林曉萍（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科泉州362000）

乙酰半胱氨酸抑制脂多糖誘導(dǎo)的人肺N C I-H 292細(xì)胞粘蛋白M U C 5AC表達(dá)△

林曉萍（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科泉州362000）

目的：研究乙酰半胱氨酸（NAC）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的氣道粘蛋白MUC5AC表達(dá)的調(diào)控作用并探討可能的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、黏液高表達(dá)組（LPS組）及乙酰半胱氨酸干預(yù)組（NAC+LPS組），分別采用Real time PCR和Western blot方法檢測(cè)NCI-H292細(xì)胞MUC5AC、Nrf2的mRNA含量及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：LPS刺激NCI-H292細(xì)胞表達(dá)MUC5AC，MUC5AC mRNA及蛋白表達(dá)分別增加7.169±1.785及1.473±0.098（P均<0.05）。NAC促進(jìn)NCI-H292細(xì)胞Nrf2表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)（P<0.05），以30mM最為顯著。結(jié)論：乙酰半胱氨酸通過促進(jìn)Nrf2基因表達(dá)，抑制氣道上皮細(xì)胞粘蛋白MUC5AC分泌。

乙酰半胱氨酸 粘蛋白 MUC5AC Nrf2信號(hào)通路

正常分泌的氣道黏液具有保護(hù)氣道、濕潤(rùn)空氣等作用，但在吸煙、感染、氧化應(yīng)激等多種致病因素作用下，可產(chǎn)生大量促分泌因子作用于分泌細(xì)胞，產(chǎn)生過量黏液[1]。氣道黏液高分泌是慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張癥及肺囊性纖維化等慢性氣道炎癥性疾病的特征性病理生理改變和臨床表現(xiàn)[2～3]。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)許多患者死于氣道黏液高分泌導(dǎo)致的氣道阻塞或窒息，因此深入探索氣道黏液高分泌的發(fā)病機(jī)制及調(diào)控措施具有重要意義。2015年我國(guó)撰寫了第一個(gè)《慢性氣道炎癥性疾病氣道黏液高分泌管理的專家共識(shí)》[4]，指出祛痰治療有助于減輕慢性氣道炎癥性疾病患者的氣道狹窄，避免反復(fù)感染，延緩肺功能下降。目前臨床常用的祛痰藥物有愈創(chuàng)甘油醚、羧甲司坦、N-乙酰半胱氨酸、厄多司坦、氨溴索等，可能的作用機(jī)制各不相同[5]。其中，N-乙酰半胱氨酸是一種經(jīng)典的抗氧化劑，可降低黏液的黏稠度，促進(jìn)黏液排出[6]。但目前關(guān)于N-乙酰半胱胺酸下調(diào)氣道黏液表達(dá)的具體調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。

氣道黏液的主要成分是粘蛋白MUC5AC，多種刺激因子如香煙煙霧、細(xì)菌、卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）等均可引起氣道MUC5AC表達(dá)增高，銅綠假單胞菌是慢性氣道炎癥性疾病的常見病原菌，因此本研究使用銅綠假單胞菌的胞壁成分脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292建立粘蛋白MUC5AC高表達(dá)模型，以探討N-乙酰半胱氨酸在氣道粘蛋白MUC5AC表達(dá)中的調(diào)控作用及可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要材料：人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292株（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清（購(gòu)自Gibco）；N-乙酰半胱氨酸（購(gòu)自sigma公司），RIPA細(xì)胞裂解液及BCA蛋白定量試劑盒（購(gòu)自上海碧云天生物有限公司），Trizol（購(gòu)自Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real time PCR試劑盒（均購(gòu)自TARAKA公司），Real time PCR引物（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成），鼠抗人MUC5AC單克隆抗體（購(gòu)自Thermo公司），兔抗人Nrf2單克隆抗體（購(gòu)自abcam公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：人氣道上皮細(xì)胞NCI-H292使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d更換一次培養(yǎng)液，每4～5d以1∶3比例傳代一次。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-H292細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，細(xì)胞總數(shù)5.0×105個(gè)/2mL，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18～24h后細(xì)胞達(dá)90％左右融合時(shí)，換用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。

實(shí)驗(yàn)分組：①對(duì)照組：無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；②黏液高表達(dá)模型組：無血清培養(yǎng)基中分別加入不同濃度LPS分別干預(yù)24h，提取細(xì)胞總RNA，采用Q-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞MUC5AC mRNA的表達(dá)，挑選最佳干預(yù)濃度；③NAC干預(yù)組：細(xì)胞預(yù)先予不同濃度NAC（10～40uM）預(yù)處理30min后，加入LPS干預(yù)24h，提取細(xì)胞總RNA，采用Q-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞MUC5AC mRNA的表達(dá)，挑選NAC最佳干預(yù)濃度。各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Real-time PCR檢測(cè)：采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，通過分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提總RNA的濃度及完整性。取1μg總RNA，參照TAKARA PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，采用10μL反應(yīng)體系，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著，采用20μL反應(yīng)體系、使用SYBR實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。使用GADPH作為內(nèi)參照，采用2－ΔΔCt法確定靶基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以空白對(duì)照組作為矯正樣本（引物序列詳見表1）。

表1　實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

1.2.4Western blot：用RIPA試劑盒提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，100℃10min致蛋白變性。經(jīng)5％～10％聚丙烯酰胺的梯度SDS-PAGE電泳分離，后電轉(zhuǎn)1～2h至PVDF膜上，經(jīng)5％脫脂奶粉封閉1h，相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯影、曝光。以與內(nèi)參照GADPH產(chǎn)物條帶的比值作為相對(duì)含量，分析各條帶灰度值。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組檢測(cè)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1建立LPS誘導(dǎo)的氣道粘蛋白MUC5AC高表達(dá)模型：使用2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL和20μg/mL PA-LPS干預(yù)NCI-H292細(xì)胞24h后，提取細(xì)胞總RNA，Real time PCR結(jié)果顯示MUC5AC mRNA表達(dá)水平顯著增高，以10μg/mL為著，MUC5AC mRNA表達(dá)量為對(duì)照組的（7.169±1.785）倍（P=0.026）（圖1A），MUC5AC蛋白表達(dá)量為對(duì)照組的（1.473±0.098）倍（P= 0.014）（圖1B）。

圖1A：不同濃度LPS均可誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞MUC5AC mRNA表達(dá)，以10μg/mL為著（*組P=0.010）；圖1B：LPS可誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞MUC5AC蛋白表達(dá)（P<0.05）。

2.2N-乙酰半胱氨酸抑制NCI-H292細(xì)胞粘蛋白MUC5AC表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分為3組：對(duì)照組、黏液高表達(dá)組、NAC干預(yù)組。預(yù)先使用不同濃度（10～40mM）N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理NCI-H292細(xì)胞30min后加LPS 10μg/mL刺激，24h后收集細(xì)胞總RNA和蛋白裂解液，分別應(yīng)用Real time PCR和Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞MUC5AC的mRNA和蛋白水平。結(jié)果顯示分別使用10mM、20mM、30mM和40mM的N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理30min后，NCI-NCI-H292細(xì)胞MUC5AC mRNA表達(dá)量分別為3.372± 0.549（P=0.065）、3.052±1.125（P=0.018）、2.215±1.089（P= 0.015）、2.569±0.778（P=0.025）；30mM NAC組和10mM及20mM NAC組相比，P<0.05，40mM NAC組和30mM NAC組相比，P= 0.205，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，不同濃度NAC均能抑制LPS誘導(dǎo)的MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，以30mM抑制效果最強(qiáng)（圖2A）。圖2B顯示使用30mM NAC預(yù)處理后LPS誘導(dǎo)的MUC5AC蛋白表達(dá)量降低至0.856±0.109，與LPS刺激組MUC5AC表達(dá)量1.473±0.098相比P=0.035，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明N-乙酰半胱氨酸能抑制LPS誘導(dǎo)的MUC5AC表達(dá)。

2A：不同濃度NAC均可抑制LPS誘導(dǎo)的MUC5AC mRNA表達(dá)，亦以30mM為甚（#組P=0.026、*組P=0.065、**組P= 0.018、***P=0.015、****P=0.025，****組與***組相比、P= 0.205，無顯著差異）；2B：NAC可抑制LPS誘導(dǎo)的NCI-H292細(xì)胞MUC5AC蛋白表達(dá)（*組P<0.05）。

2.3N-乙酰半胱氨酸對(duì)Nrf2信號(hào)通路的影響：圖3A顯示分別使用10mM、20mM、30mM和40mM的N-乙酰半胱氨酸預(yù)處理30min后，NCI-NCI-H292細(xì)胞Nrf2 mRNA的表達(dá)量分別為2.083±0.274（P=0.023）、3.218±0.201（P=0.003）、3.599±0.142（p= 0.001）、3.416±0.045（P=0.00），與LPS誘導(dǎo)的黏液高表達(dá)組Nrf2 mRNA的表達(dá)量1.081±0.019相比，P值均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；NAC可以促進(jìn)Nrf2 mRNA表達(dá)，且當(dāng)劑量<30mM時(shí)，隨著NAC劑量增加Nrf2 mRNA的表達(dá)量逐步增加（P< 0.05），當(dāng)劑量>30mM時(shí)，隨著NAC劑量增加Nrf2 mRNA的表達(dá)量與基礎(chǔ)值相比是有增加、但和30mM比較數(shù)值有所下降，但無顯著差異（P=0.177）。MUC5AC mRNA在10μg/mL LPS作用時(shí)，隨著NAC促進(jìn)Nrf2 mRNA表達(dá)的增加而有下降。且NAC劑量<30mM時(shí)，隨著NAC干預(yù)劑量增加，Nrf2 mRNA表達(dá)增加、而MUC5AC mRNA表達(dá)下降（P<0.05）；當(dāng)NAC劑量為40Mm（>30mM）時(shí)，MUC5AC mRNA表達(dá)較30Mm NAC組增加，而Nrf2 mRNA表達(dá)較30mM增加不明顯。

圖2B示NAC干預(yù)組Nrf2蛋白表達(dá)量為2.318±0.287，與LPS誘導(dǎo)的黏液高表達(dá)組Nrf2蛋白表達(dá)量1.288±0.088相比，P=0.034，結(jié)果說明N-乙酰半胱氨酸通過激活Nrf2發(fā)揮LPS誘導(dǎo)粘蛋白MUC5AC表達(dá)的作用。

3A不同濃度的NAC均可誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞Nrf2 mRNA的表達(dá)，以30uM為甚，隨著NAC濃度增加，Nrf2 mRNA表達(dá)量不再繼續(xù)上升；3B：NAC誘導(dǎo)NCI-H292細(xì)胞Nrf2蛋白的表達(dá)（P<0.05）。

3　討論

N-乙酰半胱氨酸是一種療效較好的祛痰劑，含有活性巰基（-SH），可以打斷黏液蛋白的雙硫鍵，分解粘蛋白，降低痰液的黏稠度，同時(shí)還能增強(qiáng)黏液纖毛系統(tǒng)的生理轉(zhuǎn)運(yùn)能力，促進(jìn)黏液排出[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，各濃度N-乙酰半胱氨酸均可抑制LPS誘導(dǎo)的粘蛋白MUC5AC表達(dá)，其中以30mM NAC組最明顯。證實(shí)N-乙酰半胱氨酸能參與調(diào)控氣道粘蛋白的表達(dá)。

研究表明N-乙酰半胱氨酸同時(shí)也是谷胱甘肽的前體，能夠增加細(xì)胞內(nèi)的GSH，通過激活Nrf2信號(hào)通路清除自由基、抗細(xì)胞凋亡[6]。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，可以上調(diào)多種抗氧化酶，提高谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等抗氧化物的表達(dá)水平，清除自由基等氧化物質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，發(fā)揮抗氧化、抗炎反應(yīng)及其他細(xì)胞保護(hù)作用[7]。目前也有不少研究發(fā)現(xiàn)Nrf2信號(hào)通路參與調(diào)控香煙煙霧或中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶誘導(dǎo)的氣道粘蛋白MUC5AC表達(dá)[8～9]。N-乙酰半胱氨酸作為Nrf2的誘導(dǎo)劑，很有可能也是通過Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抑制黏液過表達(dá)作用。本研究通過分析不同劑量NAC干預(yù)下NCI-H292細(xì)胞Nrf2及MUC5AC mRNA表達(dá)的變化，研究Nrf2在NAC抑制粘蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用。研究結(jié)果顯示，不同劑量NAC均能促進(jìn)NCIH292細(xì)胞Nrf2 mRNA表達(dá)。當(dāng)NAC劑量<30mM時(shí)，隨著NAC干預(yù)劑量增加，Nrf2 mRNA表達(dá)逐步增加、MUC5AC mRNA表達(dá)逐步下降（P<0.05），以30mM為著；繼續(xù)增加NAC的濃度（> 30mM），NCI-NCI-H292細(xì)胞Nrf2 mRNA表達(dá)量增加不明顯，而MUC5AC mRNA表達(dá)較30Mm NAC組增加。說明N-乙酰半胱氨酸通過Nrf2參與下調(diào)MUC5AC表達(dá)。

綜上所述，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)首次揭示了N-乙酰半胱氨酸下調(diào)氣道黏液分泌的可能調(diào)控機(jī)制，為N-乙酰半胱氨酸的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有一定的創(chuàng)新性。

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Role of N-acetylcysteine in the MUC5AC mucin production of NCI-NCI-H292 cells

Lin Xiaoping（Department of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China）

0bjective：To demonstrate the role and underlying mechanism of N-acetylcysteine（NAC）in the regulation of airway MUC5AC mucin expression in NCI-H292 cell line.Methods：NCI-H292 cells divided into three groups：the control group，the model group（LPS）and the intervention groups（NAC+LPS）.The intervention groups were pretreated with NAC for 30 min before exposure to LPS. The MUC5AC，Nrf2 mRNA levels were analyzed by Real time PCR，and protein production was assayed by Western blot.Results：Compared with the control group，expression of MUC5AC mucin was increased after being stimulated by LPS（P<0.05），but it was significantly inhibited by NAC（P<0.05）.Conclusion：N-acetylcysteine suppresses MUC5AC hypersecretion by Nrf2 signaling pathway.

N-acetylcysteine Mucus MUC5AC Nrf2 signaling pathway

R 363

B

1672-8351（2016）11-0122-03

△福建省自然科學(xué)基金資助（編號(hào)：2013J01289）；福建省衛(wèi)生廳青年科研課題資助（編號(hào)：40935）；福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院青年苗圃基金課題（編號(hào)：2012MP37）。