唐國(guó)強(qiáng) 楊章旗 黃永利

摘要： 為研究濕地松（Pinus elliottii Engelm.）雄性敗育與SOD、POD活性及MDA含量的關(guān)系，以南寧市林業(yè)科學(xué)研究所濕地松種子園中的雄性不育株和雄性可育株為試驗(yàn)材料，對(duì)其小孢子葉球和針葉的SOD、POD活性及MDA含量進(jìn)行測(cè)定比較。結(jié)果表明，雄性不育株和可育株濕地松小孢子葉球SOD活性在整體上差異不明顯。POD活性及MDA含量在同一時(shí)期不育株比可育株高，且差異明顯。針葉SOD和POD活性雄性不育株比可育株低，POD活性差異很明顯。針葉MDA含量雄性不育株和可育株差異不明顯。在小孢子發(fā)育過程中，SOD、POD活性及MDA含量在多數(shù)采樣時(shí)期雄性不育株小孢子葉球明顯比針葉高，而可育株小孢子葉球均比針葉低。研究認(rèn)為，小孢子葉球中較高的POD活性及MDA含量可能是引起濕地松雄性敗育的重要生理原因。

關(guān)鍵詞： 濕地松（Pinus elliottii Engelm.）；雄性不育；小孢子葉球； 針葉

中圖分類號(hào)：S791.246 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）04-0943-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.04.033

Relationships between SOD，POD Enzymes Activities，MDA Content

and the Abortion of Male Sterile Pinus elliottii

TANG Guo-qiang1，2，YANG Zhang-qi3，HUANG Yong-li2

（1.College of Forestry，Guangxi University，Nanning 530004，China；2.Nanning Forestry Science Institute，Wuming 530107，Guangxi，China；

3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute，Nanning 530001，China）

Abstract： In order to clarify the relationships between SOD， POD activities， MDA content and male sterile Pinus elliottii Engelm.， male sterile clones and male fertile clones in P. elliottii seed orchard of Nanning Forestry Science Institute were used as experimental material. SOD， POD activity and MDA content during male strobilus abortion were studied. The results were as follows， no significant difference was found in SOD activity of P. elliottii microstrobilus between male sterile clones and male fertile clones. The POD activity and MDA content of male sterile clones were higher than that of male fertile clones in the same periods； and the differences were significant. The SOD and POD activity in the needle of male sterile clones was lower than that of male fertile clones in the same periods. Moreover， the MDA content of P. elliottii needle did not differ statistically between male sterile clones and male fertile clones. In the process of microspore development， the SOD， POD activity and MDA content of male sterile clones was significantly higher than those in needle at most of periods； while SOD， POD of activity and MDA content in the microstrobilus of male fertile clones were lower than those in the needle. The research suggests that excessive POD activity and MDA content in microstrobilus might be the important physiological reasons for male sterility in P. elliottii.

Key words：Pinus elliottii Engelm.；male sterility；microstrobilus；needle

雄性不育在植物界中是一種常見現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在有性繁殖過程中的花藥、花粉?；蛐叟渥影l(fā)育不正常而表現(xiàn)出的遺傳現(xiàn)象[1]。早在1763年，Kolreuter就已經(jīng)觀察到植物雄性不育現(xiàn)象，據(jù)統(tǒng)計(jì)已經(jīng)在43個(gè)科、162個(gè)屬、320個(gè)種和297個(gè)種間雜種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育現(xiàn)象[2]；隨著研究的不斷深入，這個(gè)數(shù)目還在不斷增加。濕地松（Pinus elliottii Engelm.）也存在雄性不育現(xiàn)象，其為雌雄同株異花植物，正常濕地松雌球花同枝下方著生雄球花。在松樹雜交育種中，利用雄性不育材料可免除去雄等部分工作，同時(shí)雄性不育材料的應(yīng)用可以避免自交，進(jìn)一步提高種子品質(zhì)，因此開展?jié)竦厮尚坌圆挥难芯繉?duì)今后濕地松雄性不育材料的應(yīng)用及林木雜交育種有著極其重要的意義。

目前有關(guān)林木雄性不育機(jī)理的研究和應(yīng)用相對(duì)較少，主要有杉木[3，4]、楊樹[5，6]和一些小灌木如四合木[7]、大白刺[8]等，遠(yuǎn)落后于如水稻、玉米、小麥等農(nóng)作物及一些草本植物雄性不育機(jī)理研究?，F(xiàn)在農(nóng)作物良種選育及制種方面，雄性不育材料已經(jīng)廣泛運(yùn)用于雜交育種、輪回選擇等過程中，并起著極其重要的作用。國(guó)內(nèi)關(guān)于裸子植物雄性不育的報(bào)道主要有杉木[3，9]，其他裸子植物未見有相關(guān)報(bào)道。近年在南寧市林業(yè)科學(xué)研究所濕地松種子園中發(fā)現(xiàn)一無性系，其小孢子葉球在其他小孢子葉球開始伸長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)停止或減緩伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，而且在其他正常無性系撒粉時(shí)小孢子葉開始干枯脫落，期間未有花粉撒出。經(jīng)初步認(rèn)定，其為雄性不育植株。為了解該雄性不育材料小孢子發(fā)育過程中小孢子敗育的生理機(jī)制，選用該雄性不育株和可育株為試驗(yàn)材料，在小孢子發(fā)育的不同時(shí)期，測(cè)定小孢子葉球及針葉的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及丙二醛（MDA）含量變化，探討濕地松雄性不育材料小孢子敗育與SOD、POD活性及MDA含量的相關(guān)關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

濕地松雄性不育株和可育株（對(duì)照）均為南寧市林業(yè)科學(xué)研究所濕地松種子園植株。樹齡都為21年生。自小孢子葉球出現(xiàn)較為明顯時(shí)（2013年12月12日）開始取材，到2014年2月6日結(jié)束。每株分東南西北4個(gè)方位每隔5～7 d混合取樣一次，取小孢子葉球及其附近2～3層針葉，直到小孢子葉球干枯脫落。共取樣11次。每次取下樣品后立即放入冰壺帶回室內(nèi)，迅速分別處理后放入-80 ℃環(huán)境保存，備用。

1.2 方法

分別取濕地松雄性不育株及可育株每個(gè)取樣時(shí)期的0.2 g左右的小孢子葉球和針葉材料于預(yù)冷的研缽中，加預(yù)冷的磷酸緩沖液在冰浴上研磨成勻漿，在4 ℃條件下10 000 r/min離心20 min，取上清液用于SOD及POD活性的測(cè)定。SOD活性測(cè)定采用NBT（氮藍(lán)四唑）光化還原法，以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位，單位表述為U/g。POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘吸光度變化值表示酶活性的大小，單位表述為ΔA470/（g·min）。MDA含量測(cè)定采用TBA（硫代巴比妥酸）法[10]。各指標(biāo)均以各時(shí)期混合均勻的小孢子葉球及其附近針葉為測(cè)定材料，每樣品重復(fù)3次。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行相應(yīng)的分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 小孢子葉球及其附近針葉SOD活性的動(dòng)態(tài)變化

濕地松小孢子發(fā)育過程中小孢子葉球及附近針葉的SOD活性變化測(cè)定情況見圖1。由圖1可以看出，雄性不育株和可育株小孢子在發(fā)育過程中小孢子葉球的SOD活性波動(dòng)較大，雄性不育株小孢子葉球SOD活性剛開始較高，最后較低，中間過程因波動(dòng)有升有降，在2月4日小孢子葉球開始變干枯時(shí)SOD活性達(dá)到最低，干枯后回升?？捎晷℃咦尤~球的SOD活性從剛開始起就下降，到12月31達(dá)到最低，之后回升，1月12日又開始下降，到雄球花開始撒粉時(shí)（2月初）SOD活性上升，花粉撒完后下降。11次采樣有6個(gè)時(shí)期雄性不育株小孢子葉球SOD活性比可育株高。經(jīng)分析表明，雄性不育株和可育株小孢子葉球SOD活性整體差異并不明顯，但不同時(shí)期的差異很明顯。在小孢子發(fā)育過程中，小孢子葉球附近針葉的SOD活性雄性不育株與可育株差異明顯。除了1月12日外，雄性不育株小孢子附近針葉的SOD活性均比可育株的低，不過針葉的SOD活性在各個(gè)時(shí)期的變化并不明顯。雄性不育株在11個(gè)采樣時(shí)期有7個(gè)時(shí)期SOD活性小孢子葉球比針葉高，而可育株有9個(gè)時(shí)期小孢子葉球比針葉低。表明在小孢子發(fā)育過程中，SOD活性是雄性不育株小孢子葉球比針葉高，而可育株小孢子葉球比針葉低。

SOD是生物體內(nèi)重要的保護(hù)酶之一，它的主要功能是催化超氧化物陰離子自由基·O2-發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2，從而清除·O2-，降低對(duì)細(xì)胞的損害。雄性不育株小孢子葉球中的SOD活性與可育株這些變化可能與其他酶及物質(zhì)的相互調(diào)節(jié)有關(guān)。雄性不育株小孢子葉球SOD活性在小孢子葉即將干枯脫落時(shí)迅速降低，這可能與較高的POD活性及MDA含量有關(guān)。

2.2 小孢子葉球及其附近針葉POD活性的動(dòng)態(tài)變化

濕地松小孢子發(fā)育過程中小孢子葉球及附近針葉的POD活性變化測(cè)定情況見圖2。由圖2可見，雄性不育株和可育株在小孢子發(fā)育過程中小孢子葉球的POD活性差異很明顯，雄性不育株小孢子葉球POD活性前期變動(dòng)較小，后期下降后急速上升；可育株的POD活性前期急速下降，后期相對(duì)較為平穩(wěn)，直到2月9日花粉撒完后急速下降；而不育株在小孢子葉球干枯后POD活性急劇上升；不育株與可育株小孢子葉球最初POD活性較為接近，隨著可育株P(guān)OD活性的下降，可育株和不育株的POD活性差異逐步拉大，如1月6日不育株小孢子葉球POD活性是可育株的7.80倍，到1月24日縮小為1.77倍。在可育株撒粉后，兩者的POD活性差距達(dá)到最大，不育株為可育株的64.70倍。并且在同一時(shí)期內(nèi)，不育株小孢子葉球的POD活性均比可育株高，這與前人的研究結(jié)果[11-14]基本是一致的，這說明濕地松雄性不育株小孢子葉球中活性氧維持在較高的水平，引起了膜脂過氧化，使其不能維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育，從而引起雄性敗育。而小孢子葉球附近針葉的POD活性在小孢子發(fā)育的過程中雄性不育株遠(yuǎn)低于雄性可育株，這正好與小孢子葉球在各時(shí)期POD活性的含量變化相反。雄性不育株在小孢子發(fā)育的11個(gè)測(cè)定時(shí)期中，小孢子葉球附近針葉的POD活性均小于1ΔA470/（g·min），而雄性可育株小孢子附近針葉的POD活性最低為3.3ΔA470/（g·min），最高的達(dá)8.4ΔA470/（g·min），引起這一變化差異的原因還有待進(jìn)一步研究。在取樣的11個(gè)時(shí)期，雄性不育株小孢子葉球的POD活性均比針葉高，而雄性可育株小孢子葉球的POD活性均比針葉低。這個(gè)動(dòng)態(tài)變化特點(diǎn)與SOD活性有類似的情況。

2.3 小孢子葉球及其附近針葉MDA含量的動(dòng)態(tài)變化

濕地松小孢子發(fā)育過程中小孢子葉球及附近針葉MDA含量變化測(cè)定情況見圖3。由圖3可見，雄性不育株和可育株在小孢子發(fā)育過程中小孢子葉球的MDA含量?jī)烧卟町惡苊黠@。其中不育株小孢子葉球的MDA含量變化較大，先降后升，到1月17日達(dá)到最大；可育株的小孢子葉球MDA含量變化較小，一直維持在較低水平，在1月29日小孢子葉球生長(zhǎng)較快時(shí)MDA含量最小，開始撒粉時(shí)上升。雄性不育株小孢子葉球MDA含量在同一時(shí)期均比可育株的高，最高時(shí)可達(dá)可育株的7.10倍，最小也有1.65倍。小孢子葉球附近針葉MDA含量雄性不育株和可育株在各采樣時(shí)期差異不明顯。小孢子發(fā)育過程中的11次采樣時(shí)期，雄性不育株MDA含量是小孢子葉球有9個(gè)時(shí)期比針葉的高，而雄性可育株MDA含量在各采樣時(shí)期小孢子葉球均比針葉的低。MDA是自由基與細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化或脫脂化降解的產(chǎn)物。其在植物體內(nèi)積累是活性氧毒害的表現(xiàn)，因此其含量是判斷植物脂質(zhì)過氧化程度高低的重要指標(biāo)。在氧化或脫脂降解過程中，膜通透性增加、離子外滲將影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和發(fā)育；已有研究證實(shí)植物中較高的MDA含量是植物雄性敗育的重要生理原因之一[11，15-18]。

3 小結(jié)與討論

目前，關(guān)于植物雄性不育機(jī)理的研究主要從細(xì)胞學(xué)、生理生化及育性基因等3個(gè)方面著手；雄性不育生理生化特性的研究目前主要是進(jìn)行比較研究，而完全闡明雄性育性表達(dá)的生理生化過程的試驗(yàn)研究較少。SOD、POD是植物中活性氧清除系統(tǒng)重要的酶，在清除植物體內(nèi)的自由基、維持自由基產(chǎn)生與清除系統(tǒng)的平衡起到重要的作用。關(guān)于植物雄性不育與保護(hù)酶活性變化及活性氧代謝的關(guān)系，前人分別在小麥[19]、蔥[20]、不結(jié)球白菜[21]、辣椒[22]、油菜[18]等作物做過研究，表明活性氧代謝失調(diào)及保護(hù)酶活性異常是導(dǎo)致作物雄性不育的重要原因之一。但在涉及活性氧清除酶系統(tǒng)活性變化規(guī)律方面的試驗(yàn)結(jié)果并不一致，這說明不同植物、不同敗育類型不育基因在敗育過程中存在差異表達(dá)。MDA在植物體內(nèi)積累一般認(rèn)為是活性氧毒害的表現(xiàn)。試驗(yàn)里濕地松雄性不育株小孢子葉球在同一時(shí)期POD活性及MDA含量均比可育株高，差異非常明顯。SOD活性雖然在7個(gè)時(shí)期不育株比可育株高，但總體差異不大；這可能因?yàn)檩^高的POD活性和MDA含量抑制了SOD活性的升高所致[23]，SOD活性的變化可能與較高的POD活性及MDA含量相互作用有關(guān)。劉麗華等[12]對(duì)板栗雄性不育進(jìn)行了比較，結(jié)果認(rèn)為不育品種浮來無花在雄花序敗育過程中POD活性高于可育品種大紅袍。這與趙前程等[11]對(duì)花椰菜雄性不育系進(jìn)行的研究結(jié)果類似，認(rèn)為較高的POD活性引起雄性敗育的原因一是POD活性增高將導(dǎo)致花藥內(nèi)源激素（IAA）的分解，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成和運(yùn)輸；二是較高的POD活性可能促進(jìn)了雄花序中乙烯的合成，進(jìn)而導(dǎo)致雄花序的脫落。試驗(yàn)中濕地松雄性不育株小孢子葉球在同一時(shí)期POD活性及MDA含量均比可育株高，因此認(rèn)為小孢子葉球中較高的POD活性及MDA含量是濕地松引起雄性敗育的重要生理原因。

試驗(yàn)除了對(duì)濕地松小孢子葉球SOD、POD活性及MDA含量測(cè)定外，對(duì)小孢子附近的2～3層針葉也進(jìn)行了類似的測(cè)定。結(jié)果表明，濕地松雄性不育株針葉SOD、POD活性均比可育株低，SOD活性總體差異明顯，POD活性差異很明顯，MDA含量差異不明顯。濕地松雄性不育株針葉較低的SOD、POD活性可能與小孢子葉球活性氧代謝失衡有關(guān)。周仲華等[23]對(duì)棉花溫敏雄性不育系敗育不同部位的SOD、POD活性及MDA含量測(cè)定結(jié)果顯示，棉花葉片在高溫時(shí)期SOD活性及MDA含量雄性不育株均比可育株低，而POD活性則是雄性不育株比可育株高。目前關(guān)于雄性不育與雄性可育植株間雄性器官以外的組織生理生化的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，濕地松雄性不育株與可育株在小孢子發(fā)育過程中SOD、POD活性及MDA含量是不育株小孢子葉球比針葉高，可育株小孢子葉球比針葉低。這種活性氧清除系統(tǒng)的異常變化可能打破了葉與花的活性氧清除系統(tǒng)平衡，并進(jìn)一步引起小孢子葉球脂膜過氧化，最終使小孢子敗育。關(guān)于這些物質(zhì)在敗育過程中不同部位的變化及其相互作用關(guān)系還有待進(jìn)一步系統(tǒng)的試驗(yàn)來證實(shí)。

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