何思蓓，張紅萍

(1 邵陽市第二中學(xué)，湖南 邵陽 422000；2 邵陽學(xué)院化學(xué)系 湖南 邵陽 422000)

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京尼平顯色測定氨基葡萄糖含量的初步研究

何思蓓1，張紅萍2

(1 邵陽市第二中學(xué)，湖南 邵陽 422000；2 邵陽學(xué)院化學(xué)系 湖南 邵陽 422000)

利用京尼平與氨基發(fā)生顯色反應(yīng)，初步建立了京尼平顯色測定氨基葡萄糖含量的方法。研究了反應(yīng)的測定波長、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)液酸堿度以及反應(yīng)產(chǎn)物顯色穩(wěn)定性對測定結(jié)果的影響，并與Elson-Mrogan法進(jìn)行了對比。結(jié)果表明：京尼平顯色法測定氨基葡萄糖含量的最適波長為590 nm，在80 ℃和pH為8～11的條件下反應(yīng)2 h，反應(yīng)產(chǎn)物顯色性質(zhì)穩(wěn)定。該方法與Elson-Mrogan法無顯著差別, 可用于實(shí)驗(yàn)室的簡便測定。

京尼平；顯色；氨基葡萄糖；含量

氨基葡萄糖是葡萄糖的氨基被羥基取代后的產(chǎn)物，又稱為葡萄糖胺，是人體關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中合成蛋白聚糖所必需的重要成分[1]。目前測定氨基葡萄糖含量的方法主要有比色法[2]、滴定分析法[3]、HPLC法[4]等。在比色法中，Elson-Mrogan法 和Indlo-Hcl法是測定氨基糖的特征顯色法，但這些方法操作過程繁瑣，對反應(yīng)體系的酸堿度要求苛刻，反應(yīng)結(jié)果易受溫度和時間等因素影響[5]。

京尼平是環(huán)烯醚萜類化合物，它可以和伯氨基發(fā)生縮合反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色，為此，本文利用京尼平與氨基的顯色反應(yīng)，采用分光光度法測定其特征性光吸收，進(jìn)行氨基葡萄糖含量分析，為氨基葡萄糖及其衍生物的檢測提供新的簡便方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

鹽酸氨基葡萄糖，中國藥品生物制品檢定所對照品；京尼平標(biāo)準(zhǔn)品，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；所用水為蒸餾水，其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 主要儀器

WF2 UV-4802H型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯上海儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 主要試劑的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：氨基葡萄糖鹽酸鹽經(jīng)105 ℃干燥至恒重，精確稱取50 mg置于50 mL容量瓶中，加水溶解，定容，用移液管精確量取5 mL溶液于另一50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻待用。標(biāo)準(zhǔn)液中氨基葡萄糖的含量為1 mg/mL。

1.3.2 最適測定波長的確定

將500 μL的0.1%京尼平溶液加入到3 mL氨基葡萄糖水溶液(1 mg/mL)中，將反應(yīng)液于35 ℃下恒溫，待反應(yīng)一段時間后，以相同濃度的氨基葡萄糖溶液為參比，對反應(yīng)溶液在200～800 nm進(jìn)行吸收光譜掃描，找出最大特征光吸收值。

1.3.3 反應(yīng)溫度和反應(yīng)液酸堿度的確定

分別取3 mL 氨基葡萄糖水溶液(1 mg/mL)置于兩支試管(試管標(biāo)號：1、2)中，加入500 μL的1 mg/mL京尼平溶液后，將試管1置于80 ℃水浴中反應(yīng)2 h，將試管2置于35 ℃水浴中反應(yīng)48 h，分別測定590 nm 時的A值，以1 mg/mL氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液做參比，在200～800 nm對反應(yīng)液進(jìn)行吸收光譜掃描。

考查溶液酸堿度的影響時，配制pH 3、pH 5、pH 7和8、pH 10和11、pH 12 的緩沖溶液，再取配制好的氨基葡萄糖溶液3 mL，加入450 μL的1 mg/mL京尼平溶液，置于不同的緩沖體系中反應(yīng)，反應(yīng)液于80 ℃條件下反應(yīng)2 h后測定A 590 nm 吸收值，并以1 mg/mL氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液做參比，在200～800 nm對反應(yīng)液進(jìn)行吸收光譜掃描。

1.3.4 反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

取1 mL濃度為1 mg/mL的氨基葡萄糖溶液6份加入相同濃度和體積的京尼平溶液，分別在反應(yīng)時間為30，60，120，180，240，300 min后測定溶液的吸光度。

1.3.5 氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在上述最優(yōu)條件下，取一定濃度梯度的氨基葡萄糖溶液與京尼平反應(yīng)，測定反應(yīng)液的吸光度值，分析數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以氨基葡萄糖溶液濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制曲線并得出線性方程為A=1.86×10-3+5.73C(r=0.998)。結(jié)果表明，在0.01～0.07 mg/mL范圍內(nèi)，氨基葡萄糖溶液的濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適測定波長的確定

將氨基葡萄糖與京尼平溶液恒溫一段時間后然后混合，并對待測體系利用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)溶液混合后，體系的吸收光譜在反應(yīng)過程中發(fā)生了變化。檢測結(jié)果表明，反應(yīng)前，京尼平水溶液在242 nm處有最大特征光吸收值，鹽酸氨基葡萄糖水溶液的最大吸收波長在500 nm處。隨著京尼平與氨基葡萄糖混合水溶液在35 ℃條件下開始反應(yīng)，溶液由無色變?yōu)樗{(lán)紫色，同時光譜掃描發(fā)現(xiàn)在590 nm附近出現(xiàn)一個新的特征光吸收峰，并且隨著反應(yīng)的進(jìn)行， A590 nm值也隨之不斷增大，這是因?yàn)榘被崤c京尼平反應(yīng)生成的梔子藍(lán)色素有顏色，使反應(yīng)液在590 nm處出現(xiàn)最大特征光吸收[6]。

2.2 反應(yīng)溫度和酸堿度的確定

采用兩種溫度(35 ℃和80 ℃)與兩種pH (pH 5.5和pH 8.0) 條件，研究京尼平與氨基葡萄糖的顯色反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定其他反應(yīng)條件，溫度對顯色反應(yīng)有顯著影響，35 ℃時反應(yīng)48 h的反應(yīng)液顏色較淺，而80 ℃時反應(yīng)2 h的溶液顏色較深(圖1)。

圖1 溫度和pH對氨基葡萄糖與京尼平反應(yīng)的影響

進(jìn)一步在80 ℃條件下反應(yīng)2 h，考察酸堿度對氨基葡萄糖與京尼平反應(yīng)的影響。 表1結(jié)果顯示，反應(yīng)液在pH 為8.0、10.0和11.0時，有較大的A590 nm值，反應(yīng)基本完成，溶液的顏色較深，為深紫色和紫黃色。在pH 為5.0和7.0時，溶液在594 nm和595 nm處有最大吸收峰并且A590 nm值較小，分別為0.12和0.23，溶液顏色為淺藍(lán)色和藍(lán)紫色，這可能是反應(yīng)沒有進(jìn)行完全。當(dāng)反應(yīng)液在過酸(pH 3.0)或過堿(pH 12.0)條件下進(jìn)行反應(yīng)，溶液沒有發(fā)生顏色變化，這說明強(qiáng)酸和強(qiáng)堿不利于反應(yīng)的進(jìn)行。

表1 pH對京尼平與氨基葡萄糖溶液反應(yīng)的影響

2.3 反應(yīng)產(chǎn)物的穩(wěn)定性

圖2為京尼平與氨基葡萄糖反應(yīng)后的放置時間對反應(yīng)產(chǎn)物吸光度值變化的影響。研究結(jié)果表明，京尼平與氨基葡萄糖溶液反應(yīng)在2 h時基本完成，隨著放置時間增加，產(chǎn)物的顏色基本沒有變化，產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性。

圖2 放置時間對產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響

2.4 方法學(xué)比較

為進(jìn)一步對方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，采用經(jīng)典的Elson-Mrogan法[7]和京尼平顯色法對氨基葡萄糖樣品進(jìn)行檢測，并應(yīng)用 SPSSv13.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明兩種方法對氨基葡萄糖含量的測定結(jié)果沒有顯著性差異 (P>0.05)。

3 結(jié) 論

利用京尼平與氨基葡萄糖顯色測定氨基葡萄糖含量的最適波長為590 nm，在80 ℃和pH為8～11的條件下反應(yīng)2 h，氨基葡萄糖濃度在0.01～0.07 mg/mL范圍內(nèi)，反應(yīng)液的吸光值與氨基葡萄糖溶液的濃度的線性關(guān)系良好，該反應(yīng)顯色效果明顯并且產(chǎn)物顯色穩(wěn)定。該方法不僅與Elson-Mrogan法對氨基葡萄糖的測量具有較好的一致性，而且操作簡便，穩(wěn)定性好，可用于實(shí)驗(yàn)室的簡便測量。

[1] 薛繼楊,王雅萍,張瑤紓.Cu2+絡(luò)合物紫外法測定鹽酸氨基葡萄糖含量[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2013, 44(4):389-391.

[2] 陳金東,李蔚. 滴定分析法和分光光度法測定保健食品中D-氨基葡萄糖鹽酸鹽含量的研究[J].中國衛(wèi)生雜志，2002,12(2):143-144.

[3] 冉蘭,張榕,文霞. 比色法測定鹽酸氨基葡萄糖片的含量[J]. 華西藥學(xué)雜志,2001,16(3):217-218.[4] 鄭家概,王飛,農(nóng)云軍,等. 氨基葡萄糖鹽酸鹽含量的HPLC柱前衍生法測定[J].分析測試學(xué)報(bào)，2009,28(9):1081-1083.

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[6] 孫力軍. 桅子藍(lán)色素呈色機(jī)理的探討及二步法工藝的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院 學(xué)報(bào),1994,8(3):1-5.

[7] 陳亞. D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的分光光度法測定[J].化工職業(yè)技術(shù)教育, 2012(9):59-60.

Determination of Glucosamine Content Via Color Reaction of Geniposide

HESi-bei1,ZHANGHong-ping2

(1 No.2 High School of Shaoyang City, Hunan Shaoyang 422000; 2 Department of Chemistry,Shaoyang University, Hunan Shaoyang 422000, China)

A method for determination of glucosamine content was established via color reaction of geniposide and amino group. The effects of wavelength, reaction time, reaction temperature, acidity or alkalinity of solution, color stability of product and comparison with Elson-Mrogan method were investigated. The results showed that under the wavelength of 590 nm, pH 8～11, temperature of 80 ℃, reaction time of 2 h, the product had good color sability. Compared with Elson-Mrogan method, no significant differences were noted. This analysis method may be useful for simple measurement in lab.

geniposide;color; glucosamine; content

何思蓓(2000-)，女，高中在讀。

張紅萍(1973-)，女，教授，主要從事有機(jī)合成研究。

TS202. 3

A

1001-9677(2016)020-0103-03