劉文靜

（山西省分析科學(xué)研究院，山西太原030006）

高效液相色譜法檢測乳品飲料中四環(huán)素類抗生素

劉文靜

（山西省分析科學(xué)研究院，山西太原030006）

建立一種用固相萃取-高效液相色譜法測定乳品飲料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的檢測方法。樣品前處理用乙腈沉淀蛋白后，采用HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化和富集，氮?dú)獯蹈珊笥昧鲃?dòng)相復(fù)溶上機(jī)檢測。采用Waters RP C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）分離，以乙腈∶甲醇∶0.01mol/L草酸溶液（18∶5∶77）作為流動(dòng)相，用PDA檢測器檢測，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，4種四環(huán)素類抗生素在0.10 μg/mL～1.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.994～0.999，檢出限均為2.0μg/kg～5.0μg/kg，定量限均為6.0μg/kg～15.0μg/kg，加標(biāo)回收率達(dá)到77.6%～90.6%。

高效液相色譜；乳品飲料；抗生素

四環(huán)素類（tetracyclines，TCs）抗生素為廣譜抗菌藥，由放線菌產(chǎn)生，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于氫化并四苯環(huán)衍生物，具有相似的理化性質(zhì)，被廣泛用作藥物添加劑，用于預(yù)防和治療畜禽疾病。但由于該類藥物的使用不合理及濫用，容易誘導(dǎo)耐藥菌株和導(dǎo)致在食品及牛奶中四環(huán)素類藥物的殘留問題。常用的TCs有：四環(huán)素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）、土霉素（oxytetracycline，OTC）、強(qiáng)力霉素（doxycycline，DC）等。四環(huán)素類抗生素的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　四環(huán)素類抗生素的結(jié)構(gòu)圖Fig.1　Structure of tetracycline antibiotics

對四環(huán)素類抗生素的殘留分析多采用微生物法、酶聯(lián)免疫法、薄層色譜法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［1-10］。這些方法中微生物法只能測定四環(huán)素類抗生素的總量，而酶聯(lián)免疫法只能測定個(gè)別四環(huán)素類抗生素；薄層色譜法靈敏度低，通常只用于限量分析；采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定四環(huán)素類抗生素盡管具有比較高的靈敏度，但存在成本高，儀器昂貴等缺點(diǎn)。故建立快速、準(zhǔn)確、靈敏且能同時(shí)檢測乳品飲料中四環(huán)素類抗生素的分析方法對于食品的安全性具有十分重要的意義。本研究建立了乳品飲料中4種四環(huán)素類抗生素的高效液相色譜檢測方法，在實(shí)驗(yàn)室的推廣可行性較高，并且前處理采用固相萃取技術(shù)，可以對目標(biāo)物起到一個(gè)凈化和富集的作用，可為乳品飲料中四環(huán)素類抗生素殘留的監(jiān)督檢驗(yàn)和殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

2695高效液相色譜系統(tǒng)、2998 PDA檢測器：Waters；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA。

四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品：購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇、乙腈為色譜純。

固相萃取小柱：規(guī)格6cc，500 mg。

1.2樣品來源

樣品均為市場上銷售的乳品飲料。

1.3色譜條件

色譜柱：Waters RP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

柱溫：30℃。

1.4方法

1.4.1流動(dòng)相體系的選擇

固定流動(dòng)相流速1.0 mL/min，配制不同體系的流動(dòng)相Ⅰ：［V（乙腈）∶V（0.01 mol/L磷酸二氫鈉）=26∶74］；流動(dòng)相Ⅱ：［V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=2∶1∶7］；流動(dòng)相Ⅲ：［V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01mol/L草酸溶液）=18∶5∶77］，流動(dòng)相Ⅳ：［0～10 min，V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=11∶6∶83；10 min～25 min，V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=30∶10∶60］，考察流動(dòng)相對4種抗生素色譜行為的影響。

1.4.2檢測波長的選擇

本試驗(yàn)采用PDA檢測器進(jìn)行全波長掃描（掃描范圍200 nm～400 nm），根據(jù)4種四環(huán)素類抗生素的響應(yīng)值，選擇比較合適的檢測波長。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

乳品飲料中除了固有的一些食品基質(zhì)外，還含有很多的人為添加的營養(yǎng)元素，成分復(fù)雜，對前處理要求高，所以本試驗(yàn)樣品比較兩種常用的溶劑提取效果。再利用使用固相萃取小柱，對四環(huán)素類抗生素起到一個(gè)凈化和富集的作用，并對3種固相萃取小柱進(jìn)行比較，以樣品加標(biāo)平均回收率為比較依據(jù)。

1.4.5加標(biāo)回收試驗(yàn)及樣品測定

以市售未檢測出四環(huán)素類抗生素的乳品飲料為空白基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，過固相萃取柱，氮吹近干后再定容，上機(jī)檢測，計(jì)算回收率。

2　結(jié)果與討論

2.1流動(dòng)相體系的選擇

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)［11-15］，發(fā)現(xiàn)不同標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)檢測四環(huán)素類抗生素的流動(dòng)相體系不同，主要分為兩大類流動(dòng)相體系：乙腈/甲醇/草酸體系和乙腈/磷酸二氫鈉體系，乙腈-甲醇-草酸流動(dòng)相體系中又分為等度洗脫和梯度洗脫，等度洗脫又有不同的比例分配。所以為了了解這些流動(dòng)相對這4種抗生素色譜行為的影響，本研究固定流動(dòng)相洗脫速度，配制不同體系的流動(dòng)相Ⅰ：［V（乙腈）∶V（0.01 mol/L磷酸二氫鈉）=26∶74）；流動(dòng)相Ⅱ：（V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=2∶1∶7］；流動(dòng)相Ⅲ：［V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=18∶5∶77］，流動(dòng)相Ⅳ：［0～10 min，V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）= 11∶6∶83；10 min～25min，V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=30∶10∶60］，考察了流動(dòng)相對4種抗生素色譜行為的影響。4種四環(huán)素類抗生素的色譜圖見圖2。

結(jié)果表明：在4種流動(dòng)相體系中，均對土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素的色譜保留行為有不同程度的影響，其中流動(dòng)相Ⅲ：［V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=18∶5∶77］的分離度最好，如圖2所示，在RP C18柱上可得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。

2.2檢測波長的選擇

圖2　4種四環(huán)素類抗生素的色譜圖Fig.2　The chromatograms of 4 tetracycline antibiotics

本試驗(yàn)采用PDA檢測器對4種四環(huán)素類抗生素進(jìn)行全波長掃描（掃描范圍200 nm～400 nm）。4種四環(huán)素類抗生素的全波長掃描圖見圖3。

圖3　4種四環(huán)素類抗生素的全波長掃描圖Fig.3　Full wavelength scanning chart of 4 tetracycline antibiotics

如圖3所示，4個(gè)組分在214、267、355 nm附近各存在一個(gè)吸收峰。相同濃度的抗生素混合標(biāo)液在上述3個(gè)特征波長條件下的色譜圖對比顯示，在214 nm條件下檢測的色譜峰面積最大，即214 nm的檢測靈敏度最高。然而，214 nm波長條件下檢測到的雜質(zhì)峰明顯較多，且雜質(zhì)峰面積也較大。267 nm和355 nm條件下的色譜圖中雜質(zhì)峰較少，峰形較好且峰形相近，但355 nm相對于267nm波長靈敏度更高。綜合分析，355 nm波長對這4種四環(huán)素類抗生素的檢測靈敏度較高，4種抗生素峰能完全分離，同時(shí)雜質(zhì)峰較少。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素在［V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=18∶5∶77］流動(dòng)相體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)結(jié)果表明，4種抗生素在0.10 μg/mL～1.00 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2>0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到4種目標(biāo)組分的LOD為2.0 μg/kg～5.0 μg/kg，LOQ為6.0 μg/kg～15.0 μg/kg，結(jié)果見表1。

2.4提取溶劑的選擇

由于四環(huán)素類抗生素在樣品中易與蛋白質(zhì)強(qiáng)烈結(jié)合，所以需用蛋白質(zhì)沉淀劑除去乳品飲料中的蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，比較了乙腈和EDTA-2Na-Mcllvaine緩沖溶液對4種四環(huán)素類抗生素的提取效果，凈化方式均采用HLB柱固相萃取法。結(jié)果顯示：乙腈為提取溶劑時(shí)，乳品飲料中的蛋白質(zhì)沉淀效果明顯，土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素的加標(biāo)回收率為71.2%～88.5%。當(dāng)采用EDTA-2Na-Mcllvaine緩沖溶液為提取溶劑時(shí)，混合后會(huì)出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，即使繼續(xù)進(jìn)行渦旋振蕩、超聲、離心操作后也不會(huì)出現(xiàn)分層，繼而很難過濾出上清液。所以，本試驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。

表1　4種抗生素的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1　Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of 4 tetracycline antibiotics

2.5凈化方法的選擇與優(yōu)化

目前，針對樣品四環(huán)素類的檢測大部分是利用HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，本試驗(yàn)中為驗(yàn)證HLB固相萃取柱在乳品飲料樣品凈化中的應(yīng)用優(yōu)勢，與其他常用的PEP固相萃取柱、C18固相萃取柱的凈化效果進(jìn)行比較，結(jié)果以4種四環(huán)素的平均回收率作為主要比較依據(jù)。3種固相萃取柱參數(shù)及其試驗(yàn)結(jié)果比較見表2。

表2　3種固相萃取柱參數(shù)及其試驗(yàn)結(jié)果比較Table 2　Three kinds of solid phase extraction column's parameters and the experimental results

如表2所示，可以看出：HLB柱對基質(zhì)的凈化效果最好，其次分別為PEP固相萃取柱、C18固相萃取柱。主要原因是基于反向原理的HLB固相萃取柱的吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，作為一種通用型吸附劑，其吸附容量較高，吸附性較強(qiáng)，與C18柱鍵合硅膠相比，HLB固相萃取柱的吸附劑的表面積增大2倍～3倍，對基質(zhì)的凈化效果較好，目標(biāo)物受雜質(zhì)的干擾較小。PEP固相萃取柱其為官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱，表面同時(shí)具有親水性和憎水性基團(tuán)，其吸附能力和樣品容量也遠(yuǎn)高于C18鍵合硅膠的3倍～10倍。4種四環(huán)素類抗生素在C18柱中難以得到保留，在PEP柱上仍有較好的回收率。進(jìn)一步結(jié)合表2中4種四環(huán)素類抗生素的加標(biāo)回收率及RSD值，HLB柱完全可用于乳品飲料的凈化和富集，在不具備HLB固相萃取柱時(shí)也可使用PEP固相萃取柱進(jìn)行樣品溶液的凈化富集，而C18固相萃取柱對本試驗(yàn)中乳品飲料基質(zhì)的凈化效果及目標(biāo)物保留能力較差，故不建議在有乳品基質(zhì)的凈化過程中使用。

2.6加標(biāo)回收與相對偏差

在以上試驗(yàn)的優(yōu)化條件下，利用空白基質(zhì)的乳品飲料樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，在分別添加10、20、40 μg/kg等3個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個(gè)濃度平行測定5次，測定結(jié)果見表3。

由表3可見，4種四環(huán)素類抗生素的加標(biāo)回收率為77.6%～90.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.6%～3.4%，表明本試驗(yàn)所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

2.7實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本文所建立的方法，對市售不同類型乳品飲料共28個(gè)批次進(jìn)行測定，未發(fā)現(xiàn)上述4種四環(huán)素類抗生素殘留。參照國標(biāo)GB/T 22990-2008《牛奶和奶粉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法》檢測，也未檢測出陽性樣品，表明該方法可用于實(shí)際樣品的測定。

表3　方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 3　Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

3　結(jié)論

本文建立了一種固相萃取-高效液相色譜-PDA檢測器檢測乳品飲料中4種四環(huán)素類抗生素的分析方法。結(jié)果表明，在V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（0.01 mol/L草酸溶液）=18∶5∶77流動(dòng)相體系中，4種四環(huán)素組分能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。在355 nm的檢測波長下，樣品經(jīng)過乙腈沉淀后，再處理采用固相萃取柱法可有效去除樣品中的復(fù)雜基質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的凈化與富集，能準(zhǔn)確快速有效地檢測乳品飲料中的土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素。

［1］李俊鎖，邱月明，王超.獸藥殘留分析［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2002：365-390

［2］王蕾，張孝松，徐智秀，等.反相高效液相色譜法測定四環(huán)素類抗生素［J］.色譜，2002，20（1）：49-51

［3］王蕾，徐智秀，張孝松，等.反相高效液相色譜法快速測定7種四環(huán)素類抗生素［J］.分析化學(xué)，2003，31（1）：52-54

［4］喬坤云.HPLC分析測定雞肝中土霉素、金霉素、四環(huán)素方法［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2003，13（5）：610-611

［5］陳毓芳.肌肉組織中四環(huán)素族抗生素的固相萃取-液相色譜法測定［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2003，22（3）：97-99

［6］賈薇，孫璐，史向國，等.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定牛奶中4種四環(huán)素類藥物殘留量［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，19（3）：96-100

［7］Muriuki F K，Ogara W O，Njer uh F M，et al.Tetracycline residue levels in cattle meat from Nairo bi Slaughter House in Kenya［J］. Journal of Veterinary Science，2001，2（2）：97-101

［8］Korsrud G O，MacNeil J D.A comparison of three bioassay techniques and high perforrmance liquid chromatography for the detection of chlortetracy cline residues in swine tissues［J］.Food Additives and Contaminants，1987，5（2）：149-153

［9］Sokol J，Matisova E.Determina tion of tetracycline antibiotics in ani－mal tissues of food producing animals by high performance liquid chromatography using solid phase extraction［J］.Journal of Chromatography A，1994，669：75-80

［10］Kawata S，Sato K，Nishikaw a Y，et al.Liquid chromatog raphic determination of oxytetracy cline in swinetissues［J］.Journal of Association of Official Analytical Chemists，1996，79（6）：1463-1465

［11］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．SC/T 3015-2002水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留量的測定［S］．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003

［12］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)．GB/T 20764-2006可食動(dòng)物肌肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法［S］．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006

［13］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．GB/T 18932.4-2002蜂蜜中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定方法液相色譜法［S］．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003

［14］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)．GB/T 22990-2008牛奶和奶粉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法［S］．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008

［15］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部．農(nóng)業(yè)部958號公告-2-2007豬雞可食性組織中四環(huán)素類殘留檢測方法高效液相色譜法［S］．北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007

Analysis of Tetracycline Antibiotics in Dairy Beverage by High Performance Liquid Chromatography

LIU Wen-jing
（Shanxi Academy of Analytical Science，Taiyuan 030006，Shanxi，China）

A rapid and effective method was established for the determination of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline and doxycycline in dairy beverage by solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography detection method.After the sample was treated with acetonitrile，it was concentrated and purified by solid phase extraction column.The elution liquid was dried under nitrogen，and detected after redissolution with mobile phase.The separation of target compound was performed on a Waters RP C18chromatographic column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile∶methanol∶0.01 mol/L oxalic acid solution（18∶5∶77）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of 4 tetracycline antibiotics components was in the range of 0.10 μg/mL-1.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.994-0.999.The detection limit was 2.0 μg/kg-5.0 μg/kg and the quantitative limit was 6.0 μg/kg-15.0 μg/kg.The recovery rate was 77.6%-90.6%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；dairy beverage；antibiotic

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.030

劉文靜（1967—），女（漢），高級工程師，本科，研究方向：食品檢測技術(shù)。

2016-08-09