劉仁祿 陶興無 許曉梅 等

摘要：為了探討乳酸菌與酵母菌在麥芽汁發(fā)酵飲料中的應(yīng)用條件，試驗(yàn)比較了乳酸菌在乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基和麥芽汁中的生長情況，探討乳酸菌在麥芽汁中的產(chǎn)酸情況以及與酵母菌混合發(fā)酵的情況。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵麥芽汁工藝最佳條件為：12%麥芽汁中接種4%（V/V）酵母菌，28 ℃恒溫發(fā)酵8 h后經(jīng)64 ℃恒溫水浴30 min滅活，再按2%（V/V）接種保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合（1∶1，體積比）菌種，37 ℃恒溫發(fā)酵12 h，按此工藝方案所得發(fā)酵液經(jīng)殺菌后離心澄清，色澤橙黃透亮，組織均勻，具有適宜的香味且酸味醇厚。

關(guān)鍵詞：麥芽汁；乳酸菌；酵母菌；飲料

中圖分類號：TS261.4；S512.3+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）04-0988-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.043

Study on the Mixed Application of Lactic Acid Bacteria and Yeast

in Fermentation Wort Beverage

LIU Ren-lu， TAO Xing-wu， XU Xiao-mei， YUE Yin， BIAN Meng

（College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

Abstract：The conditions of application of lactic acid bacteria and yeast in fermentation wort beverages were discussed. The growth situation of the lactic acid bacteria in wort and MRS medium was compared. Moreover，the lactic acid bacteria's acid production situation and mixed fermentation with yeast was studied. Based on the orthogonal experiment， the fermentation conditions were determined as follows： inoculated 4%（v/v） yeast in 12Bx wort， fermented for 8 h at 28 ℃ and then inactivated in 64 ℃ with 30 minutes， then inoculated 2%（v/v） mixed lactic acid bacteria， and fermented for 12 h at 37 ℃. Under the process， the color of the fermentation solution was orange and bright， which had a well-closed formation， endurance flavor and deep acidity.

Key words：wort；lactic acid bacteria；yeast；beverage

麥芽價格低廉，來源廣泛，大量應(yīng)用于啤酒釀造。麥芽經(jīng)糖化制得的麥芽汁中，除了豐富的糖類物質(zhì)和含氮化合物外，還含有大量的人體所需的微量元素，具有開胃、健脾、消滯、改善腸道功能等功效[1，2]，麥芽汁在發(fā)酵之前帶有生味和不清爽的味道，通過微生物發(fā)酵可將異味除掉，所以麥芽也是生產(chǎn)功能性飲料的理想原料。與啤酒相比，麥芽汁乳酸菌飲料的營養(yǎng)價值更高，尤其是維生素含量更高[3，4]。

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品在促進(jìn)人體健康、治病防病方面發(fā)揮重要作用。乳酸菌在利用可發(fā)酵性碳水化合物的過程中，產(chǎn)生大量的乳酸以及一定量的乙酸、甲酸、丙酸等代謝產(chǎn)物，有較強(qiáng)的抗菌防腐作用[5，6]。隨著乳酸菌發(fā)酵飲料研發(fā)的不斷深入和對傳統(tǒng)谷物開發(fā)利用的需求提升，乳酸菌飲料的原材料也從鮮乳及乳制品逐漸延伸到大米、小麥、大麥等谷物[7，8]。以麥芽汁為主要原料輔以蔬菜汁、果汁等進(jìn)行乳酸菌發(fā)酵，國內(nèi)外已經(jīng)有部分研究，得到的發(fā)酵飲料具有獨(dú)特的風(fēng)味和良好的營養(yǎng)保健作用[9-15]。由于蔬菜汁、果汁的價格昂貴，來源有限，米乳、米汁等谷物類健康飲料也逐漸成為研究熱點(diǎn)[16]。目前對谷物類尤其是全麥芽汁乳酸菌發(fā)酵飲料的研究還處在起步階段，隨著人們對高生活質(zhì)量和養(yǎng)生保健的追求，開發(fā)麥芽汁發(fā)酵功能性飲料具有廣闊的前景。本研究以麥芽汁為原料，探討乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵的工藝條件，旨在為開發(fā)新型麥芽汁飲料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及設(shè)備

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）3種乳酸菌均為武漢輕工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種；酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）為安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)啤酒高活性干酵母。

麥芽（澳洲二棱大麥芽）由武漢輕工大學(xué)啤酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室提供。白砂糖及其他試劑等均為市售。

高速粉碎機(jī)，電子天平，高壓滅菌鍋，恒溫水浴鍋，恒溫培養(yǎng)箱，低速離心機(jī)，凈化工作臺，721型分光光度計，光學(xué)顯微鏡，糖錘度計等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

1）麥芽汁。麥芽粉碎后，加4倍水調(diào)漿，53 ℃恒溫水浴1 h再升溫至63 ℃、保溫約1 h，碘液檢測至糖化完全。糖化液用多層紗布過濾至澄清，煮沸蒸發(fā)至濃度12%后，分裝于潔凈的容器中，于115 ℃滅菌30 min，備用。

2）乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）。蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，葡萄糖5.0 g，吐溫80 1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，一水合硫酸錳0.05 g，水1 000 mL，pH 6.5～6.8，于115 ℃滅菌30 min，備用。

1.2.2 發(fā)酵菌種的制備

1）酵母菌。麥芽汁是啤酒酵母的天然培養(yǎng)基，可直接用于菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)。取適量活性干酵母接入麥芽汁培養(yǎng)基中，于28 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接至新的麥芽汁培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)3～4次傳代與擴(kuò)大培養(yǎng)后，制成種子液，放入冰箱中冷藏備用。

2）乳酸菌。將乳酸菌從MRS培養(yǎng)基轉(zhuǎn)到麥芽汁中培養(yǎng)，需要經(jīng)過適應(yīng)馴化過程。將經(jīng)過MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)活化的乳酸菌逐步轉(zhuǎn)入麥芽汁與MRS混合培養(yǎng)基（依次采用1∶4、2∶3、4∶1，體積比）中培養(yǎng)，最后再轉(zhuǎn)入全麥芽汁培養(yǎng)基中，經(jīng)3～4次傳代與擴(kuò)大培養(yǎng)，制成種子液，放入冰箱中冷藏備用[4]。

1.2.3 乳酸菌的生長、產(chǎn)酸試驗(yàn) 乳酸菌種子液或乳酸菌組合（兩種和三種乳酸菌組合分別按1∶1和1∶1∶1，體積比）種子液按2%（V/V）接種量，分別接種至MRS培養(yǎng)基和12%麥芽汁中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，定時取樣檢測培養(yǎng)液的光密度值（OD600 nm值）和酸度值。

1.2.4 乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵麥芽汁試驗(yàn) 麥芽汁在選定條件下經(jīng)過酵母菌發(fā)酵后，用白砂糖調(diào)整發(fā)酵液的濃度，按2%（V/V）接種量接種乳酸菌種子液，在一定條件下進(jìn)行二次發(fā)酵。

1.2.5 檢測方法 采用光電比濁法[17]，以未接種的培養(yǎng)基溶液作參比溶液[18]，在600 nm波長下測定光密度值（OD600 nm值）。按《GB 5413.34-2010》規(guī)定方法測定總酸（°T）。樣品經(jīng)過4 000 r/min離心10 min，取上層清液，用糖錘度計測定濃度。

1.2.6 發(fā)酵液感官評價方法 感官評價在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[19，20]。聘請20名品評師對離心澄清后的發(fā)酵液進(jìn)行品評。根據(jù)香味、口感、色澤3個方面對樣品進(jìn)行感官評分，其中香味、口感各占40分，色澤占20分，總評得分為3項(xiàng)得分之和（滿分為100分）。將20人評分的平均值作為最終結(jié)果。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌在麥芽汁和MRS培養(yǎng)基中的生長情況對比

MRS培養(yǎng)基是一種適合各種乳酸菌分離和培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基。考慮到麥芽汁與MRS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分之間的差異，本試驗(yàn)以MRS培養(yǎng)基作對照，探討保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌等3種乳酸菌及其組合在麥芽汁基質(zhì)中的生長情況。將馴化后的乳酸菌分別接種于MRS培養(yǎng)基和麥芽汁進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，每隔2 h取樣測定OD600 nm值，結(jié)果分別如圖1至圖6所示。由圖1至圖6可知，這3種乳酸菌及其組合在麥汁中的生長趨勢與在MRS中的生長趨勢一致，經(jīng)過4～6 h后其在麥芽汁中的生長速度明顯加快，進(jìn)入對數(shù)生長期，在培養(yǎng)10～12 h后菌種開始進(jìn)入生長穩(wěn)定期；雖然在麥芽汁中生長速率較MRS相對緩慢，菌體生長量也不及在MRS培養(yǎng)基中的生長量，但都能基本適應(yīng)麥芽汁基質(zhì)。

2.2 乳酸菌在麥芽汁培養(yǎng)基中的產(chǎn)酸情況

乳酸菌的產(chǎn)酸能力是其代謝情況最重要的表現(xiàn)。將馴化后的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌等3種菌及其組合分別接種于麥芽汁進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，每隔4 h取樣測定酸度值，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，單一乳酸菌在麥芽汁中產(chǎn)酸速率差異較??；在4～16 h之間均保持較高的產(chǎn)酸速率，在16 h以后產(chǎn)酸速率減緩；24 h時的總產(chǎn)酸量上并無明顯差異。兩種或三種乳酸菌組合培養(yǎng)時，產(chǎn)酸速率均高于單一乳酸菌培養(yǎng)時的產(chǎn)酸速率，并且所有的組合產(chǎn)酸趨勢基本一致，24 h時的總產(chǎn)酸量基本相同。從產(chǎn)酸能力來看，兩種或三種乳酸菌組合比單一乳酸菌要強(qiáng)。

2.3 乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵麥芽汁試驗(yàn)

根據(jù)前期的試驗(yàn)結(jié)果，將麥芽汁用酵母菌發(fā)酵后，再用乳酸菌進(jìn)行二次發(fā)酵，有利于除去麥芽汁的異味，賦予發(fā)酵液特殊香味和滋味。

2.3.1 酵母菌發(fā)酵溫度和時間的選取 要去除麥芽汁的澀口感，同時不產(chǎn)生大量酒精，就需要控制酵母菌發(fā)酵的程度。在麥芽汁中以4%（V/V）的接種量接種活化后的啤酒酵母，分別在28、30、32 ℃條件下恒溫發(fā)酵8 h，再對這3種溫度條件下得到的發(fā)酵液分別進(jìn)行感官品評，結(jié)果表明，它們之間差異并不顯著。在麥芽汁中以4%（V/V）的接種量接種制備好的發(fā)酵菌種，于28 ℃恒溫靜置發(fā)酵，以發(fā)酵液感官評價來確定發(fā)酵時間。酵母菌發(fā)酵時間超過9 h后，發(fā)酵液中產(chǎn)生乙醇、雙乙酰等酒類風(fēng)味物質(zhì)，對飲料感官質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。發(fā)酵時間低于6 h時，發(fā)酵液麥汁味濃，口感單一，生澀感明顯，不適宜作為飲料。通過發(fā)酵液感官品評，最后選取酵母菌發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間8 h進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

2.3.2 正交試驗(yàn) 前期在對保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌等3種乳酸菌在麥芽汁中生長、產(chǎn)酸情況試驗(yàn)的同時，對發(fā)酵液進(jìn)行了感官評價，結(jié)果顯示植物乳桿菌無論是單獨(dú)還是與其他菌株混合發(fā)酵，均會使發(fā)酵液帶有一種澀口感，并且有明顯的雜味。經(jīng)過綜合考慮后，下一步選用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合與啤酒酵母進(jìn)行混合發(fā)酵麥芽汁正交試驗(yàn)。將經(jīng)過28 ℃、8 h發(fā)酵的酵母發(fā)酵液，添加白砂糖至12%，再接種馴化后的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組合（1∶1，體積比），以乳酸菌發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和酵母發(fā)酵液是否滅活為3因素，采用L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表2。在設(shè)計正交試驗(yàn)因素水平（表2）時，對酵母發(fā)酵液進(jìn)行加熱滅活處理（滅活條件為64 ℃水浴，30 min）時考慮加熱可停止酵母的繼續(xù)生長代謝，并使酵母細(xì)胞在一定程度上自溶，釋放出的氨基酸、維生素等物質(zhì)，有利于乳酸菌的生長繁殖。由于酵母發(fā)酵液只有滅活和不滅活兩個水平，初步試驗(yàn)表明滅活較不滅活的效果好，故將酵母滅活這一水平重復(fù)，作為一個擬水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，影響發(fā)酵液感官評分的因素主次順序是：酵母發(fā)酵液是否滅活>乳酸菌發(fā)酵時間>乳酸菌發(fā)酵溫度，A3B2C1為最佳組合，即酵母發(fā)酵液滅活后，接種保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合菌種，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，發(fā)酵時間12 h。按此工藝方案所得發(fā)酵液經(jīng)殺菌后離心澄清，色澤橙黃透亮，組織均勻，具有適宜的香味且酸味醇厚。

3 結(jié)論

保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌等3種乳酸菌及其組合在麥芽汁中生長速率較MRS相對緩慢，但都能適應(yīng)麥芽汁基質(zhì)；3種乳酸菌及其組合在麥芽汁中的產(chǎn)酸情況基本相同；其中植物乳桿菌無論是單獨(dú)還是與其他菌株混合發(fā)酵，均會使發(fā)酵液帶有一種澀口感，并且有明顯的雜味，故排除植物乳桿菌。乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵麥芽汁最佳工藝條件為：在12%麥芽汁中按4%（V/V）的接種量接種啤酒酵母，28 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵8 h后將發(fā)酵液進(jìn)行巴氏滅菌，用白砂糖調(diào)整發(fā)酵液的濃度為12%，再按2%（V/V）接種保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合（1∶1，體積比）菌種，37 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵時間12 h。麥芽價格低廉，來源廣泛，乳酸菌與酵母菌混合發(fā)酵不僅可除去麥芽汁的異味，而且還可賦予其特殊香味。

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