suzhou Hospital of Chinese Medicine,Suzhou Academy of Wumen Chinese Medicine,Suzhou 215009,China)

        polyphyllin;Baibo Pills;HPLC;content determination

        reference substances;C.Baibo Pills;1.polyphyllinⅥ;2.polyphylli Ⅶ;3.polyphyllinⅡ;4.polyphyllinⅠ

        國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào):81303276)

        孔燕,女,副主任中藥師

        *通信作者:江國(guó)榮,男,主任中藥師

        10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.008

        R927.2

        A

        1004-2407(2016)06-0578-03

        2016-05-25)

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