鄧 凱，李新霞，李琳琳，王 燁，蘭 怡，毛新民

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)科研中心，烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830054；4.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054)

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兩色金雞菊醇提物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

鄧 凱1，李新霞2，李琳琳1，王 燁1，蘭 怡3，毛新民4*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)科研中心，烏魯木齊 830054；3.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，烏魯木齊 830054；4.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830054)

目的 建立兩色金雞菊醇提物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 通過(guò)薄層色譜法(TLC)、水分測(cè)定、熾灼殘?jiān)鼫y(cè)定、紫外分光光度法和高效液相色譜法對(duì)兩色金雞菊醇提物進(jìn)行質(zhì)量控制。結(jié)果 薄層色譜顯示供試品與對(duì)照品綠原酸斑點(diǎn)在相同的位置上顯相同顏色，供試品鑒別分離出馬里苷、黃酮奧卡寧和奧卡寧3個(gè)主要成分；兩色金雞菊醇提物的水分不得超過(guò)15%；熾灼殘?jiān)坏贸^(guò)16%；兩色金雞菊醇提物中綠原酸含量(C16H24O12)不得少于0.8%；flavanomarein含量(C21H22O11)不得少于4%；marein含量(C21H22O11)不得少于8.5%；3，5-二咖啡?；鼘幩岷?C25H24O12)不得少于0.5%；總黃酮含量不得低于9%；總酚酸含量不得低于28.0%。結(jié)論 根據(jù)《中國(guó)藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求建立了一套完整的兩色金雞菊醇提物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。建立了TLC可定性鑒別兩色金雞菊醇提物中的各主要成分，通過(guò)一測(cè)多評(píng)法可定量控制兩色金雞菊醇提物中綠原酸、flavanomarein、marein和3，5-二咖啡?；鼘幩岬暮?，建立紫外分光光度法可測(cè)定兩色金雞菊醇提物中的總黃酮、總酚酸的含量。

兩色金雞菊;醇提物；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜；紫外分光光度法；高效液相色譜法

A.stract:Objective To set up the quality standards of alcohol extract fromCoreopsistinctoria. Methods The quality control of alcohol extract fromCoreopsistinctoriawas carried out through thin layer chromatography (TLC)，determination moisture， residue of ignition,ultraviolet spectrophotometry and high performance liquid chromatography (HPLC). Results The chlorogenic acid of experimental sample and chlorogenic acid of control sample in TLC showed the same colored spots at the same position，and three main ingredients of flavanomarein， marein，3，5-2 coffee acyl quinic acid were identified and isolated.Coreopsistinctoriamoisture should not exceed 15%；the residue on ignition should not exceed 16%； chlorogenic acid in alcohol extract (C16H24O12) should not be less than 0.8%；flavanomarein (C21H22O11) should not be less than 4%；marein (C21H22O11) should not be less than 8.5%；3，5-2 coffee acyl quinic acid (C25H24O12) should not be less than 0.5%.Flavonoids should not be lower than 9%；Coreopsistinctoriaalcohol extract flavonoids should not be lower than 9%,the total phenolic acid should be not less than 28.0%. Conclusion TLC and HPLC can be used to identify qualitatively the chemical constituents of alcohol extract fromCoreopsistinctoria，ultraviolet spectrophotometry can be used to control the quantity of the flavonoids and total phenolic acid，chlorogenic acid，and HPLC can be used to control the quantity of flavanomarein， marein，3，5-2 coffee acyl quinic acid.The method is simple，accurate with a high repeatability．

兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)為菊科(Compositae)金雞菊屬(Coreopsis)1年生草本植物，原產(chǎn)于美國(guó)，主要作為景觀植物栽培，后分布于世界各地。在我國(guó)主要分布在新疆南疆地區(qū)海拔3 000 m左右的昆侖山區(qū)，故又稱(chēng)昆侖雪菊[1]。當(dāng)?shù)鼐用穸嘤脙缮痣u菊作茶飲，具有清熱解毒、活血化瘀、和胃健脾之功效[2]。研究發(fā)現(xiàn)，兩色金雞菊中有氨基酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿、皂苷、有機(jī)酸、酚類(lèi)、恩醌類(lèi)、揮發(fā)油、油脂、甾體、內(nèi)酯及香豆素類(lèi)等成分[3-5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，雪菊的藥理作用主要包括抗炎、降壓、降脂、降糖、抗凝血、抗衰老、抗病毒等活性[6]。盧偉等[7]研究發(fā)現(xiàn),兩色金雞菊醇提物可明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓；蘭怡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，兩色金雞菊醇提物具有改善糖尿病大鼠血糖血脂紊亂的作用；梁樂(lè)等[9]通過(guò)建立薄層生物自顯影的方法證明兩色金雞菊醇提物具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制作用。古扎力努爾·艾爾肯等[10]采用HPLC法測(cè)定了新疆兩色金雞菊中綠原酸與總黃酮的含量并建立了指紋圖譜。兩色金雞菊醇提物是由兩色金雞菊的干燥花序經(jīng)過(guò)乙醇回流提取、濃縮并真空干燥所得。在課題組已完成的兩色金雞菊醇提物試工藝中，以柚皮苷為對(duì)照品測(cè)定醇提物中總黃酮含量可達(dá)11%，總酚酸含量可達(dá)33%；經(jīng)大孔樹(shù)脂純化后總黃酮含量升至30%。國(guó)內(nèi)外研究均表明，兩色金雞菊具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景，將其開(kāi)發(fā)為經(jīng)濟(jì)附加值高、功效好的功能性保健品或藥品具有重要意義。因此，建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)尤為重要，本文對(duì)兩色金雞菊醇提物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，為更好地控制其質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 瑞士卡馬半自動(dòng)點(diǎn)樣儀(CAMAG-LINOMAT-5)；瑞士卡馬薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(CAMAG REPROSTAR 3)；硅膠G高效板(青島海洋化工廠)；超聲波清洗器(500 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；分析天平(Mettler-Teledo，d=0.01/0.1 mg)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Centra-401，澳大利亞)；高效液相色譜儀(日本島津，LC-20AB泵，SPD-20A紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器)。

1.2 試藥 柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)10722-201312，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；沒(méi)食子酸對(duì)照品(批號(hào)110831-201204，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；綠原酸對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；聚乙二醇400(天津市百世化工有限公司)；2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯(Sigma公司)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司)；甲酸、乙酸乙酯、冰乙酸、甲醇、氫氧化鉀、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、鹽酸、磷酸、溴素均為分析純。兩色金雞菊由新疆雪菊生物科技公司提供，兩色金雞菊醇提物為課題組經(jīng)乙醇回流提取、濃縮并真空干燥所得。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 兩色金雞菌醇提物為黃色至紅棕色粉末，氣香，味甜，具有吸濕性。

2.2 TLC鑒別

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 綠原酸對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品，加甲醇制成1 mL含0.1 mg的溶液，搖勻，即得。

兩色金雞菊對(duì)照藥材：將兩色金雞菊藥材用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)三號(hào)篩，取粉末約1 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇12 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(500 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，置于離心機(jī)中，以10 000 r·min-1離心15 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 供試品溶液的配制 取本品0.5 g，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇超聲處理，使其溶解并稀釋至刻度，取溶液過(guò)0.22 μm微孔濾膜，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 顯色試劑的配制 取1.25 g聚乙二醇,置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得50 mg·mL-1的聚乙二醇400溶液。取250 mg的2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯溶液。

2.2.4 兩色金雞菊醇提物的鑒別 按照《中國(guó)藥典》薄層色譜法(通則0502)實(shí)驗(yàn)[11]，吸取綠原酸對(duì)照品溶液2 μL、對(duì)照藥材溶液1 μL、供試品溶液1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶7∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，再依次噴以10 mg·mL-1的2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯和50mg·mL-1的聚乙二醇400，分別置于紫外光燈366 nm處和可見(jiàn)光下檢視。

參考葡萄牙文獻(xiàn)[12]首先確定提取物中有綠原酸、馬里苷、奧卡寧及flavanokanin。參照歐盟藥典，以1個(gè)對(duì)照品的位置確定其他成分的相對(duì)位置(Rf)，可以同時(shí)確定和鑒別多個(gè)化合物斑點(diǎn)。在紫外光燈366 nm下檢視，首先確定綠原酸的位置，在綠原酸下方Rf為0.11、顯紅色的斑點(diǎn)為馬里苷(marein)；在綠原酸上方薄層板近1/2處、Rf為0.36、顯藍(lán)色熒光斑點(diǎn)為黃酮奧卡寧(flavanokanin)；在薄層板上方Rf為0.75、顯橙色的斑點(diǎn)為奧卡寧(okanin)。在可見(jiàn)光下檢視，位于薄層板上方(Rf=0.75)的橙色斑點(diǎn)為奧卡寧，下方的紫色斑點(diǎn)(Rf=0.11)為馬里苷。見(jiàn)圖1～2。

圖1 兩色金雞菊醇提物展開(kāi)后在366 nm下檢視1～10.10批醇提物；S1.兩色金雞菊對(duì)照藥材；S2.綠原酸對(duì)照品；A.馬里苷；B.綠原酸；C.黃酮奧卡寧；D.奧卡寧

Fig.1 Detection ofCoreopsistinctoriaNutt. alcohol extract under UV 366 nm 1-10.10 batch alcohol extract；S1.CoreopsistinctoriaNutt.reference medicinal materials；S2. chlorogenic acid groups； A.marein；B.chlorogenic acid；C.flavanokanin；D.okanin

圖2 兩色金雞菊醇提物展開(kāi)后在可見(jiàn)光下檢視1～10.10批醇提物；S1.兩色金雞菊對(duì)照藥材；S2.綠原酸對(duì)照品；A.馬里苷；D.奧卡寧

Fig.2 Detection ofCoreopsistinctoriaNutt. alcohol extract under visible light 1-10.10 batch alcohol extract；S1.CoreopsistinctoriaNutt. reference medicinal materials；S2.chlorogenic acid groups；A.marein；D.okanin

2.3 檢查

2.3.1 水分檢查 參照《中國(guó)藥典》2015年版四部(通則0832)水分測(cè)定法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取樣品2 g，每批樣品平行3份，平鋪于干燥至恒質(zhì)量的扁形稱(chēng)量瓶(60 mm×30 mm)中，厚度不超過(guò)5 mm，精密稱(chēng)定，打開(kāi)瓶蓋，在100～105 ℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移至干燥器中，冷卻30 min，精密稱(chēng)定，在100～105 ℃干燥1 h，冷卻，稱(chēng)定質(zhì)量，至連續(xù)2次稱(chēng)定質(zhì)量差異不超過(guò)5 mg為止，根據(jù)減失的質(zhì)量，計(jì)算供試品中的含水量。10批樣品的水分測(cè)定結(jié)果為11.0%～12.4%，平均值為11.5%，按照平均值的120%計(jì)算，暫定兩色金雞菊醇提物的水分不得超過(guò)15%。

2.3.2 熾灼殘?jiān)?參照《中國(guó)藥典》2015年版四部(通則0841)熾灼殘?jiān)鼨z查法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取樣品1 g，每批樣品平行3份，置于熾灼至恒質(zhì)量的坩堝中，稱(chēng)定質(zhì)量，緩緩熾熱，注意避免燃燒，至完全碳化時(shí)，逐漸升高溫度至700 ℃，使完全灰化至恒質(zhì)量。根據(jù)殘?jiān)|(zhì)量，計(jì)算供試品中殘?jiān)暮俊?0批樣品的熾灼殘?jiān)鼫y(cè)定結(jié)果為11.0%～16.0%，平均值為12.6%，按照平均值的120%計(jì)算，暫定兩色金雞菊醇提物的熾灼殘?jiān)坏贸^(guò)16%。

2.4 一測(cè)多評(píng)法測(cè)定兩色金雞菊醇提物中主要成分的含量 一測(cè)多評(píng)法(QAMS) 是一種應(yīng)用于多成分質(zhì)量控制的方法，只測(cè)定某個(gè)代表性成分(易得、廉價(jià)、有效)，同時(shí)可計(jì)算出其他待測(cè)有效成分含量的方法。該方法被《中國(guó)藥典》2015年版四部收錄，方法適用于對(duì)照品難得或制備成本高或不穩(wěn)定的情況下同類(lèi)多成分同時(shí)測(cè)定。兩色金雞菊醇提物中flavanomarein、marein和3，5-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品昂貴且難得，課題組張瑞[13]建立了一測(cè)多評(píng)法來(lái)測(cè)定兩色金雞菊提取物中的主要成分，故參照其方法進(jìn)行測(cè)定。flavanomarein、marein和3，5-二咖啡?；鼘幩岬南鄬?duì)保留時(shí)間分別為1.497 9，2.668 0和3.020 0；flavanomarein、marein和3，5-二咖啡?；鼘幩岬南鄬?duì)校正因子為0.669，3.595和0.759。

2.4.1 色譜條件 Shim-pack VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；以5 mL·L-1甲酸為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B;流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL，按照表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

Tab.1 The gradient elution program

時(shí)間/min流動(dòng)相A%流動(dòng)相B%0～6095560～6595→805→2065～7580→1020→9075～8010→9590→5

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取綠原酸對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度線，搖勻，即得(1 mL含綠原酸400 μg)。

2.4.3 供試品溶液的制備 取本品粉末1 g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇12 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(500 W體積分?jǐn)?shù)，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，置于離心機(jī)中，以10 000 r·min-1離心15 min，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性與范圍 精密量取綠原酸對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.5，0.7和1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得1 mL含綠原酸10，20，30，40和50 μg的系列質(zhì)量濃度溶液。按照《中國(guó)藥典》高相液相色譜法(通則0512)測(cè)定，以綠原酸質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=13 038C-19 022，r=0.999 1，表明綠原酸對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在4.032～40.32 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 測(cè)定法 分別精密吸取綠原酸對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以綠原酸的峰面積為對(duì)照，分別計(jì)算flavanomarein、marein和3，5-二咖啡?；鼘幩岬暮?，用待測(cè)成分色譜峰與綠原酸色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間確定，樣品色譜圖見(jiàn)圖3。本品按照干燥品進(jìn)行計(jì)算，以綠原酸計(jì)，綠原酸(C16H24O12)含量不得少于0.8%，flavanomarein(C21H22O11)含量不得少于4%，marein(C21H22O11)含量不得少于8.5%，3，5-二咖啡?；鼘幩?C25H24O12)含量不得少于0.5%。

圖3 樣品色譜圖

a.綠原酸；b.flavanomarein；c.marein；d.3,5-二咖啡?；鼘幩?/p>

Fig. 3 Sample chromatograms

a.chorogenic acid；b.flavanomarein；c.marein；d.3,5-dicaffeoylquinic acid

2.5 紫外分光光度法測(cè)定兩色金雞菊醇提物中的總黃酮與總酚酸

2.5.1 總黃酮的測(cè)定 2015年版《中國(guó)藥典》收錄的總黃酮測(cè)定方法是以蘆丁為對(duì)照，蘆丁為黃酮醇苷，而兩色金雞菊中的黃酮類(lèi)化合物以查爾酮(馬里苷，奧卡寧)和二氫黃酮(黃酮奧卡寧，黃諾馬苷)為主，所以以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定兩色金雞菊醇提物總黃酮含量并不準(zhǔn)確。梁樂(lè)[14]研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷為二氫黃酮類(lèi)，二氫黃酮在堿性條件下能轉(zhuǎn)變?yōu)椴闋柾?，故以柚皮苷為?duì)照進(jìn)行兩色金雞菊醇提物中總黃酮測(cè)定，該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。參照其方法對(duì)兩色金雞菊醇提物中總黃酮進(jìn)行測(cè)定。

2.5.1.1 顯色反應(yīng)試液的制備 取氫氧化鉀5 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，搖勻，即得質(zhì)量濃度為100 g·L-1的氫氧化鉀溶液。

2.5.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成1 mL含203.6 μg的溶液，即得。

2.5.1.3 樣品溶液的制備 取兩色金雞菊醇提物0.1 g，精密稱(chēng)定，置于25 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，精密量取0.5 mL溶液，置于25 mL量瓶中，分別加甲醇10 mL、氫氧化鉀0.8 mL，用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.5.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取柚皮苷對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL，置于25 mL量瓶中，加10 mL甲醇和質(zhì)量濃度為100 g·L-1的氫氧化鉀0.8 mL，搖勻，用甲醇稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為4.07，8.14，12.22，16.29，20.36和24.43 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。按照《中國(guó)藥典》紫外可見(jiàn)分光光度法(通則0401)，在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)、柚皮苷質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y=0.042 9X-0.002，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，表明柚皮苷對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在4.07～24.43 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.1.5 測(cè)定法 取樣品溶液適量，按照2.5.1.4項(xiàng)下的方法，自“加甲醇10 mL”起依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中柚皮苷的質(zhì)量，計(jì)算，即得，見(jiàn)表 2。

本品按照干燥品進(jìn)行計(jì)算，黃酮含量以柚皮苷計(jì)(C27H32O14)，不得少于9.0%。

表2 樣品總黃酮含量

Tab.2 Sample flavonoids content±s，n=3)

2.5.2 總酚酸的測(cè)定

2.5.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取沒(méi)食子酸對(duì)照品12.5 mg，精密稱(chēng)定，置于25 mL棕色量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL溶液，置于50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.5.2.2 供試品溶液的制備 取兩色金雞菊醇提取物0.1 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.5.2.3 磷鉬鎢酸試劑的制備 稱(chēng)取鎢酸鈉100 g,鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL，磷酸50 mL，加熱回流10 h，放冷，再加硫酸鋰150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴，冷卻，加水稀釋至1 000 mL，濾過(guò)，得磷鉬鎢酸試劑，放入冰箱保存。

2.5.2.4 最大吸收波長(zhǎng)的確定 精密吸取對(duì)照品溶液2 mL和供試品溶液0.2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，分別加入1.2 mL磷鉬鎢酸試劑，再各加入10和11.8 mL的水，搖勻后用質(zhì)量濃度為290 g·L-1的碳酸鈉定容至刻度，避光放置30 min，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，對(duì)照品溶液和供試品溶液均在760 nm處有最大吸收峰，故選擇760 nm為最佳吸收波長(zhǎng)。

2.5.2.5 顯色試劑加入量的確定 取供試液0.2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，以水代替供試品溶液作為空白對(duì)照，分別加入0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2和1.4 mL的磷鉬鎢酸的試劑和11.8 mL的水，搖勻，用質(zhì)量濃度為290 g·L-1的碳酸鈉溶液定容至刻度，避光放置5 min，顯色后在760 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果顯示，顯色試劑的加入量為1.2 mL時(shí)，供試液的吸光度最大，故選擇1.2 mL為顯色試劑的加入量。

2.5.2.6 反應(yīng)時(shí)間的確定 取供試品溶液0.2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，以水代替供試品溶液作為空白對(duì)照，加入1.2 mL的磷鉬鎢酸試劑和11.8 mL的水，搖勻，用質(zhì)量濃度為290 g·L-1的碳酸鈉溶液定容至刻度，避光放置，分別于0，5，10，15，20，25和30 min測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示反應(yīng)時(shí)間在5 min時(shí)，吸光度最大，故選擇5 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.5.2.7 反應(yīng)溫度的確定 精密量取供試品溶液0.2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，以水代替供試品溶液作為空白對(duì)照，加入1.2 mL的磷鉬鎢酸試劑和11.8 mL的水，搖勻，用質(zhì)量濃度為290 g·L-1的碳酸鈉溶液定容至刻度，避光放置5 min，分別于25，30，35，40，45和50 ℃測(cè)定吸光度，結(jié)果顯示，當(dāng)反應(yīng)溫度為25 ℃時(shí)，吸光度最大，故選擇25 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

2.5.2.8 方法學(xué)考察

①線性與范圍 精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和4.0 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加入1.2 mL的磷鉬鎢酸試劑，分別加入11.0，10.5，10.0，9.5，9.0和8.0 mL的水，搖勻，用質(zhì)量濃度為290 g·L-1的碳酸鈉定容至刻度，避光放置5 min，顯色后，在760 nm處測(cè)定吸光度，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)、吸光度Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.102 4X-0.090 7，r=0.999 8，表明沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在2.0～8.0 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

②精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按照線性與范圍項(xiàng)下方法，自“加入1.2 mL磷鉬鎢酸試劑”起依法連續(xù)6次測(cè)定吸光度，測(cè)定結(jié)果RSD值為0.22%，表明儀器的精密度良好。

③穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密量取供試品溶液0.2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按照線性與范圍項(xiàng)下方法，自“加入1.2 mL磷鉬鎢酸試劑”起依法分別在0，5，10，15，20，25和30 min測(cè)定吸光度，測(cè)定結(jié)果顯示，吸光度RSD值為1.97%，即該方法在30 min內(nèi)穩(wěn)定性較好。

④重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取兩色金雞菊醇提物6份，按照線性與范圍項(xiàng)下方法，自“加入1.2 mL磷鉬鎢酸試劑”起依法測(cè)定吸光度，計(jì)算總酚酸平均含量為34.31%，RSD值為2%，表明該方法重復(fù)性良好。

⑤回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取6份已知含量的供試品溶液0.2 mL，分別加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液2 mL，按照線性與范圍項(xiàng)下方法，自“加入1.2 mL磷鉬鎢酸試劑”起依法測(cè)定吸光度，并計(jì)算供試品中總酚酸含量。結(jié)果平均回收率為97.40%，RSD值為0.15%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于兩色金雞菊醇提物總酚酸的含量測(cè)定。

⑥樣品的含量測(cè)定 取樣品溶液適量，按照線性與范圍項(xiàng)下方法，自“加入1.2 mL磷鉬鎢酸試劑”起依法測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中沒(méi)食子酸的質(zhì)量，計(jì)算，即得，見(jiàn)表3。本品按照干燥品計(jì)算，總酚酸含量以沒(méi)食子酸(C7H6O5)計(jì)，不得少于28.0%。

表3 樣品總酚酸含量

Tab.3 The sample total phenolic acid content±s，n=3)

3 討論

兩色金雞菊中主要含有氨基酸、糖類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、黃酮和有機(jī)酚酸類(lèi)等多種成分，其中以黃酮類(lèi)和酚酸類(lèi)為代表[15]，具有抗氧化、降壓、降脂、降糖以及抗炎等生物活性。采用課題組已建立的兩色金雞菊醇提物實(shí)驗(yàn)室工藝，對(duì)兩色金雞菊進(jìn)行放大提取，得出兩色金雞菊醇提物收率為38%，總黃酮含量占11%，總酚酸含量占33%。

本研究參照歐盟藥典薄層鑒別方法，以1個(gè)對(duì)照品的位置確定其他化合物的相對(duì)位置，同時(shí)鑒別多個(gè)化合物，建立了兩色金雞菊醇提物的薄層色譜鑒別方法。鑒別兩色金雞菊醇提物中的綠原酸、馬里苷、奧卡寧及flavanokanin。兩色金雞菊中 flavanomarein、marein和3，5-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品缺乏且昂貴，采用課題組已建立的一測(cè)多評(píng)法[13]，以?xún)r(jià)廉易得的綠原酸為內(nèi)標(biāo)，對(duì)flavanomarein、marein和3，5-二咖啡酰基奎寧酸進(jìn)行測(cè)定，可以對(duì)兩色金雞菊進(jìn)行更全面的質(zhì)量控制。

2015年版《中國(guó)藥典》收錄的總黃酮測(cè)定方法大多是以蘆丁為對(duì)照品，蘆丁為黃酮醇苷，而兩色金雞菊中的黃酮類(lèi)化合物以查爾酮(馬里苷，奧卡寧)和二氫黃酮(flavanokanin，黃諾馬苷)為主[16]，因此以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定兩色金雞菊醇提物總黃酮含量不太適宜。柚皮苷為二氫黃酮類(lèi)，二氫黃酮在堿性條件下能轉(zhuǎn)變?yōu)椴闋柾室澡制ぼ諡閷?duì)照品測(cè)定兩色金雞菊醇提物中總黃酮更為科學(xué)。

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Quality standards for alcohol extract of Coreopsis tinctoria

DENG Kai1，LI Xinxia2，LI Linlin1，WANG Ye1，LAN Yi3，MAO Xinmin4*

(1.Basic Medical College，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.Research Center，Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；3.Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；4.College of Traditional Chinese Medicine Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China)

Coreopsistinctoria;alcohol extract；quality standards；thin layer chromatography；UV spectrophotometry；HPLC

NSFC-新疆聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào):U1303223)

鄧凱，男，碩士研究生

*通信作者：毛新民，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.06.002

R282

A

1004-2407(2016)06-0554-07

2016-01-14)