閆高穎，張必榮，張 敏，周 陽，郭倩茹，楊 妍，張 勇

(陜西天谷生物科技集團(tuán)有限公司，西安 710065)

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水浸法提取銀杏葉總黃酮工藝的研究

閆高穎，張必榮*，張 敏，周 陽，郭倩茹，楊 妍，張 勇

(陜西天谷生物科技集團(tuán)有限公司，西安 710065)

目的 優(yōu)選水浸法提取銀杏黃酮工藝的最佳條件。方法 采用正交實(shí)驗(yàn)以及高效液相色譜法，對水提銀杏總黃酮的條件進(jìn)行了優(yōu)選。結(jié)果 浸提溫度、浸提時(shí)間、提取次數(shù)和料液比對銀杏葉總黃酮的提取率均有影響；最佳提取工藝為：100 ℃條件下水浸法提取3次，每次1 h，料液比為1∶26。結(jié)論 該提取工藝簡單可行，穩(wěn)定，適合大生產(chǎn)。

黃酮;銀杏提取物；水浸提??；正交實(shí)驗(yàn)

A.stract:Objective To study the optimal water extraction conditions of total flavones fromGinkgoleaves. Methods Using orthogonal test and HPLC， the water extraction conditions was optimized for total flavones fromGinkgoleaves. Results Extraction rate of total flavones was affected by the extraction temperature，extraction time， extraction times and material-liquid ratio.The optimal extraction conditions were concluded as follows:water as the extractant， material-liquid ratio 1∶26，extraction 3 times (each time 1 h)and extraction temperature 100 ℃.Conclusion The proposed procedure is simple，feasible， stable and suitable for mass production.

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬植物，現(xiàn)僅存1科1屬1種，素有裸子植物“活化石”之稱，作為中草藥在民間使用，最早見于14世紀(jì)的《日用本草》，主要用于咳嗽、氣喘及炎癥[1-2]。其樹皮、果實(shí)和葉子均有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，葉的藥用價(jià)值最高；銀杏葉中含有的主要有效物質(zhì)為銀杏黃酮，具有抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病等作用，因此引起了研究者的廣泛關(guān)注，具有廣闊的市場前景[3-7]。

目前，國內(nèi)銀杏葉提取物廠家很多，對于銀杏葉的提取工藝主要集中于采用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，但提取成本高，導(dǎo)致很多廠家紛紛停止生產(chǎn)，因此銀杏工藝的開發(fā)成為一個難點(diǎn)[8-10]。為了降低生產(chǎn)成本，本實(shí)驗(yàn)從提取環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，采用了水作為提取溶劑，優(yōu)選提取銀杏黃酮的最佳條件，對銀杏黃酮的大生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(thermo ultimate 3000型四元泵、二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器)；101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永興儀器有限公司)；BP25S 型電子天平(德國賽多利斯公司)；KQ型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Maxima超純水機(jī)(美國基因公司)。

1.2 試藥 銀杏葉(陜西昊源中藥飲片有限公司)；槲皮素對照品(供含量測定用，批號10081-201406)，山柰素對照品(供含量測定用，批號110861-201403)，異鼠李素對照品(供含量測定用，批號110860-201405)，以上對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定 參照2010年版《中國藥典》銀杏葉提取物總黃酮醇苷的測定方法，對銀杏葉黃酮的含量進(jìn)行測定[1]。

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇：4 mL·L-1，磷酸溶液(50∶50)；檢測波長：360 nm；流速：1 mL·min-1；溫度：30 ℃；色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖

A.對照品；B.供試品；C.陰性對照品；1.槲皮素；2.山柰素；3.異鼠李素

Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取槲皮素對照品、山柰素對照品和異鼠李素對照品，加甲醇制成1 mL分別含各對照品30，30和20 μg的混合溶液，作為對照品溶液，在-4 ℃儲存待用。

2.1.3 供試品溶液的制備 移取100 mL的提取液樣品進(jìn)行烘干，精密稱取適量的銀杏葉提取物干粉，加入甲醇∶ 250 mL·L-1鹽酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，置于50 mL圓底燒瓶中，加熱回流30 min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 陰性對照品溶液的制備 取空白樣品，按照供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備。

2.1.5 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)行測定，分別按照外標(biāo)法計(jì)算槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量，按照下式換算成總黃酮醇苷的含量?？傸S酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取銀杏葉藥材適量，采用正交實(shí)驗(yàn)法，選擇料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)為主要因素，每個因素各選取3個水平，按照L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別以銀杏總黃酮醇苷為指標(biāo)進(jìn)行考察，結(jié)果見表1～3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

Tab.1 The factors and leves of orthogonal experiment

水平因素A,提取時(shí)間/hB,提取溫度/℃C,料液比D,提取次數(shù)/次11801∶26122901∶282331001∶303

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of orthogonal experiment

水平因素A,提取時(shí)間/hB,提取溫度/℃C,料液比D,提取次數(shù)/次11801∶26122901∶282331001∶303

表3 方差分析結(jié)果

Tab.3 Results of variance analysis

方差來源離差平方和自由度FFα顯著性A0.081214.067F0.1=9*B1.2512216.895F0.05=19**C0.00521D0.01923.457誤差0.0002

注：*P<0.1，**P<0.05。

由表2可知，銀杏葉提取工藝以總黃酮醇苷為考察指標(biāo)，由極差R可知，各因素影響大小順序?yàn)锽>A>D>C。隨著溫度的逐步升高，總黃酮醇苷的提取量也逐步升高。由表3可知，因素B(提取溫度)對總黃酮醇苷提取率有極顯著性意義；其次是因素A；因素D和因素C對提取率無顯著性意義，可根據(jù)生產(chǎn)條件任取一水平，從節(jié)約能源和提高生產(chǎn)效率方面考慮，提取時(shí)間為分別選擇提取次數(shù)D3(3次) 和料液比C1(1∶26)，得出較佳提取工藝。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以最終確定的提取工藝以及純化工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3批，總黃酮醇苷的平均含量大于24%。

3 討論

關(guān)于銀杏黃酮的提取，傳統(tǒng)的提取工藝主要是有機(jī)溶劑法，以甲醇、丙酮以及乙醇為提取溶劑，前兩者有一定的毒性，均有少量的殘留，對最終的產(chǎn)品有一定的影響[11-14]。同時(shí)乙醇提取法存在蒸汽壓高，易燃易爆，且成本較高的特點(diǎn)；本工藝?yán)命S酮類化合物在水中的溶解度較好，銀杏總黃酮的提取率可達(dá)0.59%；同時(shí)以乙醇溶劑法為參照，銀杏總黃酮的提取率為0.61%，本工藝的提取率略低于乙醇溶劑法的提取率，但本工藝的提取液不經(jīng)水沉可直接進(jìn)行層析。此工藝一方面降低了提取環(huán)節(jié)的成本，另一方面縮減了銀杏純化工藝的時(shí)間與成本，同時(shí)提高了大生產(chǎn)的安全性。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，浸提溫度、浸提時(shí)間、浸提次數(shù)以及料液比對銀杏葉黃酮的提取效果均產(chǎn)生不同程度的影響。其中浸提溫度對銀杏葉總黃酮浸出率的影響達(dá)極顯著水平，隨著浸提溫度的升高，浸提效果越好。本實(shí)驗(yàn)銀杏葉最佳提取工藝為26倍量的水(1∶10∶8∶8)，100 ℃條件下提取3次，每次1 h。本工藝穩(wěn)定可行，已應(yīng)用于大生產(chǎn)。

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Study on the water extraction of total flavones from Ginkgo leaves

YAN Gaoying，ZHANG Birong*，ZHANG Min，ZHOU Yang，GUO Qianru，YANG Yan，ZHANG Yong

(Shaanxi Tiangu Biological Technology Group Limited Company， Xi′an 710065， China)

flavones;Ginkgobilobaextract； water extraction； orthogonal test

ubstances；B.test products；C.negative sample；1.quercetin；2.kaempferol；3.isorhamnetin

閆高穎，女，助理工程師

*通信作者：張必榮，男，高級工程師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.003

R284

A

1004-2407(2016)06-0560-03

2016-01-13)