譚萍，方玉梅，王盼，萬俊熙

（六盤水師范學院，貴州六盤水553004）

苦蕎麥蛋白質(zhì)的酶提工藝研究

譚萍，方玉梅，王盼，萬俊熙

（六盤水師范學院，貴州六盤水553004）

用酶法對苦蕎麥蛋白質(zhì)的提取進行研究，比較酸性、中性及堿性3種蛋白酶的提取試驗，結(jié)果顯示堿性酶的提取效果最好。采用單因素試驗，測定了酶法提取的加酶量、提取時間、溫度、料液比和pH值對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取效果的影響，通過正交試驗，確定堿性酶提取苦蕎麥蛋白質(zhì)的優(yōu)化工藝為：加酶量0.3%，溫度55℃，料液比1∶11（g/mL），pH= 10，提取4h，蛋白質(zhì)提取率為82.57%。

苦蕎麥蛋白質(zhì)；酶法；提取工藝

苦蕎麥，又稱三角麥［1］，蓼科蕎麥屬，為一年生或多年生宿根性植物［2］，原產(chǎn)于中國西南部海拔2 500 m～3 500 m的高寒地區(qū)，烏蒙山區(qū)（云南，貴州，四川）有大量種植，具有耐寒、耐貧瘠、喜陰等生長習性?？嗍w具有較高的營養(yǎng)價值和保健功能［3］，人體必需氨基酸齊全且配比適當［4］。苦蕎麥的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度高達110 g/L～150 g/L［5］，是使苦蕎麥具有較高的藥用價值和食用價值的重要成分［6］。近年來，蕎麥蛋白質(zhì)的生理功能逐漸引起了國內(nèi)外許多學者的注意，研究表明苦蕎麥蛋白對抗衰老、降低血液中的膽固醇、抑制膽結(jié)石的形成、預防7，12-二甲苯蒽誘發(fā)的乳腺腫瘤均有明顯效果［7-9］，因此國際谷物理事會將苦蕎麥稱為一種新的頗具潛在開發(fā)前景的功能性食品配料。目前，國外尤其是日本已經(jīng)有多種苦蕎麥蛋白質(zhì)食品面世，而我國在這方面的研究屬于起步階段，本試驗旨在探究苦蕎麥蛋白質(zhì)的提取工藝。

據(jù)了解，近來研究的重點主要集中在蕎麥蛋白的生理活性，對加工特性的研究相對較少。以往常使用堿法提取苦蕎麥蛋白質(zhì)，其工藝缺點有很多，如：反應溫度高、提取時間長、能源消耗大等。酶法提取是一種新的探索，目前在生產(chǎn)實踐中較少使用，酶法提取的提取效率高、提取時間短，另外，酶的價格便宜，因此酶法提取苦蕎麥蛋白適用于大規(guī)模生產(chǎn)。以往酶法提取工藝的研究主要集中在對茶葉、大米、大豆、啤酒糟的蛋白提取上［10-18］，郭榮榮等［19］利用大豆對堿法與酶法提取蛋白質(zhì)的優(yōu)劣進行了試驗探討，其工藝及方法均可為苦蕎麥蛋白質(zhì)的酶法提取提供一定的借鑒。對苦蕎麥蛋白的酶法提取工藝研究論著并不多見［20-21］。田斌等［22］用中性蛋白酶，張國權(quán)等［23］用木瓜蛋白酶對苦蕎麥的提取工藝進行過研究，但二者都缺乏酸性、堿性、中性蛋白酶對苦蕎麥蛋白提取工藝的探討。因此，本文對苦蕎麥蛋白質(zhì)的酶提取工藝優(yōu)化進行進一步探討，以期為苦蕎麥的開發(fā)與應用提供一些有用的參考。

1　材料與儀器

1.1材料及處理

苦蕎麥種子（六苦四號）：由六盤水職業(yè)技術(shù)學院農(nóng)業(yè)工程系苦蕎麥育種基地提供。取烘干的苦蕎麥種子于粉碎機中磨粉，過60目篩。在獲得的苦蕎麥粉中加入石油醚，于室溫環(huán)境脫脂12 h，期間攪拌并多次更換石油醚。將脫脂后的苦蕎麥分置于通風櫥，風干48 h備用。

1.2試驗用酶

酸性蛋白酶（活力30萬U/g）、中性蛋白酶（活力20萬U/g）、堿性蛋白酶（活力20萬U/g）：廣西龐博生物工程公司。

1.3試劑

pH 6.864和pH 9.182的成套緩沖劑：天津市科密歐化學試劑有限公司；石油醚、甲基紅與溴甲酚綠的混合指示劑、濃硫酸、0.058 41 mol/L的鹽酸、福林-酚試劑甲液、福林-酚試劑乙液、牛血清白蛋白（BSA）：市售國產(chǎn)分析純。

1.4儀器

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；TDL-60B低速臺式離心：上海安亭科學儀器廠；80-2型離心沉淀機：江蘇金壇市中大儀器廠；標準檢驗篩（60目，孔徑0.3 mm）：浙江上虞市道墟張興紗篩廠；PHS-3C實驗室pH計：上海虹益儀器儀表有限公司；101-2型電熱鼓風干燥箱、DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；DFT-200型高速萬能粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；華燁牌KDN定氮儀：上海纖檢儀器有限公司。

2　方法

2.1標準曲線的制作

參考楊玉芳［24］的文獻，采用福林-酚試劑法繪制標準曲線及測蛋白質(zhì)含量。準確稱取0.025g牛血清白蛋白（BSA），加蒸餾水溶解，定容至100 mL，得到250 μg/mL標準溶液。分別取標準蛋白含量為0、25、50、100、150、200、250 μg/mL的蛋白質(zhì)標準液1 mL，注入1號～7號試管中，然后均加入5 mL試劑甲，與樣品混合均勻，室溫下放置10 min，然后在每支試管內(nèi)加入0.5 mL福林-酚試劑乙立即混勻，于室溫下避光放置30 min，以1號試管為空白對照，在分光光度計680 nm波長處［25］測定樣品的吸光度值，并以蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

2.2苦蕎麥蛋白總氮含量測定——凱氏定氮法

參考張超［20］、楊玉芳［24］等的文獻，采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量。重復3次，取平均值，代入公式計算苦蕎麥蛋白質(zhì)的總氮含量。

粗蛋白質(zhì)提取率/%=［（V2-V1）×C×0.014 0×k］/（W× V'/V）×100

式中：V2為滴定試樣時消耗酸標準溶液的體積，mL；V1為滴定空白時消耗酸標準溶液的體積，mL；C為酸標準溶液的濃度，mol/L；0.014 0為氮的毫克當量數(shù)；k為氮換算到粗蛋白質(zhì)的系數(shù)；W為試樣重量，g；V'為試樣分解液蒸餾用體積，mL；V為試樣分解液總體積，mL。

2.3蛋白酶的篩選

對酸性蛋白酶（pH=3），中性蛋白酶（pH=7），堿性蛋白酶（pH=10），按料液比1∶10（g/mL），提取溫度50℃，加酶量0.3%，提取時間3 h。于4 000 r/min離心機內(nèi)離心10 min，取上清液顯色后，于680 nm波長處測定其吸光度），計算蛋白質(zhì)的提取率，找出提取效果最好的蛋白酶。

2.4酶法提取單因素試驗

2.4.1加酶量試驗

稱取1 g脫脂苦蕎麥粉，置于10 mL離心管內(nèi)。加酶量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，用pH=10的水溶液溶解并定容至10 mL容量瓶內(nèi)。準確吸取1 mL酶液至對應編號的離心管內(nèi)，按料液比1∶10（g/mL），pH=10，50℃的恒溫水浴鍋中提取3 h，于4 000 r/min離心機內(nèi)離心10 min，取上清液顯色后，在680 nm波長處測定吸光度，計算蛋白質(zhì)的提取率，找出最適加酶量。

2.4.2提取時間試驗

稱取1 g脫脂苦蕎麥粉，加酶量0.3%，料液比1∶10（g/mL），pH=10，50℃的恒溫水浴鍋中，分別提取3、4、5、6、7 h。于4 000 r/min離心機內(nèi)離心10 min，取上清液顯色后，在680 nm波長處測定吸光度，計算蛋白質(zhì)的提取率，找出最佳提取時間。

2.4.3溫度試驗

稱取1 g脫脂苦蕎麥粉，加酶量0.3%，料液比1∶10（g/mL），pH=10，分別置于40、45、50、55、60℃的恒溫水浴鍋中提取4 h。于4 000 r/min離心機內(nèi)離心10 min，取上清液顯色后，在680 nm波長處測定吸光度，計算蛋白質(zhì)的提取率，找出最適提取溫度。

2.4.4料液比試驗

稱取1 g脫脂苦蕎麥粉，加酶量0.3%，pH=10，按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL），置于50℃的恒溫水浴鍋中提取4 h，于4 000 r/min離心機內(nèi)離心10 min，取上清液顯色后，在680 nm波長處測定吸光度，計算蛋白質(zhì)的提取率，找出最佳料液比。

2.4.5pH值試驗

稱取1 g脫脂苦蕎麥粉，加酶量0.3%，分別加入pH 8.5、9、9.5、10、10.5的水溶液，料液比1∶10（g/mL），50℃的恒溫水浴鍋中提取4 h。于4 000 r/min離心機內(nèi)離心10 min，取上清液顯色后在680 nm波長處測定吸光度，計算蛋白質(zhì)的提取率，找出最適pH值。

2.5酶法提取正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇加酶量（A）、溫度（B）、料液比（C）、pH值（D）作為檢測因素，每因素選擇3個較佳水平，按L9（34）設(shè)計正交試驗方案，見表1。

表1　正交試驗因素水平表Table 1　The factors and levels of orthogonal experiment

3　結(jié)果與分析

3.1標準曲線

用最小二乘法經(jīng)線性回歸，得標準牛血清白蛋白濃度y與吸光度x的回歸方程：y=0.001 6x+0.108 3，R2=0.999 2，表明在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2苦蕎麥蛋白總氮含量測定——凱氏定氮法

重復3次試驗，取平均值得樣品滴定消耗的鹽酸的體積為27.26 mL，空白（不加樣品作空白對照組）滴定消耗的鹽酸為0.16 mL，試樣分解液總體積與試樣分解液蒸餾用體積均為15 mL，計算得到粗蛋白質(zhì)含量為12.7%。

3.3蛋白酶的篩選

酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見表2、表3、表4。

由表2、表3、表4結(jié)果顯示，在這3種酶的最適反應條件下，酸性蛋白酶提取率為27.93%，中性蛋白酶提取率為46.06%，堿性蛋白酶提取率為74.40%，表明堿性蛋白酶的提取效果最好。

表2　酸性蛋白酶對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響Table 2　The influence extract rate on tartary buckwheat protein in acid enzyme

表3　中性蛋白酶對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響Table 3　The influence extract rate on tartary buckwheat protein in acid enzyme in neutral enzyme

表4　堿性蛋白酶對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響Table 4　The influence extract rate on tartary buckwheat protein in acid enzyme in alkaline enzyme

3.4酶法提取單因素試驗的結(jié)果與分析

3.4.1加酶量對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響

反應條件：溫度50℃；時間3 h；料液比1∶10（g/ mL）；pH=10。加酶量設(shè)定0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%5個梯度，結(jié)果見圖1。

圖1　加酶量對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1　The influence extract rate on tartary buckwheat protein in the dosage of enzyme

由圖1可看出，在加酶量為苦蕎麥粉質(zhì)量的0.3%時，蛋白質(zhì)的提取率最高。當酶量繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)提取率開始下降，在加酶量為0.5%時，提取率雖有所提高，但考慮到蛋白酶在提取蛋白質(zhì)的同時會破壞蛋白質(zhì)的三、四級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)發(fā)生水解，使其喪失生理活性，因此選擇加酶量為0.3%為宜。

3.4.2提取時間對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響

Festo 2018 IPC次日，全球媒體來到荷蘭乳制品農(nóng)場Lely公司。Lely和Festo近20年的合作是從單一的客戶與供應商的關(guān)系升華為戰(zhàn)略伙伴關(guān)系的完美注腳。這家荷蘭乳制品農(nóng)場自動化全球市場領(lǐng)先的公司太空人擠奶機器人項目中讓Festo參與程度越來越高，建立的合作項目團隊最終帶來了混合技術(shù)機器人。

反應條件：溫度50℃；料液比1∶10（g/mL）；加酶量0.3%；pH=10。提取時間設(shè)定3、4、5、6、7 h 5個梯度，結(jié)果見圖2。

圖2　提取時間對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2　The influence extract rate on tartary buckwheat protein in extracted time

由圖2可看出，在提取時間3 h～4 h期間，蛋白質(zhì)提取率迅速提高。隨著提取時間的延長，由于蛋白質(zhì)水解為氨基酸和肽，蛋白質(zhì)的提取率逐漸降低，所以提取的時間應該控制在4 h左右。

3.4.3溫度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響

反應條件：時間4 h；料液比1∶10（g/mL）；加酶量0.3%；pH=10。溫度設(shè)定40、45、50、55、60℃5個梯度，結(jié)果見圖3。

圖3　溫度對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3　The influence extract rate on tartary buckwheat protein in temperature

由圖3可看出，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的提取率逐漸提高，在50℃時達到最高，當溫度再升高時，酶活性受到抑制，從而使提取率下降。因此，應選取50℃為最佳提取溫度。

3.4.4料液比對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響

反應條件：溫度50℃；時間4 h；加酶量0.3%；pH= 10。料液比設(shè)定1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL）5個梯度，結(jié)果見圖4。

圖4　料液比對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4　The influence extract rate on tartary buckwheat protein in the ratio between material and solvent

由圖4可知，隨著料液比逐步增加，體系的粘度逐漸降低，分子擴散速率提高，蛋白質(zhì)提取率逐漸增大；蛋白質(zhì)提取率在料液比為1∶10（g/mL）處達到最大值；當料液比超過1∶10（g/mL），提取率下降，說明選擇料液比為1∶10（g/mL）較合適。

3.4.5pH對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響

反應條件：溫度50℃；時間4 h；料液比1∶10（g/ mL）；加酶量0.3%。設(shè)定pH=8.5，pH=9，pH=9.5，pH= 10，pH=10.5 5個梯度，結(jié)果見圖5。

圖5　pH值對苦蕎麥蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5　The influence extract rate on tartary buckwheat protein in pH

由圖5可知，在其他反應條件不變的情況下，隨著pH值的增大，蛋白質(zhì)提取率呈明顯上升趨勢，在pH= 10時達到最高；當pH再增大時，蛋白酶失去活性，蛋白質(zhì)提取率下降，說明選取提取pH=10較為合適。

3.5酶法提取正交試驗的結(jié)果與分析

結(jié)合單因素試驗所得結(jié)果，采用正交試驗對提取條件進行優(yōu)化，以便使蛋白質(zhì)提取率得到進一步提高。試驗結(jié)果及極差分析見表5。

正交試驗分析結(jié)果表明，影響酶法提取苦蕎麥蛋白質(zhì)的四個因素中，影響程度從高到低依次為D＞B＞C＞A，最優(yōu)組合為A2B3C3D2，即加酶量為0.3%，溫度55℃，pH=10，料液比為1∶11（g/mL）的條件下水浴提取4 h。

表5　正交試驗結(jié)果及極差分析Table 5　Results of orthogonal test and range analysis

3.6酶法提取驗證試驗

由于表5沒有最優(yōu)組合方案，故有必要對其做驗證實驗，以進一步確認正交試驗的可行性。稱取烘干的脫脂苦蕎麥粉3份，每份1 g，置于10 mL離心管內(nèi)，按優(yōu)選出的最佳生產(chǎn)工藝條件進行提取，于紫外分光光度計680 nm處測定吸光值，并計算出提取率，結(jié)果見表6。

表6　最佳工藝驗證試驗結(jié)果表Table 6　Optimal process validation test results

由表6的試驗結(jié)果可知，在最佳的提取工藝條件下，蛋白質(zhì)提取率為82.57%，高于正交試驗的最高水平77.01%故最佳工藝驗證試驗成功，說明該提取工藝可靠且穩(wěn)定。

4　結(jié)論與討論

通過對3種蛋白酶的提取效果進行比較，確定堿性蛋白酶對苦蕎麥蛋白質(zhì)的提取效果最好。并通過單因素和正交試驗確定了用堿性蛋白酶提取苦蕎麥蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件為：加酶量0.3%，溫度55℃，料液比1∶11，pH=10，提取4 h，提取率可達82.57%，僅有17.48%的蛋白質(zhì)沒有提取出來，這部分蛋白質(zhì)可能是前人報道的極難溶于水的殘渣蛋白［7］，也可能包括一些與苦蕎麥中其它成分緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)。

從現(xiàn)有研究蕎麥蛋白質(zhì)不同提取方法的文獻來看，蕎麥蛋白質(zhì)的提取方法有水溶液提取法、堿提取法、酶提取法等。此前對苦蕎麥蛋白質(zhì)的提取常使用堿法，具有雜質(zhì)較多、提取時間長、反應溫度較高、蛋白質(zhì)純度不高、提取量較低、能源消耗大等缺點［20］。酶法反應的提取率較高、提取時間短等，且酶較為廉價，適用于大規(guī)模的生產(chǎn)［21］，但目前較少應用于生產(chǎn)實踐。張超，郭貫新等［21］曾有類似探討，其試驗采用酶法提取苦蕎麥蛋白質(zhì)，結(jié)果為堿性蛋白酶效果最好，在最佳的工藝條件下，其蛋白質(zhì)的提取率為76%，略低于本試驗高達82.57%的提取率。本試驗可為六盤水苦蕎麥的綜合利用提供參考，可以充分說明六盤水苦蕎麥具有良好的開發(fā)價值和資源價值，應綜合利用并加強資源開發(fā)。

對苦蕎麥蛋白質(zhì)的水解工藝和生理功能已經(jīng)有越來越多的人進行探討，而對苦蕎麥蛋白水解物——活性肽的分離、純化、生物活性及微觀結(jié)構(gòu)的探索還很少，生物活性肽具有調(diào)節(jié)激素、調(diào)節(jié)免疫能力、促進礦物質(zhì)的吸收利用、抗氧化作用、抗高血壓、抗疲勞等生理功能，因此有必要對其進行全面深入的探討。在后續(xù)試驗中，我們可以將得到的苦蕎麥蛋白質(zhì)用不同的酶進行水解試驗，篩選出制備苦蕎麥活性肽合適的蛋白酶，用選出的蛋白酶對苦蕎麥蛋白質(zhì)進行酶解得到相應的活性肽。然后摸清苦蕎麥活性肽的氨基酸組成，探究苦蕎麥活性肽的抗氧化活性，并將其制成肽類新型功能食品，為苦蕎麥高附加值產(chǎn)品的研發(fā)，為貴州苦蕎麥資源的綜合利用及苦蕎麥蛋白質(zhì)制品的研發(fā)提供相應的實驗依據(jù)和理論支撐。此外，還應加強宣傳，普及蕎麥的營養(yǎng)、藥用及保健價值，提高人們對蕎麥廣闊發(fā)展前景的認識，從而將當?shù)氐氖w麥資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)榻?jīng)濟優(yōu)勢，帶動當?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展，增加農(nóng)民的經(jīng)濟收入。

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Study of the Extracted Process on the Protein of Tartary Buckwheat by Using Enzyme

TAN Ping，F(xiàn)ANG Yu-mei，WANG Pan，WAN Jun-xi
（Liupanshui Normal College，Liupanshui 553004，Guizhou，China）

Using enzyme，the protein of tartary buckwheat was extracted in this study.Three proteases such as acidic enzyme，neutral enzyme and alkaline enzyme were selected and the effects were compared.The results showed that the extracted effect of alkaline enzyme was best.The tests of single-factor were adopted to study the effects of influence factors on extraction of tartary buckwheat protein，such as the dosage of enzyme，extracted time，temperature，the ratio between material and solvent and pH.Using orthogonal experiment，the extracting conditions were optimized.And the optimum extracting conditions were as follows：the dosage of enzyme was 0.3%，temperature was 55℃，the ratio between material and solvent was 1∶11（g/mL），pH=10，extracted time was 4 h and the rate of extracted protein was up to 82.57%.

the protein in tartary buckwheat；enzymatic；extracted process

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.018

貴州省“125計劃”重大科技專項（黔教合重大專項字［2014］038號）；貴州省科技廳技術(shù)基金項目（黔科合J字LKLS［2013］05號）；貴州省教育廳基金項目（黔教合KY字［2014］257號）

譚萍（1963—），女（漢），教授，本科，從事植物生理學與分子生物學的教學與研究。

2015-10-29